专利名称：一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代基因型的引物及方法
技术领域：
本发明属于农业生物工程技术领域，尤其涉及一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代基因型的引物及方法。
背景技术：
植酸，即肌醇-六磷酸，是禾谷类种子中含磷最丰富的化合物，占到种子干重的I %以上，占种子全磷量的75. O ± 10 %。植酸通常与Zn2+、Ca2+、Fe3+等金属阳离子 螯合成植酸盐，并与蛋白进ー步形成球状复合体，沉积在禾本科作物籽粒的糊粉层中。由于人和非反刍动物(猪、鸡、鱼等)体内不含植酸酶，食物中的植酸难以被消化利用，即降低了磷元素的有效吸收，也影响微量元素、蛋白质和淀粉的生物有效性。因此，植酸是ー种典型的抗营养因子。此外，植酸随动物粪便排泄到环境中，极易引起水体富营养化，造成严重的环境污染，特别是在饲养业发达的国家尤为严重；另ー方面为了满足动物生长发育的需要，饲料中往往要额外添加有机磷或骨粉等，提高了饲养成本。因此，降低作物种子中植酸的含量日益成为育种学家、营养学家和环境学家关注的焦点。运用理化诱变和基因工程技木，创制种子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可从源头上解决上述问题。迄今，国内外学者已从水稻、大豆、玉米、大麦、小麦等作物中获得了ー批LPA突变体，培育出了ー些LPA作物新品种，如在大麦中已育成和推广了 2个LPA新品种‘Herald’和‘Clearwater’。临床和动物饲养实验证实,人对食物中的Zn2+的吸收与LPA玉米籽粒中植酸盐下降的程度成正比；LPA大麦或玉米作为饲料，不但Fe3+和Zn2+的有效性增加，而且可以提高大麦和玉米用做饲料时动物对磷的利用，从而减少动物粪便造成的磷污染。目前获得LPA突变系的主要途径是理化诱变和自然筛选，并且只能收获作物成熟种子后才能通过微量測定方法检测个体种子无机磷含量，初步筛选高无机磷品系，然后根据材料表型及实验条件进ー步通过铁沉淀等方法测定植酸磷和全磷含量，选育周期较长，成本高，且效率低。随着现代分子生物学理论和技术的快速发展，利用正向(图位克隆)或反向遗传学(RNAi，T-DNA插入突变)技术，已报道克隆了若干LPA基因(MIPS，MIK, MRP，2_PGK，IPK1)，不仅掲示了 LPA突变发生的分子机制，也为基于LPA相关基因核苷酸变异的引物在LPA作物新品种的选育方面奠定了理论基础。因此，充分利用已有的LPA基因资源选育LPA水稻新品种是今后水稻功能性成份育种的ー个重要组成部分。水稻是我国及世界上三大粮食作物之一。作为稻米生产和消费的大国，我国也是铁缺乏和缺铁性贫血等微量元素缺乏症发生较严重的国家之一，而降低水稻植酸含量可显著提高Fe3+、Zn2+等微量元素的生物有效性。因此，若能获得与目的基因共分离的基因功能性引物，有效快速鉴定含有目的基因的LPA水稻种质资源，培育具有营养与环保双重功能的LPA水稻在我国就有重要的经济和社会意义。
发明内容
本发明提供了ー种引物，利用该引物可以方便地鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代的基因型。ー种引物，正向引物为ZW3F和ZW4F，反向引物为ZW3R ；ZW3F:5’ -AATTAACGGCTTGTAAAACGTG-3’ZW4F:5，-GGTTCCCACTCGGTATGCG-3，；ZW3R 5，-ACGATGGTTGTTTGGGTCTTG-3，。水稻低植酸突变体zju_lpa3低植酸含量性状受2_PGK(L0C 0s02g57400)等位突变基因ZJU-LPA3控制，基因组外显子和内含子上缺失了ー个1475bp大片段。据此，在TIGRV7. O网站(http://rice.plantbiology.msu. edu/)下载对应的核苷酸序列，并对序列进行·比对分析，利用Primer Premier 5. O软件在水稻低植酸基因ZJU-LPA3突变体缺失片段区域附近设计相应的弓I物ZHJ3，引物ZHJ3的反向引物和一个正向引物根据基因2-PGK的保守区域设计，另外一个正向引物是根据基因ZJU-LPA3缺失片段区域设计，具有较好的通用性和特异性。本发明还提供了一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代基因型的方法，包括如下步骤(I)提取水稻样品苗期叶片的总DNA ；(2)以所述总DNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离、染色后拍照成像；(3)根据成像结果，判断水稻样品的基因型；若只出现390bp特征帯，则该水稻样品为不含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的纯合型材料；若只出现746bp特征带，则该水稻样品为含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的纯合型材料；若同时出现390和746bp特征带，则该水稻样品为含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的杂合型材料；所述水稻低植酸基因ZJU-LPA3的碱基序列如SEQ ID NO. I所示。所述水稻低植酸突变体zju_lpa3的制备已在文献(Liu, Q. L.，Xu, X. H.，Ren,X. L. , Fu, H. ff. , ffu, D. X. , and Shu, Q. Y. 2007. Generation and characterization of lowphytic acid germplasm in rice(Oryza sativa L. ). Theoretical and Applied Genetics114(5) :803-814)中公开，它是指2-PGK基因的核苷酸序列突变成与基因ZJU-LPA3的核苷酸序列相同。而所述水稻低植酸突变体zju-lpa3的杂交后代指水稻低植酸突变体zju-lpa3与2-PGK基因未突变的水稻品种杂交培育的后代，所述2-PGK基因未突变的水稻品种可以是嘉禾218、日本睛、9311、嘉兴08-1等。常用的植物总DNA提取方法为CTAB法。植物的次生代谢物对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎。植物材料最好是新鮮的。所述PCR扩增的反应体系为20 μ L，其中，2 XPCR Master Mix缓冲液10 μ L(含
