本发明属于分子生物学基因工程技术领域，涉及一种水稻叶型的突变基因及其在水稻育种中的应用。
背景技术：
水稻(Orvza sativa L.)叶片是植物进行光合作用的主要营养器官，也是理想株型的重要组成部分。叶片厚、直、略细、微卷是水稻理想株型育种的基本要求。水稻叶片适当变窄，可以增加单株及群体的通透性，提高光合效率，最终有利于提高产量或改良品质。阐明水稻窄叶形成的分子机理，可以从遗传上控制水稻株型，为理想株型育种奠定基础。
通过人工诱变，已获得了多个水稻窄叶突变体，这些突变体主要表现为叶脉减少，叶片变细，但同时也常伴随其它复合性状变化，如叶片变短、叶片卷曲及植株矮化等。水稻窄叶多为单基因控制质量性状，迄今已报道了10余个窄叶突变基因(nal1～nal10，nrl1和nrl2等)，这些基因主要分布于水稻第1、3、4、11、12号染色体上，其中nal1、nal2/nal3、nal7、nal9、nrl1和nrl2已被成功克隆。NAL1基因位于水稻第4染色体，与qFLW4、LSCHL4和NAL5基因等位，编码与生长素极性运输有关的植物特异蛋白，通过细胞分裂调控叶片的横向生长和株高变化。NAL2与NAL3是旁系同源关系，二者分别位于水稻第11、12染色体，编码相同的OsWOX3A转录激活因子，OsWOX3A影响水稻多个器官的发育，如叶片的横轴生长和维管束形成，小穗的内外稃形态建成以及分蘖和侧根发育等。NAL7位于水稻第3染色体，与OsCOW1基因等位，编码一个YUCCA家族蛋白的含黄素单氧化酶，通过调节植株生长素的生物合成调控叶片发育[10,11]。NAL9也位于水稻第3染色体，与VYL和ClpP同源，VYL是拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶绿体Clp蛋白酶亚基ClpP6在水稻中的同源蛋白，能与Clp蛋白酶亚基OsClpP3和OsClpP4互作，在水稻叶绿体生物合成中起重要作用。nrl1和nrl2是水稻中两个非等位的窄卷叶突变基因。NRL1位于第12染色体，与nd1、sle1、ndl1和cd1基因等位，编码一个类纤维素合酶蛋白OsCSLD4，OsCSLD4在细胞壁的形成、叶的形态发生、营养及生殖器官的发育过程中均发挥着重要的作用。NRL2位于第3染色体，与srl2和avb基因等位，编码一个未知生化功能的植物特异蛋白，参与水稻次生细胞壁形成和苯丙氨酸代谢。
水稻叶片适度变窄有利于保持叶片直立、改善群体结构与透光性能，提高光能利用效率，通过窄叶及其它高光效基因的聚合来提高水稻有效光合速率，可以提高水稻产量和改善米质。因此，筛选和鉴定具有育种应用价值的窄叶基因是水稻育种的一项重要课题。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的情况，本发明的目的在于提供一种水稻叶型突变基因ZY103及其应用，为水稻叶型改良转基因研究提供有力的工具，进而促进高产优质水稻育种研究。
本发明从籼稻9311/豫粳6号籼粳杂交的F7代株系中获得水稻窄叶突变体zy103，与野生型亲本(豫粳6号和9311)相比，突变体从苗期开始表现叶片变窄微卷，株高降低，结实率下降，多数成熟种子弯曲变形等。经过研究将zy103的窄卷叶突变基因定位于水稻第12染色体195.4kb的区间内，此区间内Os12g36890.1基因与水稻叶片形态建成有关。序列分析发现，突变体zy103中Os12g36890.1基因的编码区第2外显子处(3472-3479)有8个核苷酸(TGTGCCAC)缺失，造成移码突变，导致原编码蛋白重要功能跨膜结构域丢失。经过功能验证表明zy103突变体的叶形变异是由Os12g36890.1基因突变导致的，确定Os12g36890.1是zy103的目的基因，具有控制水稻叶形的功能。
因此，本发明一方面提供水稻叶型突变基因ZY103，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供水稻叶型突变基因ZY103编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明为水稻窄叶形成的分子机理和水稻理想株型育种奠定了基础。水稻窄叶是水稻高产的重要理想株型。本发明的ZY103基因为水稻的分子育种提供了重要的基因资源。基于ZY103基因构建植物表达载体并转化优质背景的水稻细胞，再将转化的水稻细胞培育成窄叶植株，即可通过转基因实现窄叶等优良基因的快速聚合，从而快速地按理想培育高产优质的水稻品种。
因此，本发明还提供水稻叶型突变基因ZY103在水稻窄叶性状的分子育种中的应用。所述应用包括将ZY103基因转入目标水稻中，从而对其叶形进行定向分子调控。
附图说明
图1为野生型亲本YJ6、9311与突变体zy103及近等基因系zy1039311表型比较。其中(A)播种后14天的幼苗；(B)分蘖期植株叶片；(C)成熟期株高；(D)穗形和粒型；图片中材料顺序均从左到右依次为YJ6、9311、zy103和zy1039311。
