专利名称：一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa2杂交后代基因型的引物及方法
技术领域：
本发明属于农业生物工程技术领域，尤其涉及一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa2杂交后代基因型的引物及方法。
背景技术：
植酸是植物种子中磷主要的贮存形式，约占种子全磷量的65-85%左右。植酸通常与Zn2+、Ca2+、Fe3+等金属阳离子螯合成植酸盐，并与蛋白进一步形成球状复合体，沉积在禾本科作物籽粒的糊粉层中。由于人和非反刍动物(猪、鸡、鱼等)体内不含植酸酶，难以消化利用摄入的植酸，极大降低了磷元素的生物有效性，同时植酸还影响微量元素、蛋白和淀粉的生物有效性，是一种典型的抗营养因子。此外，一方面难以被利用的植酸随动物粪便排 泄到环境中，引起水体富营养化，造成严重的环境污染；另一方面为了满足动物生长发育的需要，饲料中还需额外添加有机磷或骨粉等，提高了饲养成本。许多学者提出可用植酸酶降解植酸析出有效磷供动物利用；也可将植酸酶基因转入植物，使植酸酶在种子中得到表达，从而提高饲料中植酸磷的利用率。因此，降低作物籽粒中植酸的含量日益成为育种学家、营养学家和环境学家关注的焦点。运用理化诱变和基因工程技术，创制种子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可从源头上解决上述问题。迄今，国内外已从水稻、大豆、玉米、大麦、小麦等作物中获得了一批LPA突变体，培育出了一些LPA作物新品种。大量的动物体内试验表明，LPA作物极大地提高了磷的生物有效性，减少了环境中的磷污染，有效改善了动物体内微量营养元素缺乏症。但目前获得LPA突变系的主要途径是理化诱变和自然筛选，并且只能收获作物成熟种子后才能通过微量测定方法检测个体种子无机磷含量，初步筛选高无机磷品系，然后根据材料表型及实验条件进一步通过铁沉淀等方法测定植酸磷和全磷含量，选育周期较长，成本高，且效率低。随着现代分子生物学理论和技术的快速发展，利用正向(图位克隆)或反向遗传学(RNAi，T-DNA插入突变)技术，已报道克隆了若干LPA基因(MIPS，MIK, MRP，2_PGK，IPK1)，不仅揭示了 LPA突变发生的分子机制，也为基于LPA相关基因核苷酸变异的引物在LPA作物新品种的选育方面奠定了理论基础。如文献(Kim, S. I.，Andaya, C. B.，Newman,J. W.，Goyal, S. S.，and Tai，T. H. 2008. Isolation and characterization of a lowphytic acid rice mutant reveals a mutation in the rice orthologue of maize MIK.Theoretical and Applied Genetics 117(8) :1291-1301.)公开的水稻材料 N15-186 中植酸含量下降则是由MIK基因的等位突变导致的(Shi，J. R.，Wang, H. Y.，Hazebroek, J.，Ertl，D.S.，and Harp，T.2005. The maize low-phytic acid 3encodes a myo-inositolkinase that plays a role in phytic acid biosynthesis in developing seeds. ThePlant Journal 42(5) :708-719 7 )，这为利用分子生物学技术选育LPA水稻新品种提供了一个新的方向。
水稻是我国及世界上最主要的粮食作物。作为稻米生产和消费的大国，我国也是铁缺乏和缺铁性贫血等微量元素缺乏症发生较严重的国家之一，而降低水稻植酸含量可显著提高Fe3+、Zn2+等微量元素的生物有效性。因此，若能获得与目的基因共分离的分子标记，有效快速鉴定含有目的基因的低植酸水稻材料，培育具有营养与环保双重功能的LPA水稻在我国就有重要的经济和社会意义。
发明内容
本发明提供了一种引物，利用该引物可以方便地在苗期对水稻低植酸突变体zju-lpa2杂交后代的基因型进行鉴定。一种引物，为引物ZHJ1、引物ZHJ2或它们的组合；其中，引物ZHJl的碱基序列为正向引物序列5’-TCCTTTAGTCTAGGACCGTTGG-3’ ；反向引物序列5’-AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’ 和 5，-ACCAGGGATGCCGTTGAG-3，；引物ZHJ2的碱基序列为正向引物序列5’-AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’和5， -ACCAGGGATGCCGTTGAG-3，；反向引物序列5’-AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’。突变体z ju_lpa2低植酸含量性状受MIK等位突变基因ZJU-LPA2控制，它在序列L0C_0s03g52760的内含子上插入了一个6. 2kb的反转座子。据此，在TIGR V7. O网站(http //rice, plantbiology. msu. edu/)下载相应的核苷酸序列，并对序列进行比对分析，利用Primer Premier 5. O软件在水稻低植酸基因ZJU-LPA2中的6. 2kb插入片段区域附近设计相应的引物ZHJl和ZHJ2，该引物的一条正向引物和反向引物是根据基因MIK的保守区域设计，而另一条正向引物或反向引物是根据基因ZJU-LPA2中插入的反转座子序列设计，因此引物具有较好的通用性和特异性。