I.5mM Mg2\200yM dNTPUU Taq 酶)、10 μ M 正反向引物各 O. 4 μ L、总 DNAl μ L、灭菌去离子水补至20 μ L0
所述PCR扩增的反应程序为94°C预变性4min ;94°C变性30s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，35个循环；最后72°C延伸7min。对于琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度通常在O. 5 2. 0%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段核酸的电泳。本发明中采用的凝胶浓度为1.0%。因所述的390bp和746bp片段大小差异较大，I. 0%的凝胶浓度已足够将二者分开，同时也节省了材料。与现有技术相比较，本发明有益效果为I、本发明所获得的引物是依据zju_lpa3突变体与正常水稻品种在核苷酸序列上的差异设计合成的，因此不存在遗传上的交換，也不需要表型的进ー步验证。2、利用本发明获得的引物可以对大量zju-lpa3杂交后代群体进行筛选，从而准确高效鉴定出含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的LPA水稻材料。 3、通常LPA水稻材料的鉴定必须等到水稻种子成熟以后才能进行，而利用和水稻低植酸基因ZJU-LPA3共分离的引物可在苗期对其叶片进行检测，可大大提高LPA水稻品种的选择效率，加快LPA水稻育种进程。
图I为用于水稻低植酸基因ZJU-LPA3检测的PCR引物设计策略，其中黑色方框代表蛋白编码区，白色方框代表UTR，折线代表内含子，箭头代表引物位置。图2为引物ZHJ3对嘉兴08-lXzju-lpa3F2代单株的选择效果。其中M为DNA分子量标准；1泳道为嘉兴08-1 ；2泳道为zju-lpa3 ；3泳道为嘉兴OS-IXzju-IpaSF1代；4、
6、7、14、18泳道为不含ZJU-LPA3基因纯合型的正常植酸含量单株；5、8、9、10、11、13、15泳道为ZJU-LPA3基因杂合型的正常植酸含量单株；12、16、17泳道为ZJU-LPA3基因纯合型的低植酸单株。图3为引物ZHJ3在不同水稻品种中的PCR扩增結果。其中M为DNA分子量标准；
I泳道为嘉兴08-1 ；2泳道为日本睛；3泳道为9311 ；4泳道为嘉禾218 ；5泳道为秀水110。
具体实施例方式一、引物设计水稻低植酸突变体zju_lpa3由6ciCo- Y射线诱变处理籼稻品种协青早B获得，植酸含量下降46%，无机磷含量升高6. 4倍(Liu, Q. L.，Xu, X. H.，Ren, X. L.，Fu, H. ff.，Wu, D. X.，and Shu, Q. Y. 2007. Generation and characterization of low phytic acidgermplasm in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 114(5)803-814)，遗传分析和基因定位表明，水稻低植酸突变体zju-lpa3植酸含量由单隐性核基因控制，定位在水稻第2号染色体的长臂上，进ー步的研究结果表明z ju_lpa3低植酸含量性状受2-PGK等位突变基因ZJU-LPA3控制，在基因组序列上缺失了ー个1475bp的大片段，在TIGR V7. O (http://rice. plantbiology. msu. edu/)下载相应的核苷酸序列，并对序列进行比对分析。利用Primer Premier 5. O (www. premierbiosoft. com)软件在水稻低植酸基因ZJU-LPA3缺失片段保守区域附近设计相应的引物，并将新合成的标记命名为ZHJ3(图I)，其引物序列如下
正向引物序列ZW3F为 5 ’ -AATTAACGGCTTGTAAAACGTG-3 ’和ZW4F 为 5，-GGTTCCCACTCGGTATGCG-3，；反向引物序列ZW3R为 5，-ACGATGGTTGTTTGGGTCTTG-3，。引物结合部位在基因的保守区域，水稻序列数据库检索结果表明该引物具有较好特异性，在采用不同水稻品种进行PCR扩增时，可见均能检测出特异性的目标条带(图3)。ニ、DNA提取及PCR检测利用上述引物可以对水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代的基因型进行鉴定，具体方法为(I)总DNA的提取