图2为窄叶突变体zy103基因的分子定位及候选基因预测。(A)zy103基因被定位在12染色体195.4kb的DAN区间，标记的物理位置来源于Gramene网站(http://www.gramene.org/)检索到的数据(2016年10月)；(B)zy103的候选基因Os12g36890.1包括2个外显子和1个内含子，外显子上跨膜结构域(第1个跨膜结构域被内含子隔开)用黑色标出，中心结构域D_D_D_QxxRW位于第2外显子上，箭头所指的位置为zy103的突变位点；(C)Os12g36890.1编码区的DNA序列差异。
图3为水稻Os12g36890.1基因的PCR扩增结果。M:500bp DNA ladder marker；1～10为杂交组合zy103/9311的F2群体中正常宽叶单株；11～20为窄叶突变表型单株。
图4为9311和zy103中Os12g36890.1编码区核苷酸序列比对。
图5为9311和zy103中Os12g36890.1编码氨基酸序列比对。
图6为9311和zy103中Os12g36890.1编码蛋白结构域预测图。A、B分别为9311和zy103。
图7为pCAMBIA1300-Os12g36890.1重组表达载体结构示意图。
图8为9311、zy103和T0转基因植株叶片表型比较。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面实施例结合附图对本发明的技术方案和优点进行详细的描述。实施例中未具体说明的方法，为本领域常规方法，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中描述的，或按照产品说明书进行。实施例中所涉及到的试剂如无特殊说明均为本领域常规试剂。
实施例一突变体的表型特征及遗传分析
1.突变体的表型特征
本发明从籼稻品种9311与粳稻品种豫粳6号(YJ6)杂交F7代株系中获得窄叶突变体zy103，连续自交后，发现其窄叶性状能稳定遗传。将zy103与其野生型亲本9311多代回交和自交，从BC5F3中获得具有窄叶突变表型的9311近等基因系zy1039311。
突变体zy103及近等基因系zy1039311与野生型亲本YJ6、9311相比，主要突变性状表现为：从苗期开始叶片变窄且向内微卷(图1)，成熟期时，突变体的旗叶、倒二叶、倒三叶的叶宽均小于为野生型叶宽的1/2，倒三叶的突变表型更为严重；此外，突变体苗期根系发育不良，根长变短且根的数目减少(图1A)；成熟期株高明显降低(图1C)，主要是由于穗长、穗下茎、第Ⅰ-V茎节长度均不同程度缩短造成的；同时突变体还表现出主茎穗粒数减少，结实率降低，且籽粒大小和形状均发生明显变化，主要表现在籽粒小变细且多数成熟籽粒弯曲变形等(图1D)。
2.突变性状的遗传分析
表型分析发现，突变体zy103与9311杂交后，F1代植株叶宽正常且与9311相似，自交后F2群体中植株叶宽发生了宽窄性状分离。随机调查了F2群体中400个单株，正常叶宽植株和窄叶突变植株分别为306和94株，卡方分析表明(χ2＝0.48<χ20.05,1＝3.84,P＝0.49>0.05)，正常叶宽植株和窄叶突变植株的数目呈3:1比例，符合孟德尔遗传规律，推测此窄叶突变性状受1对隐性核基因控制。
实施例二突变基因的分子标记定位及候选基因分析
1.突变基因的分子标记定位
从zy103/9311杂交F2群体中分别选取窄卷叶突变型和正常表型单株各20株，混合构建突变型和野生型DNA池。从水稻12条染色体上选取了350个SSR标记，对亲本zy103、9311及F2代突变型和野生型DNA池进行BSA分析，结果发现位于第12染色体上SSR标记RM519和RM28448在亲本和两池间均表现出明显的多态性,且突变型池的带型与突变体zy103的带型一致。应用RM519和RM28448分析了zy103/9311的F2群体中的94个突变型单株的基因型。结果显示，标记RM519中93个单株的带型与突变体zy103一致，仅有1个单株发生了交换，而RM28448的所有突变表型单株带型都与突变体zy103一致，说明zy103突变基因与SSR标记RM519和RM28448紧密连锁。
次年，从zy103/9311的F2群体中选择标记RM519和RM28448的染色体区间呈杂合的正常表型单株,自交发展F3群体。共种植F3群体8500株，其中正常表型单株6412株，窄卷叶突变表型单株2088株，也呈孟德尔的3∶1理论分离比例(χ2＝0.86<χ20.05,1＝3.84,P＝0.35>0.05)，进一步证实此窄卷叶突变性状由一对隐性单基因控制。在连锁标记RM519和RM28448的染色体区域附近设计了32对STS标记和24对Indel标记，其中7对在亲本和基因池间存在多态性，应用上述多态性标记对2088株窄卷叶突变表型单株进行标记基因型检测和连锁分析，最终将突变基因zy103定位于STS标记zy-7和zy-21之间约195.4kb的染色体区段内(图2A)。
