专利名称：控制水稻穗大小基因、其突变体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及控制水稻穗大小基因SSPl (Small and Sheathed Panicle I)和突变体sspl基因，以及它们在调控植物株高、叶夹角和穗型等方面的作用机理。本发明还涉及控制水稻穗大小基因SSPl和突变体sspl基因在降低株高提高抗倒能力、减小叶夹角提高光合效率、改变赤霉素响应抑制种子穗发芽等育种方面的应用。
背景技术：
“农以种为先”，提高产量一直是作物遗传育种研究的主要目标。水稻株型由株高、分蘖数目、分蘖角度叶片夹角以及穗型等构成，也是影响水稻产量的重要因素之一。上世纪60年代以株型改良为特征的矮化育种使得小麦和水稻的产量大幅度提高，而水稻“绿色革命”就是利用了半矮杆sdl基因。SDl编码赤霉素(Gibberellin，GA)合成基因，其突变使得水稻体内有活性的赤霉素含量下降，导致株高降低，提高植株抗倒伏能力，进而提高产量。目前研究表明，赤霉素促进植物生长发育是通过降解DELLA蛋白而实现的。在植物体内，GA首先与赤霉素受体GIDl蛋白结合，活化的GA-GIDl能与DELLA蛋白相结合，促进GID1-GA-DELLA复合体与GID2 (F-Box)蛋白结合，被泛素化后的DELLA蛋白经由26S蛋白酶解途径降解，解除了 DELLA蛋白的阻遏作用来促进植物生长的(Jiang and Fu，2007)。小麦的“绿色革·命”基因是赤霉素信号途径的关键元件一DELLA蛋白。目前在黄淮海平原大部分小麦新品种单产可达500公斤/亩，部分品种具有超过600公斤/亩产量的潜力。但在全国范围的大面积生产中，小麦的平均单产远低于350公斤/亩。据统计近30年来，小麦产量提高速度缓慢，平均年增长仅为0.7%左右。而根据预测，到2020年，我国小麦单产平均年增加2%以上才能基本满足需求。因此，要实现小麦自给，必须进一步提高小麦产量潜力，培育出高产、稳产的小麦新品种。同样，水稻的产量自上世纪60年代水稻“绿色革命”即矮化育种使得中国水稻单产比原有高杆品种提高20-30%。70年代成功采用以杂种优势利用为手段的杂交稻育种，使水稻单产在矮杆品种的基础上再增产20%左右，实现水稻产量上的飞跃，为解决我国13亿人口的吃饭问题做出了巨大贡献。然而，目前水稻生产中所应用的矮杆基因都是sdl，来源相当狭窄。矮杆基因利用单一化以及矮杆基因遗传隐性化，导致了水稻品种遗传背景单一和狭窄，影响了水稻品种特别是杂交水稻组合的产量潜力进一步挖掘和提高。所以发掘和利用新型矮杆基因十分重要。
发明内容
本发明涉及控制水稻穗大小基因SSPl基因和突变体sspl基因，以及它们在调控植物株高、叶夹角和穗型等方面的作用及其作用机制。本发明还涉及控制水稻穗大小基因SSPl和突变体sspl在植株半矮化提高抗倒能力、减小叶夹角提高光合效率、改变赤霉素响应抑制种子穗发芽等育种方面的应用。本发明人在中国水稻所收集的水稻资源材料中发现其中一个材料具有植株矮化、包穗等表型，通过遗传杂交，确定这个性状是受一个显性基因控制的。进一步遗传回交，构建了近等基因系，对近等基因系的比较分析发现，该基因除了控制株高外(降低株高对农作物抗倒伏，利于农作物密植增产)，还控制水稻的剑叶和叶夹角的大小，剑叶变短、叶夹角也变小的性状对提高作物光合效率很重要，控制水稻的穗部性状(包穗且穗也变小)。根据穗部的突出表型，本发明人将这个突变体命名为水稻穗型突变体sspl (Small andSheathed Panicle I)。sspl穗部性状不是农业直接应用的优良性状，但是它的株型和叶型性状对农业生产非常有利:1)，降低株高，可提高农作物的抗倒伏能力；2)，株型紧凑，可密植；3)，叶片深绿色，本身光合效率较高；4)，叶夹角变小，可提高群体光合效率；5)，改变赤霉素应答反应，可用于抑制种子穗发芽遗传改良。