本发明还提供了一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa2杂交后代基因型的方法，包括(I)提取水稻样品苗期叶片总DNA ；(2)以所述总DNA为模板，利用权利要求I所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离，染色后拍照成像；(3)根据成像结果，判断水稻样品的基因型；当利用引物ZHJl进行PCR扩增，如果只出现350bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果只出现498bp特征带，则该水稻样品为不含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果同时出现350bp和498bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的杂合型材料；当利用引物ZHJ2进行PCR扩增，如果只出现754bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果只出现498bp特征带，则该水稻样品为不含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果同时出现754bp和498bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的杂合型材料；当利用引物ZHJl和引物ZHJ2进行PCR扩增，如果只出现350bp和754bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果只出现498bp特征带，则该水稻样品为不含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果同时出现350bp、754bp和498bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的杂合型材料；所述的低植酸基因ZJU-LPA2的碱基序列如SEQ ID NO. I所示。所述的水稻低植酸突变体zju_lpa2的制备已在文献(Liu, Q. L. , Xu, X. H. , Ren,X. L. , Fu, H. ff. , ffu, D. X. , and Shu, Q. Y. 2007. Generation and characterization of lowphytic acid germplasm in rice(Oryza sativa L. ). Theoretical and Applied Genetics114(5) :803-814-)中公开，它是指控制水稻植酸含量的MIK基因突变为ZJU-LPA2基因而产生的LPA突变体；所述水稻突变体z ju-lpa2杂交后代是指亲本为水稻突变体z ju_lpa2和MIK基因未突变的水稻品种的杂交后代。相比LPA突变基因ZJU-LPA2，所述MIK基因未突变的水稻品种是指正常植酸含量的水稻品种，如嘉禾218、日本晴、9311等。常用的植物总DNA提取方法为CTAB法。
植物的次生代谢物对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎。植物材料最好是新鲜的。所述PCR扩增的反应体系为20 μ L，其中，2XPCR Master Mix缓冲液10 μ L(含I. 5mM Mg2+，200 μ M dNTPUU Taq 酶)、10 μ M 正反向引物各 O. 4 μ L、总 DNA I μ L、灭菌去离子水补至20 μ L0所述PCR扩增的反应程序为94°C预变性4min ;94°C变性30s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，35个循环；最后72°C延伸7min。与现有技术相比较，本发明有益效果为I、本发明所获得的引物是依据zju_lpa2突变体与正常水稻品种在核苷酸序列上的差异设计合成的，因此不存在遗传上的交换，也不需要表型的进一步验证。2、利用本发明获得的两套引物可以对大量zju-lpa2杂交后代群体进行筛选，从而准确高效鉴定出含水稻低植酸基因ZJU-LPA2的LPA水稻材料。3、通常LPA水稻材料的鉴定必须等到水稻种子成熟以后才能进行，而利用和水稻低植酸基因ZJU-LPA2共分离的引物可在苗期对其叶片进行检测，可以大大提高LPA水稻品种的选择效率，加快LPA水稻育种进程。
图I为用于低植酸突变基因ZJU-LPA2检测的PCR引物设计策略，其中黑色方框代表基因编码区，白色方框代表UTR，虚线代表内含子，双箭头代表低植酸突变体zju-lpa2中6. 2kb的DNA片段插入，单箭头代表引物位置。图2为ZHJl引物对zju_lpa2X嘉禾218F2代单株的选择效果。其中M为DNA分子量标准；1泳道为嘉禾218 ；2泳道为zju-lpa2 ;3_7泳道为不含ZJU-LPA2基因纯合型的正常植酸含量单株；8-12泳道为ZJU-LPA2基因杂合型的正常植酸含量单株；13-17泳道为ZJU-LPA2基因纯合型的低植酸单株。图3为ZHJ2引物对zju_lpa2X嘉禾218F2代单株的选择效果。其中M为DNA分子量标准；1泳道为嘉禾218 ；2泳道为zju-lpa2 ;3_7泳道为不含ZJU-LPA2基因纯合型的正常植酸含量单株；8-12泳道为ZJU-LPA2基因杂合型的正常植酸含量单株；13-17泳道为ZJU-LPA2基因纯合型的低植酸单株。图4为ZHJ2引物在不同水稻品种材料中的PCR扩增结果。其中MDNA分子量标准；I泳道为嘉禾218 ;2泳道为zju-lpa2 ;3为日本晴；4为9311 ;5为秀水110 ;6为明恢86 ；7为中9B。