2.候选基因预测
利用水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu)，对zy103基因所在195.4kb区间序列进行候选基因分析，共预测了此染色体区间内28个编码基因，其中Os12g36890.1基因由2个外显子和1个内含子组成，编码一种类纤维素合酶(图2B)，对水稻叶形态发生和营养器官的发育起重要作用。根据Os12g36890.1的基因组序列，设计了测序引物，对野生型亲本豫粳6号、9311及突变体zy103中的Os12g36890.1的基因的CDS序列进行扩增并测序。测序结果表明在突变体中Os12g36890.1基因的编码区第2外显子处(3472-3479)有8个核苷酸(TGTGCCAC)缺失(图2C)。针对此缺失区域设计了一对缺失多态引物ZY103-1[正向：5’-GAGTTCCCGCAGTGGAGCAA-3’(SEQ ID NO.3)；反向：5’-GATCATGGAGATGAGGCCCG-3’(SEQ ID NO.4)]，利用这对引物对zy103/9311F2群体的400个单株进行基因型分析，结果所有窄叶突变表型单株的带型一致，均为142bp，而正常表型单株带型有两种，即9311带型(150bp)和杂合带型(150/142bp)，见图3。由此推测Os12g36890.1可能是zy103的候选基因。
实施例三突变基因ZY103的获得及分析
首先提取野生型9311和突变体zy103叶片中的总RNA，以总RNA为摸板，反转录合成第一链cDNA。水稻叶片RNA提取按TRIZol Reagent试剂说明，操作如下：
1)取水稻叶片50-100mg，放入用液氮已预冷的无RNase的研钵中，加入液氮
迅速研磨，研磨至粉末状迅速转移到预冷的2ml离心管中。
2)加入1ml Trizol，上下颠倒轻柔混合均匀，室温下放置5min。
3)加入Trizol 1/5体积的氯仿(即200μl)，剧烈震荡20s，冰上放置3min。4℃12,000×g离心15min。
4)将上层水相转移至另一1.5ml离心管，加入与水相等体积的异丙醇。将离心管上下颠倒轻柔混合均匀，室温静置15min。4℃12,000×g离心15min。
5)倒掉上清，加入1ml在冰上已预冷的75％乙醇至离心管中，洗涤提取的RNA，轻弹管壁使RNA沉淀悬浮。4℃7,500×g离心5min。
6)倒掉上清，将离心管放入通风橱中干燥10min。
7)加入50-100μl DEPC处理过的去离子水至离心管中，用枪头反复轻柔吹打至RNA完全溶解。
cDNA第一连的合成
利用试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，k1622)进行cDNA第一链的合成。按照说明，操作如下：
1)冰上，按以下比例加入各成分
RNA 1μg
Oligo(dT18)primer 1μl
RNase free H2o至12μl
短暂离心混匀，65℃5min，放至冰上终止反应，离心。
2)冰上，按以下比例加入各成分
5*reaction buffer 4μl
RibolockTM Ribonuclease inhabitor 1μl
dNTP mix 2μl
短暂离心混匀，37℃5min；加入
RevertAidTM M-MulvReverse Transcriptase 1μl
42℃60min。
3)70℃10min终止反应。冰上放置5min。-20℃存放
再以上述反转录合成的第一链cDNA为模板，利用引物对Os12g36890.1-F5'-TCTAGAATGTCGCGGCGGCTGTCGTTGCCG-3'(SEQ ID NO.5)和Os12g36890.1-R：5'-CCCGGGTGGGAAGCTGAATCCGCCGCCG-3'(SEQ ID NO.6)(下划线分别为限制性内切酶XbaI和SmaI的酶切位点]对目的基因Os12g36890.1基因的编码区进行PCR扩增，获得目的片段。将扩增好的目的DNA片段回收后连接到pGEM-T载体上，然后转入DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌落并送山东省农业科学院生物测序中心测序。序列分析后，分别获得9311和zy103全长CDS序列，其中9311含3645bp个核苷酸，编码1215个氨基酸，而zy103含3637bp个核苷酸(SEQ ID NO.1)，编码1212个氨基酸(SEQ ID NO.2)。
序列比对结果表明，突变体中Os12g36890.1突变基因ZY103的编码区第2外显子处(3472-3479)有8个核苷酸(TGTGCCAC)缺失(图4)，这8个核苷酸缺失造成了编码蛋白在第1158氨基酸处发生了移码突变(图5)，造成编码蛋白氨基酸序列发生变化。