本发明人的研究工作正是针对上述五个优良性状开展的。产量是由复杂数量性状位点QTL(Quantitative Trait Loci)和环境互作所控制，并最终通过调节单位面积的穗粒数和粒重来影响产量。穗型(包括穗长、枝梗数、穗粒数、籽粒大小和结实率等)是影响水稻产量的重要因素之一，而株高和叶片夹角对提高水稻种植密度、提高光能转换效率和耐肥抗倒性以及提高产量非常重要。水稻穗型突变体sspl表现为植株半矮化和叶片直立等特征，属典型的nl类矮化类型。为了弄清该突变体矮化株型的遗传控制基础，我们利用图位克隆的方法，克隆了SSPl基因(Small and Sheathed Panicle I)。该基因编码一个GRAS蛋白，它与水稻SLRl蛋白(水稻中的DELLA蛋白)C端氨基酸序列有较高的相似性。突变的sspl是由2个氨基酸置换突变造成的(参见SEQ ID NO:4)。SSPl基因几乎在水稻不同发育阶段的各个器官和组织部位都有表达，尤其在穗部和穗下节的居间分生组织中表达量最高。转基因水稻植株中SSPl-GFP融合蛋白定位于细胞核中。赤霉素诱导糊粉层细胞α -淀粉酶活性实验表明突变的sspl蛋白能抑制赤霉素应答反应，表明sspl参与GA信 号传导过程，是赤霉素信号传导中的一个关键元件。进一步的酵母双杂交实验结果显示,突变的sspl和野生的SSPl蛋白均不能与赤霉素受体GIDl蛋白相互作用，这说明sspl/SSPl是一个参与赤霉素信号途径但不依赖于GIDl功能的新的负调控因子。sspl和SSPl蛋白也不能与参与DELLA蛋白降解的F-Box蛋白(GID2)和U-Box蛋白互作，说明sspl/SSPl蛋白稳定性的调控机制与DELLA蛋白SLRl的降解途径不同。另外，比较氨基酸序列发现，SSPl蛋白与另外一个参与油菜素内酯(BR)的调控因子DLT相似性较高。当利用外源油菜素内酯BR处理sspl突变体时，sspl突变体的第二叶鞘长度和叶夹角能够恢复到野生型对照植株接近的水平。在sspl突变体背景下，DLT表达量被明显上调，而另外一个油菜素内酯信号途径的关键基因BUl表达量略有下调。这表明SSPl基因也参与调控油菜素内酯的应答反应。以上实验结果说明，SSPl可能既参与赤霉素信号传导，又参与油菜素内酯信号传导，是两激素互作的一个关键调控元件。具体地，本发明包括下述方面:1.鉴定了水稻穗型突变体sspl的表型。水稻sspl突变体表现为包穗(抽穗不完全)、叶片直立，是一个赤霉素不敏感的半矮杆突变体。遗传分析表明，植株矮化(抽穗不完全)是受一对显性基因控制的。树脂切片实验结果表明，sspl突变体倒一节茎杆的细胞数目和细胞伸长都受到明显抑制，表明sspl抑制茎杆的细胞分裂和细胞伸长；同时，sspl突变体叶夹角明显变小，外源施加油菜素内酯能使叶夹角表型恢复到野生型水平，这说明，SSPl基因参与油菜素内酯的应答反应。2.克隆了 SSPl基因。sspl突变体分别与南京6号(NJ6，一种籼稻)和中花11号(ZH11，一种粳稻)杂交，构建了 SSPl基因的粗(精细)定位群体。通过图位克隆方法，获得了 SSPl候选基因。SSPl基因编码一个GRAS蛋白，其C端与水稻DELLA蛋白SLRl具有较高的序列保守性。获得候选基因后，通过以下实验对该候选基因进行了互补验证:a.遗传互补实验:构建自身启动子+sspl cDNA+3’UTR的载体(pSSPl: sspl-3’UTR)并通过农杆菌介导转化到日本晴(一种粳稻)中，转基因植株表现为sspl突变体的表型，具体为:株高变矮、倒一节明显缩短、叶夹角变小和对外源赤霉素处理不敏感；b.过量表达实验:构建过表达载体p35S: sspl,并通过农杆菌介导转化到日本晴中。表型分析发现,过量表达sspl的转基因水稻表现更为明显的矮化，且矮化程度与该基因表达水平呈正相关。