具体实施例方式一、引物设计水稻低植酸突变体zju_lpa2由137Cs-Y射线诱变处理粳稻品种XSllO获得，植酸含量下降64%，无机磷含量升高5. 6倍，遗传分析和基因定位表明，水稻低植酸突变体zju-lpa2植酸含量由单隐性核基因控制，定位在水稻第3号染色体的短臂上(Liu, Q. L. , Xu, X. H. , Ren, X. L. , Fu, H. ff. , ffu, D. X. , and Shu, Q. Y. 2007. Generationand characterization of low phytic acid germplasm in rice (Oryza sativaL. ). Theoretical and Applied Genetics 114(5) :803-814.)。进一步的研究结果表明zju-lpa2低植酸含量性状受MIK等位突变基因ZJU-LPA2控制，在内含子上插入了一个6. 2kb 的反转座子，在 TIGRV7. O (http:"rice, plantbiology. msu. edu/)下载相应的核苷酸序列，并对序列进行比对分析。利用Primer Premier 5. O (www. premierbiosoft. com)软件在水稻低植酸基因ZJU-LPA2中的6. 2kb插入片段区域附近设计相应的引物，并将新合成的引物命名为ZHJl和ZHJ2(图I)，两个引物的序列见表I。表I. ZJU-LPA2基因引物开发
权利要求
1.一种引物，其特征在于，为引物ZHJ1、引物ZHJ2或它们的组合；其中，引物ZHJl的碱基序列为 正向引物序列5’ -TCCTTTAGTCTAGGACCGITGG-3’ ； 反向引物序列5’ -AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’和 5’ -ACCAGGGATGCCGTTGAG-3’ ； 引物ZHJ2的碱基序列为 正向引物序列5’ -AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’和 5’ -ACCAGGGATGCCGTTGAG-3’ ； 反向引物序列5’ -AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’。
2.一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa2杂交后代基因型的方法，包括 (1)提取水稻样品苗期叶片总DNA； (2)以所述总DNA为模板，利用权利要求I所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离，染色后拍照成像； (3)根据成像结果，判断水稻样品的基因型； 当利用引物ZHJl进行PCR扩增，如果只出现350bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果只出现498bp特征带，则该水稻样品为不含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果同时出现350bp和498bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的杂合型材料； 当利用引物ZHJ2进行PCR扩增，如果只出现754bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果只出现498bp特征带，则该水稻样品为不含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果同时出现754bp和498bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的杂合型材料； 当利用引物ZHJl和引物ZHJ2进行PCR扩增，如果只出现350bp和754bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果只出现498bp特征带，则该水稻样品为不含低植酸基因ZJU-LPA2的纯合型材料，如果同时出现350bp、754bp和498bp特征带，则该水稻样品为含低植酸基因ZJU-LPA2的杂合型材料； 所述的低植酸基因ZJU-LPA2的碱基序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用CTAB法提取总DNA。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为20iiL，其中，2X PCR Master Mix缓冲液10 y L、10 y M正反向引物各0. 4 y L、总DNAl y L、无菌水补足至20 u L0
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为94°C预变性4min ;94°C变性 30s, 57°C退火 45s, 72°C延伸 lmin, 35 个循环；最后 72°C延伸 7min。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa2杂交后代基因型的引物及方法，所述引物为引物ZHJ1、引物ZHJ2或它们的组合，所述方法包括(1)提取水稻样品苗期叶片总DNA；(2)以所述总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离，染色后成像；(3)根据电泳结果，判断水稻样品的基因型。本发明利用和水稻低植酸基因ZJU-LPA2共分离的引物可在苗期对其叶片进行检测，可以大大提高LPA水稻品种的选择效率，加快LPA水稻育种进程。
文档编号C12N15/11GK102808029SQ20121029752
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者舒庆尧, 赵海军, 徐秀红 申请人:浙江大学