应用InterPro软件(http://www.ebi.ac.uk/interpro)对目的蛋白的氨基酸序列进行蛋白结构分析，结果表明9311蛋白的氨基酸序列包含13个与跨模有关的区域，其中包括6个螺旋跨膜结构域(分别位于980～1002，1015-1034，1049-1071，1111-1133，1148-1170，1175-1197)和7个跨膜结构区(分别位于326-345，352-372，976-999，1011-1032，1111-1134，1146-1165，1177-1197)(图6A)，而突变体zy103蛋白的氨基酸序列仅包含8个与跨模有关的区域，其中包括3个螺旋跨膜结构域(分别位于980-1002，1015-1034，1111-1133)和5个跨膜结构区(分别位于326-345，352-372，976-999，1011-1032，1115-1138)(图6B)。与9311相比，突变体zy103蛋白的氨基酸序列中少了3个螺旋跨膜结构域和2个跨膜结构区。由此推测，因突变体zy103中Os12g36890.1基因中蛋白编码区缺失了8个核苷酸引发的移码突变，造成原编码蛋白的结构发生了巨大的变化，其蛋白结构的变化极有可能导致蛋白功能的变化。
实施例四突变基因ZY103的功能验证
1.表达载体构建
为了进一步验证ZY103的功能，构建了目的基因的功能互补表达载体，将野生型基因转化突变体zy103。首先将携带9311全长CDS序列的阳性克隆菌液扩摇并应用引物Os12g36890.1-F/Os12g36890.1-R进行PCR扩增，提取质粒，经限制性内切酶XbaI和SmaI双酶切后，回收目的片段；同时pCAMBIA1300载体也用XbaI和SmaI进行双酶切。将双酶切后的目的基因片段连接到经XbaI和SmaI双酶切的pCAMBIA1300载体上。将连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落。提取质粒后进行双酶切鉴定，以确定pCAMBIA1300-Os12g36890.1重组表达载体构建成功。构建好的重组表达载体如图7所示。
2.转基因水稻材料的获得
用电击法将构建好的pCAMBIA1300-Os12g36890.1重组表达载体转入农杆菌EHA105。突变体zy103成熟种子诱导愈伤，用农杆菌介导法进行转化。
具体操作如下：
1)选取饱满的水稻种子，去皮后用75％洒精消毒1分钟，0.15％HgCl2浸泡15mins，无菌水淸洗5-6次，充分晾干后转移到愈伤诱导培养基上，28℃暗培养7-10天，选取健康愈伤组织继代培养2-3次，获得成熟愈伤组织。
2)选取质地紧且干燥、生命力强的淡黄色愈伤颗粒，26±1℃避光条件下进行预培养4-5天。在预培养的第三天使用LA固体培养基接种携带有目的基因的农杆菌，28℃暗培养2天。
3)刮取适量菌落置于悬浮培养基中振荡培养，28℃震荡2-3小时，调节菌液浓度至OD600＝0.8-1.0，备用。
4)将表面干燥的经过预培养后的愈伤组织浸于悬浮培养液中30mins，期间不断摇匀。
5)充分晾干后转移至共培养培养基中，19-20℃避光条件下培养3天后先用无菌水充分清洗愈伤颗粒数次，以保证洗净愈伤表面的农杆菌残留，然后于400ppm羧苄青霉素(Cn)中浸泡30分钟，期间不断摇匀，充分晾干后转移至含有10mg/L草胺膦(Basta)和400ppm Cn的抗性筛选培养基中，28℃暗培养2-3周。
6)抗性筛选重复2-3次，逐级递减Cn浓度(即由400ppm到300ppm再到200ppm)。
7)3-4次抗性筛选后，选取长势良好、颜色亮黄、质地相对紧凑的愈伤组织接种到预分化培养基中暗培养5-7后转移至分化培养基，人工气候室中26℃光培养30-50天至分化出幼苗。幼苗长至3-4cm左右高时将其转移到生根培养基上并进行生根培养。
8)当苗长至8cm左右时打开瓶口封口膜，并加入无菌水进行炼苗3-4天，之后将幼苗从培养基中取出，洗净根部培养基移栽至水培液中，20天后苗健壮后再移栽入花盆中。
经过转化获得了58株T0代转基因水稻植株，通过PCR分子鉴定，43株为阳性单株，这些阳性单株的叶形都恢复正常，其表型与野生型基本一致(图8)。这说明zy103突变体的叶形变异是由于Os12g36890.1基因突变造成的，确定Os12g36890.1是zy103的目的基因，表明本发明突变基因ZY103具有控制水稻叶形的功能。
需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域的普通技术人员应当知晓，在不脱离本发明精神和范围内做出的任何形式上和细节上的改变，均落入本发明保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省水稻研究所
<120> 水稻叶型突变基因ZY103及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3637
<212> DNA
<213> Orvza sativa L.