通过以上实验确定了该候选基因是目的基因。3.获得了近等基因系NIL-sspl和NIL-SSP1。构建粳稻(日本晴)和籼稻(南京6号)两个不同遗传背景的近等基因系:NIL-sspl和NIL-SSPl。遗传分析表明，sspl基因在籼稻和粳稻中均表现为显性遗传。4.SSPl/sspl基因表达分析。利用RT-PCR方法分析了 SSPl基因在各个发育阶段和不同组织器官中的表达情况，包括:花、叶、鞘、叶枕、根、穗下茎节(从下到上0-3cm(居间分生组织区)，3-8cm(伸长区)，8cm以上(成熟区))等组织。结果表明，SSPl基因几乎在水稻不同发育阶段的各个器官组织部位都有表达，尤其在穗部和穗下节的居间分生组织中表达量最高。同SSPl野生型相比，sspl基因表达模式和表达量均没有明显的变化。5.SSPl-GFP融合蛋白的亚细胞定位分析。构建了 p35S:HA-SSPl_GFP载体，转化日本晴，利用共聚焦显微镜观察转基因植株根部的荧光信号。实验结果表明，SSPl-GFP融合蛋白定位于细胞核中。另外，GA处理并没有观察到细胞核中SSPl-GFP或sspl-GFP融合蛋白量的变化，表明SSPl-GFP融合蛋白稳定性不受GA影响。6.SSPl参与赤霉素信`号途经，但不依赖于赤霉素信号传导途径中GIDl和DELLA蛋白的功能。在sspl突变体种子糊粉层细胞中，GA不能诱导淀粉酶活性；其第二叶鞘的生长也不受GA影响。这些结果表明，SSPl参与GA信号传导过程，是赤霉素信号途径中的一个关键负调控因子。虽然，从氨基酸序列比较来看，SSPl蛋白与SLRl蛋白具有较高的同源性，但酵母双杂交结果显示，SSPl和sspl蛋白都不能与赤霉素受体GIDl蛋白互作。这些研究表明SSPl在GA信号传导途径中起作用，却是一个不依赖于GIDl功能的调控因子。同时，SSPl/sspl蛋白也不能与参与SLRl蛋白降解的U-BOX和F-BOX(GID2)蛋白互作，表明SSPl/sspl蛋白稳定性(蛋白降解途径)的调控机制与SLRl不同。sspl突变体中SLRl蛋白水平没有明显改变，而且GA处理也能导致SLRl蛋白的降解，但sspl突变体矮化表型并没有改变。这些实验也表明，sspl基因并不依赖于(或影响)DELLA蛋白的功能。7.过量表达SSPl基因也能导致植株矮化、叶夹角变小和包穗等性状。构建过表达载体p35S:SSpl/SSPl，将其转化水稻日本晴。转基因水稻表型分析证实，过量表达SSPl也能导致类似sspl突变体的表型，包括株高、叶夹角和包穗等性状。在基因表达水平相同时，过量表达sspl有更强的矮化表型。8.SSPl基因参与油菜素内酯(BR)的应答反应。在sspl突变体背景下，参与油菜素内酯信号途径的调控因子，如:DLT、BU1等基因的表达量都发生了变化。DLT基因表达量得到较为明显的上调，而BUl的表达量略有下调。当外源油菜素内酯BR处理sspl突变体后，sspl突变体第二叶鞘长度和叶夹角表型等能恢复到野生型表型。这些实验表明，SSPl基因也参与了调控油菜素内酯应答反应。SSPl既参与了赤霉素信号传导，又参与了油菜素内酯信号传导，是两大激素互作的一个关键调控元件。另外，本发明人在进一步的研究中发现，控制水稻穗大小基因SSPl基因在农作物中非常保守，通过Blast发现控制水稻穗大小基因突变体sspl基因在小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或拟南芥等植物中的同源基因，可以将它们统称为控制穗大小基因，这些基因的名称以及它们的cDNA序列编号可参见表I。根据本发明对控制水稻穗大小基因SSPl及其突变体sspl基因的研究结果，可以推测这些同源基因也具有与控制水稻穗大小基因SSPl及其突变体sspl基因相似的功能。表1:控制水稻穗大小基因突变体sspl基因在其它植物中的同源基因