采用CTAB法提取水稻样品苗期嫩叶的总DNA，具体操作方法如下将叶片剪碎后置于2. OmL离心管中，加入800μ L CTAB提取缓冲液(IOOmM Tris-HCl pH 8. 0、20mM EDTApH8. 0、500mM NaCl,2% CTAB)，用组织碾磨仪磨碎，65°C水浴40min，期间摇动3-4次，加入等体积的氯仿异戊醇(24 :1，v/v)混合液，上下颠倒混匀，10000r/min离心lOmin，转移上清至新的I. 5mL离心管中，加入等体积预冷(_20°C )的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置-20°C下沉淀30min ；10000r/min离心IOmin,弃上清液,70%こ醇洗漆2次，自然风干,溶于适量(100-200 μ L)TE 溶液中，_20°C保存。(2)对总DNA进行PCR扩增检测PCR 反应体系为 20 μ L，其中，2 XPCR Master Mix 缓冲液 10 μ L (含 I. 5mM Mg2+、200 μ M dNTPUU Taq 酶)、10 μ M 正反向引物各 O. 4 μ L、50ng/μ L 总 DNA I μ L、灭菌去离子水补至20 μ L0PCR 反应程序为94°C预变性 4min ;94°C变性 30s，57°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35个循环；最后72°C延伸7min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，经溴化こ锭染色后拍照成像。(3)判断是否含有目标基因采用引物ZHJ3扩增时，若只能扩出390bp特征帯，则该样品为含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的纯合型材料；若只能扩出746bp特征带，则该样品为不含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的纯合型材料；若能同时扩出390和746bp特征带，则该样品为含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的杂合型材料。三、引物ZHJ3对基因型ZJU-LPA3杂交后代的选择效果利用设计合成引物ZHJ3，对含Z JU-LPA3基因纯合型材料z ju_lpa3和不含ZJU-LPA3基因纯合型材料嘉兴08-1的F2代在苗期进行PCR基因型检测，检测结果如图2所示，将材料分为3种基因型具有390bp特征带的材料，具有746bp特征带的材料和两者兼具的材料。收获匕植株上的F2 : 3种子，利用化学分析法及离子交换色谱法检测每个单株的植酸含量，结果表明，所有具有390bp特征带的单株均是低植酸含量单株，而具有746bp特征带和二者兼具的材料均为植酸含量正常的单株。因此，引物ZHJ3为共显性的基因功能性标记，检测结果与预期完全相符，标记选择效率达到100%。
权利要求
1.一种引物，其特征在于，正向引物为ZW3F和ZW4F，反向引物为ZW3R ；ZW3F :5’ -AATTAACGGCTTGTAAAACGTG-3’ZW4F :5’ -GGTTCCCACTCGGTATGCG-3’ ；ZW3R :5’ -ACGATGGTTGTTTGGGTCTTG-3’。
2.一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代基因型的方法，包括如下步骤 (1)提取水稻样品苗期叶片的总DNA； (2)以所述总DNA为模板，利用权利要求I所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离、染色后拍照成像； (3)根据成像结果，判断水稻样品的基因型； 若只出现390bp特征带，则该水稻样品为不含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的纯合型材料；若只出现746bp特征带，则该水稻样品为含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的纯合型材料；若同时出现390和746bp特征带，则该水稻样品为含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的杂合型材料； 所述水稻低植酸基因ZJU-LPA3的碱基序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用CTAB法提取总DNA。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为20μ L，其中，2 X PCR Master Mix缓冲液10 μ L、10 μ M正反向引物各O. 4 μ L、总DNA I μ L、灭菌去离子水补至20 μ L0
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为94°C预变性4min ;94°C变性 30s, 57°C退火 45s, 72°C延伸 lmin, 35 个循环；最后 72°C延伸 7min。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定水稻低植酸突变体zju-lpa3杂交后代基因型的引物及方法，该引物碱基序列如SEQ ID NO.2～4所示，该方法包括(1)提取水稻样品苗期叶片总DNA；(2)以所述总DNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离、染色后拍照成像；(3)根据成像结果，判断水稻样品的基因型；本发明公开的引物为基因功能性引物，因此，不存在遗传上的交换，也不需要表型的进一步验证；可以对大量zju-lpa3杂交后代群体进行筛选，并且可在苗期对其叶片进行检测，从而准确高效鉴定出含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的LPA水稻材料，加快LPA水稻育种进程。
文档编号C12Q1/68GK102808028SQ201210297318
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者舒庆尧, 赵海军, 谭瑗瑗, 刘庆龙 申请人:浙江大学