<400> 1
atgtcgcggc ggctgtcgtt gccggcgggg gcgccggtga cggtggcggt gtcgccggtg 60
cggagcccgg ggggtgacgc ggtggtgagg agggggagcg ggctgacgtc ccccgtgccg 120
aggcactcgc tcgggtcgtc caccgccacg ctgcaggtgt cgccggtgag gcggagcggc 180
gggagtaggt acctcggcgc gtcgagggat ggcggcgccg atgagagcgc cgagttcgtg 240
cactacaccg tgcacatccc gcccacgccc gaccgggcga cggcgtccgt ggcgagcgag 300
gcggaggcgg cggcggaggc cgaggaggtg caccggccgc agcggagcta catctccggg 360
acgatattca ccggggggct caactgcgcc acgcgcggcc acgtgctcaa cttctccggc 420
gagggcggcg ccaccgccgc ctccagggcg gcggcgtcgg ggaacatgtc gtgcaagatg 480
cgcgggtgcg acatgcccgc gttcctcaac ggcggccgcc cgccgtgcga ctgcgggttc 540
atgatctgca aggagtgcta cgcggagtgc gccgcgggca actgccccgg ttgcaaggag 600
gccttctccg cgggctccga caccgacgaa tccgactccg tcaccgacga cgacgacgac 660
gaggccgtct cctcctccga ggagagggac cagctgccgc tgacatccat ggcgaggaaa 720
ttttccgtgg tgcactccat gaaggtcccc ggcgccgccg ccaacggcaa cggcaagccg 780
gccgagttcg accacgcccg ctggctcttc gagaccaagg gcacctatgg ctacggcaac 840
gctctctggc ccaaggacgg ccacgcccat agcggcgccg gcttcgtcgc cgccgacgag 900
ccccccaact tcggtgcccg ctgccgccgc cccctcacca gaaaaaccag cgtctcccaa 960
gccattctca gcccctacag gttgttgatt gcgattcggc tggtggcgct ggggttcttc 1020
ctcgcgtgga ggattcggca tccgaatccg gaggcggtgt ggctgtgggc gatgtcggtg 1080
gcgtgcgagg tgtggttcgc cttctcatgg ctgctcgaca gcctccccaa gctctgcccc 1140
gtccaccgcg ccgccgacct cgccgtcctc gccgagcggt tcgagtcgcc gacggcgcgc 1200
aaccccaagg gccgctccga cctccccggg atcgacgtgt tcgtcaccag cgccgacccg 1260
gagaaggagc cgccgctggt caccgccaac accatcctct ccatcctcgc cgcggactac 1320
cccgtcgaga agctcgcttg ctacctctcc gacgacggcg gcgcgctgct gtcgttcgag 1380
gcgctcgccg agacggccag cttcgcgcgc acgtgggtgc cattctgccg caagcacggc 1440
gtcgagccgc ggtgccccga ggcgtatttc ggccagaaga gggacttcct caagaacaag 1500
gtgcgcgtcg acttcgtccg cgagaggcgg aaggtgaagc gcgagtacga cgagttcaag 1560
gtgcgggtga actcgctccc cgaggcgatc cggcggcgct ccgacgcgta caacgccggc 1620
gaggaactgc gcgccaggag gcggcagcag gaggaggccg ccgccgcggc tgccgccggc 1680
aacggcgagc ttggagcggc ggcggtcgag accgccgccg tgaaggccac gtggatgtcg 1740
gacggctcgc actggccggg gacgtggacg tgccccgcgg cggaccacgc ccgcggcgac 1800
cacgccggga tcatccaggc gatgctggcg ccgccgacct cggagccggt gatgggaggc 1860