权利要求
1.控制水稻穗大小基因突变体sspl基因，其编码的氨基酸序列为SEQID N0:4。
2.根据权利要求1所述的控制水稻穗大小基因突变体sspl基因，其核苷酸序列为SEQID NO:3。
3.—种重组载体，其包含权利要求2所述的控制水稻穗大小基因突变体sspl基因。
4.一种转基因植物细胞，其转化了权利要求3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的转基因植物细胞，其为下列植物的细胞:水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或拟南芥。
6.根据权利要求5所述的转基因植物细胞，其为水稻细胞。
7.控制水稻穗大小基因突变体sspl基因的应用，其用于培育具有植株半矮化提高抗倒伏能力、减小叶夹角提高光合效率、改变赤霉素响应抑制种子穗发芽的优点的农作物。
8.一种培育植株矮化耐倒伏、改良农作物穗型和提高叶片光合效率的农作物的方法，其包括通过转基因技术在所述农作物中组织特异性启动子过量表达控制水稻穗大小基因SSPl基因或其突变体sspl基因的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述农作物包括水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或拟南芥。
10.控制水稻穗大小基因突变体sspl基因在小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或拟南芥等植物中的同源基因，它们统称为控制糖大小基因，其cDNA序列为:小麦 TaSSPl-1ikel (Rht-Ala):SEQ ID NO:5 ；大麦 HvSSPl-1ike·:SEQ ID NO:7 ；玉米 ZmSSPl-1ike:SEQ ID NO:9 ；高粱 SbSSPl-1ike:SEQ ID NO:11 ；大豆 GmSSPl-1ike:SEQ ID NO:13 ；棉花 GhSSPl-1ikel:SEQ ID NO:15 ;棉花 GhSSPl-like2:SEQ ID NO:17 ;油菜 BnSSPl-1ikel:SEQ ID NO:19 ；油菜 BrSSPl-like2:SEQ ID NO:21 ；拟南芥 AtSSPl-1ikel:SEQ ID NO:23 ；拟南芥 AtSSPl-like2:SEQ ID NO:25。
全文摘要
本发明涉及控制水稻穗大小基因SSP1(Small and Sheathed Panicle 1)及其突变基因ssp1，以及它们在调控植物株高、叶夹角和穗大小等方面的作用机理，其中来源于控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因的序列SEQ IDNO3。本发明还涉及控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因在大麦、小麦、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或拟南芥等植物中的同源基因，它们统称为控制穗大小基因。本发明还涉及SSP1基因和突变体ssp1基因在控制植物株高、提高耐倒伏能力、减小叶夹角提高光合效率、改变赤霉素响应抑制穗发芽等育种方面的应用。
文档编号A01H5/00GK103243107SQ20121003046
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者傅向东, 刘正斌, 刘学英, 吴昆 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所