gaggcggcgg agtgcggcgg gctgatcgac accacgggcg tggacgtccg cctcccgatg 1920
ctggtgtacg tgtcgcggga gaagcgcccg ggctacgatc acaacaagaa ggccggcgcc 1980
atgaacgcgc tggtgcggac gagcgccatc atgtcgaacg ggcccttcat cctcaacctc 2040
gactgcgacc actacgtgca caactcgtcg gcgctccggg aggggatgtg cttcatgctc 2100
gaccgcggcg gcgaccgcgt gtgcttcgtc cagttcccgc agcggttcga gggcgtcgac 2160
cccagcgacc ggtacgccaa ccacaacctc gtcttcttcg acgtgtccat gcgcgccatg 2220
gacgggcttc agggccccat gtacgtcggc accggctgcg tcttccgccg caccgcgctg 2280
tacggcttca gcccgccccg cgccaccgag caccatggct ggctcggccg caggaagatc 2340
aagctgttcc tcaccaagaa gaagagcatg ggcaagaaga cggacagggc cgaggacgac 2400
accgagatga tgctgccgcc gatcgaggac gacgacggcg gcgccgacat tgaggcctcg 2460
gctatgctac cgaagcggtt cggcgggtcg gcgacgttcg tggcgtcgat acccgtggcg 2520
gagtaccagg gtcggctgct gcaggacacc cccgggtgcc accacggccg ccctgcgggc 2580
gcgctcgctg tgccgcgcga gccgctcgac gcggcgacgg tggcggaggc catcggcgtg 2640
atctcctgct tctacgagga gaagacggag tgggggcggc gcatcgggtg gatctacggc 2700
tccgtcaccg aggacgtggt caccggctac cggatgcaca accgcgggtg gcgctccgtc 2760
tactgcgtga cgccgcggcg cgacgcgttc cgcggcacgg cgccgatcaa cctcaccgac 2820
cgcctccacc aggtgctccg gtgggcgacg ggctccgtcg agatcttctt ctcccgcaac 2880
aacgccctct tcgcctcgcc gcggatgaag ctgctgcagc gcgtcgccta cttcaacgcc 2940
gggatgtacc ccttcacctc cgtgttcctc ctcgcctact gcctcctccc ggccgtctcc 3000
ctcttctccg gcaagttcat cgtgcagcga ctcagcgcca ccttcctcgc cttcctcctc 3060
gtcatcaccc tcaccctctg cctcctcgcc ctgctcgaga tcaagtggtc cgggatcacg 3120
ctccacgagt ggtggcgcaa cgagcagttc tgggtgatcg gcggcaccag cgcgcacccg 3180
gccgccgtgc tgcagggcct actcaaggtg atcgccggcg tggacatctc cttcacgctg 3240
acctccaagc cggggaacgg cggcggcgat ggcggggtcg gcggcgaggg gaacgacgac 3300
gaggcgttcg cggagctgta cgaggtgagg tggagctacc tgatggtgcc gccggtgacg 3360
atcatgatgg tgaacgcggt ggcgatcgcg gtggcggcgg cgaggacgct gtacagcgag 3420
ttcccgcagt ggagcaagct gctcggcggc gccttcttca gcttctgggt gcctctaccc 3480
gttcgccaag ggcctcctcg gccgccgcgg ccgcgtgccc accatcgtct tcgtctggtc 3540
gggcctcatc tccatgatca tctccctcct ctgggtctac atcaacccgc ccgccggcgc 3600
ccgggagcgc atcggcggcg gcggattcag cttccca 3637
<210> 2
<211> 1212
<212> PRT
<213> Orvza sativa L.
<400> 2
Met Ser Arg Arg Leu Ser Leu Pro Ala Gly Ala Pro Val Thr Val Ala
1 5 10 15
Val Ser Pro Val Arg Ser Pro Gly Gly Asp Ala Val Val Arg Arg Gly
20 25 30
Ser Gly Leu Thr Ser Pro Val Pro Arg His Ser Leu Gly Ser Ser Thr
35 40 45
Ala Thr Leu Gln Val Ser Pro Val Arg Arg Ser Gly Gly Ser Arg Tyr
50 55 60
Leu Gly Ala Ser Arg Asp Gly Gly Ala Asp Glu Ser Ala Glu Phe Val
65 70 75 80
His Tyr Thr Val His Ile Pro Pro Thr Pro Asp Arg Ala Thr Ala Ser
85 90 95
Val Ala Ser Glu Ala Glu Ala Ala Ala Glu Ala Glu Glu Val His Arg
100 105 110
Pro Gln Arg Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Ile Phe Thr Gly Gly Leu Asn
115 120 125
Cys Ala Thr Arg Gly His Val Leu Asn Phe Ser Gly Glu Gly Gly Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Ser Arg Ala Ala Ala Ser Gly Asn Met Ser Cys Lys Met
145 150 155 160
Arg Gly Cys Asp Met Pro Ala Phe Leu Asn Gly Gly Arg Pro Pro Cys
165 170 175
Asp Cys Gly Phe Met Ile Cys Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Cys Ala Ala
180 185 190
Gly Asn Cys Pro Gly Cys Lys Glu Ala Phe Ser Ala Gly Ser Asp Thr
195 200 205
Asp Glu Ser Asp Ser Val Thr Asp Asp Asp Asp Asp Glu Ala Val Ser
210 215 220
Ser Ser Glu Glu Arg Asp Gln Leu Pro Leu Thr Ser Met Ala Arg Lys
225 230 235 240
Phe Ser Val Val His Ser Met Lys Val Pro Gly Ala Ala Ala Asn Gly
245 250 255
Asn Gly Lys Pro Ala Glu Phe Asp His Ala Arg Trp Leu Phe Glu Thr
260 265 270
Lys Gly Thr Tyr Gly Tyr Gly Asn Ala Leu Trp Pro Lys Asp Gly His
275 280 285
Ala His Ser Gly Ala Gly Phe Val Ala Ala Asp Glu Pro Pro Asn Phe
290 295 300
Gly Ala Arg Cys Arg Arg Pro Leu Thr Arg Lys Thr Ser Val Ser Gln
305 310 315 320
Ala Ile Leu Ser Pro Tyr Arg Leu Leu Ile Ala Ile Arg Leu Val Ala
325 330 335
Leu Gly Phe Phe Leu Ala Trp Arg Ile Arg His Pro Asn Pro Glu Ala
340 345 350
Val Trp Leu Trp Ala Met Ser Val Ala Cys Glu Val Trp Phe Ala Phe
355 360 365
Ser Trp Leu Leu Asp Ser Leu Pro Lys Leu Cys Pro Val His Arg Ala
370 375 380
Ala Asp Leu Ala Val Leu Ala Glu Arg Phe Glu Ser Pro Thr Ala Arg
385 390 395 400
Asn Pro Lys Gly Arg Ser Asp Leu Pro Gly Ile Asp Val Phe Val Thr
405 410 415
Ser Ala Asp Pro Glu Lys Glu Pro Pro Leu Val Thr Ala Asn Thr Ile
420 425 430
Leu Ser Ile Leu Ala Ala Asp Tyr Pro Val Glu Lys Leu Ala Cys Tyr
435 440 445
Leu Ser Asp Asp Gly Gly Ala Leu Leu Ser Phe Glu Ala Leu Ala Glu
450 455 460
Thr Ala Ser Phe Ala Arg Thr Trp Val Pro Phe Cys Arg Lys His Gly
465 470 475 480
Val Glu Pro Arg Cys Pro Glu Ala Tyr Phe Gly Gln Lys Arg Asp Phe
485 490 495
Leu Lys Asn Lys Val Arg Val Asp Phe Val Arg Glu Arg Arg Lys Val
500 505 510
Lys Arg Glu Tyr Asp Glu Phe Lys Val Arg Val Asn Ser Leu Pro Glu
515 520 525
Ala Ile Arg Arg Arg Ser Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Glu Glu Leu Arg
530 535 540
Ala Arg Arg Arg Gln Gln Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
545 550 555 560
Asn Gly Glu Leu Gly Ala Ala Ala Val Glu Thr Ala Ala Val Lys Ala
565 570 575
Thr Trp Met Ser Asp Gly Ser His Trp Pro Gly Thr Trp Thr Cys Pro
580 585 590
Ala Ala Asp His Ala Arg Gly Asp His Ala Gly Ile Ile Gln Ala Met
595 600 605
Leu Ala Pro Pro Thr Ser Glu Pro Val Met Gly Gly Glu Ala Ala Glu
610 615 620
Cys Gly Gly Leu Ile Asp Thr Thr Gly Val Asp Val Arg Leu Pro Met
625 630 635 640
Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro Gly Tyr Asp His Asn Lys
645 650 655
Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Val Arg Thr Ser Ala Ile Met Ser
660 665 670
Asn Gly Pro Phe Ile Leu Asn Leu Asp Cys Asp His Tyr Val His Asn
675 680 685
Ser Ser Ala Leu Arg Glu Gly Met Cys Phe Met Leu Asp Arg Gly Gly
690 695 700
Asp Arg Val Cys Phe Val Gln Phe Pro Gln Arg Phe Glu Gly Val Asp
705 710 715 720
Pro Ser Asp Arg Tyr Ala Asn His Asn Leu Val Phe Phe Asp Val Ser
725 730 735
Met Arg Ala Met Asp Gly Leu Gln Gly Pro Met Tyr Val Gly Thr Gly
740 745 750
Cys Val Phe Arg Arg Thr Ala Leu Tyr Gly Phe Ser Pro Pro Arg Ala
755 760 765
Thr Glu His His Gly Trp Leu Gly Arg Arg Lys Ile Lys Leu Phe Leu
770 775 780
Thr Lys Lys Lys Ser Met Gly Lys Lys Thr Asp Arg Ala Glu Asp Asp
785 790 795 800
Thr Glu Met Met Leu Pro Pro Ile Glu Asp Asp Asp Gly Gly Ala Asp
805 810 815
Ile Glu Ala Ser Ala Met Leu Pro Lys Arg Phe Gly Gly Ser Ala Thr
820 825 830
Phe Val Ala Ser Ile Pro Val Ala Glu Tyr Gln Gly Arg Leu Leu Gln
835 840 845
Asp Thr Pro Gly Cys His His Gly Arg Pro Ala Gly Ala Leu Ala Val
850 855 860
Pro Arg Glu Pro Leu Asp Ala Ala Thr Val Ala Glu Ala Ile Gly Val
865 870 875 880
Ile Ser Cys Phe Tyr Glu Glu Lys Thr Glu Trp Gly Arg Arg Ile Gly
885 890 895
Trp Ile Tyr Gly Ser Val Thr Glu Asp Val Val Thr Gly Tyr Arg Met
900 905 910
His Asn Arg Gly Trp Arg Ser Val Tyr Cys Val Thr Pro Arg Arg Asp
915 920 925
Ala Phe Arg Gly Thr Ala Pro Ile Asn Leu Thr Asp Arg Leu His Gln
930 935 940
Val Leu Arg Trp Ala Thr Gly Ser Val Glu Ile Phe Phe Ser Arg Asn
945 950 955 960
Asn Ala Leu Phe Ala Ser Pro Arg Met Lys Leu Leu Gln Arg Val Ala
965 970 975
Tyr Phe Asn Ala Gly Met Tyr Pro Phe Thr Ser Val Phe Leu Leu Ala
980 985 990
Tyr Cys Leu Leu Pro Ala Val Ser Leu Phe Ser Gly Lys Phe Ile Val
995 1000 1005
Gln Arg Leu Ser Ala Thr Phe Leu Ala Phe Leu Leu Val Ile Thr
1010 1015 1020
Leu Thr Leu Cys Leu Leu Ala Leu Leu Glu Ile Lys Trp Ser Gly
1025 1030 1035
Ile Thr Leu His Glu Trp Trp Arg Asn Glu Gln Phe Trp Val Ile
1040 1045 1050
Gly Gly Thr Ser Ala His Pro Ala Ala Val Leu Gln Gly Leu Leu
1055 1060 1065
Lys Val Ile Ala Gly Val Asp Ile Ser Phe Thr Leu Thr Ser Lys
1070 1075 1080
Pro Gly Asn Gly Gly Gly Asp Gly Gly Val Gly Gly Glu Gly Asn
1085 1090 1095
Asp Asp Glu Ala Phe Ala Glu Leu Tyr Glu Val Arg Trp Ser Tyr
1100 1105 1110
Leu Met Val Pro Pro Val Thr Ile Met Met Val Asn Ala Val Ala
1115 1120 1125
Ile Ala Val Ala Ala Ala Arg Thr Leu Tyr Ser Glu Phe Pro Gln
1130 1135 1140
Trp Ser Lys Leu Leu Gly Gly Ala Phe Phe Ser Phe Trp Val Pro
1145 1150 1155
Leu Pro Val Arg Gln Gly Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Arg Ala
1160 1165 1170
His His Arg Leu Arg Leu Val Gly Pro His Leu His Asp His Leu
1175 1180 1185
Pro Pro Leu Gly Leu His Gln Pro Ala Arg Arg Arg Pro Gly Ala
1190 1195 1200
His Arg Arg Arg Arg Ile Gln Leu Pro
1205 1210
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagttcccgc agtggagcaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatcatggag atgaggcccg 20
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctagaatgt cgcggcggct gtcgttgccg 30
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccgggtggg aagctgaatc cgccgccg 28