一种无抗性标记营养缺陷型鲁式酵母的制备方法与流程

文档序号：14657809发布日期：2018-06-12 07:30阅读：1112来源：国知局

本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及营养缺陷型基因工程的构建技术，具体涉及一种无抗性标记营养缺陷型鲁式酵母的制备方法。

背景技术：

鲁式酵母是一种耐盐性的产香酵母，在含盐量18％的培养基中仍具有生长能力，因而被广泛用于酱油等发酵食品的制备中，起到增进产品风味的作用。

营养缺陷性菌株是野生型菌株通过自发突变或人工改良而失去合成某种成长因子的能力，只能在完全培养基或补充了相应的生长因子的基本培养基中才能正常生长的变异菌株。在理论研究中，营养缺陷型菌株不仅被广泛应用于阐明微生物代谢途径上，而且在遗传学的研究中具有特殊的地位。在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等遗传学研究中，营养缺陷型是常用的标记菌种。此外，营养缺陷型菌株还是研究基因的结构与功能常用的材料。在生产实践中，营养缺陷型可以用来切断代谢途径，以积累中间代谢产物；也可以阻断某一分支代谢途径，从而积累具有共同前体的另一分支代谢产物；营养缺陷型还能解除代谢的反馈调节机制，以积累合成代谢中某一末端产物或者中间产物；也可将营养缺陷型菌株作为生产菌株杂交、重组育种的遗传标记。此外，营养缺陷型菌株还广泛应用于核苷酸及氨基酸等产品的生产。

目前，现有技术中鲜有鲁式酵母的营养缺陷型菌株，这很大程度上阻碍了鲁式酵母的分子研究。所以，制备鲁式酵母营养缺陷型菌株是对其进行深入研究的重要基础工作之一。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种无抗性标记营养缺陷型鲁式酵母的制备方法，以解决现有技术中缺乏一种构建尿嘧啶营养缺陷型鲁式酵母的方法的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是常规诱变方法准确性较低、遗传稳定性不理想。

本发明要解决的再一技术问题是在分子生物学类构建方法中，难以实现不影响鲁式酵母其他基因表达而仅缺失尿嘧啶表达基因。

本发明要解决的又一技术问题是在分子生物学类构建方法中，目的基因向受体菌株中的转化效率较低。

本发明要解决的又一技术问题是在分子生物学类构建方法中，目的菌株的筛选方法操作繁琐、准确性较低。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种无抗性标记营养缺陷型鲁式酵母的制备方法，包括以下步骤：

1)分别扩增鲁式酵母URA表达基因1～804bp的片段及1603～2180bp的片段；

2)将步骤1)所得的两片段进行融合PCR连接；

3)将步骤2)所得产物连接到pMD19-T载体上，筛选阳性克隆，即得到重组质粒；

4)培养酵母细胞，至培养液OD600为0.7～1.0时离心收集菌体，以30mL离心前培养液对应不超过1mL 100mM浓度的LiAc溶液的比例，向所述菌体中加入1mL 100mM浓度的LiAc溶液，重悬菌体，即得到感受态酵母重悬液；

5)取步骤3)所得的重组质粒100～500ng，与5μL浓度为10mg/mL的变性鲑鱼精DNA、240μL浓度为50％的PEG溶液、36μL浓度为1M的LiAc溶液混合，加水补齐至360μL，即得到预混液；将360μL所述预混液与100μL步骤4)所得的感受态酵母重悬液充分混合，于30℃保温30min，每10min混匀一次，而后转移至42℃条件下热激30min，每10min混匀一次，而后以12000rpm的转速离心1min，弃上清，向沉淀中加入200μL无菌去离子水悬浮沉淀；

6)利用同时含有Ura和5’-FOA的YNB培养基培养步骤5)所得产物，筛选得到目的菌株。

作为优选，步骤1)所述扩增鲁式酵母URA表达基因1～804bp的片段，具体包括以下操作：

A)提取鲁式酵母基因组DNA并以其为模板，以序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的DNA片段分别为上、下游引物，执行PCR扩增；此PCR扩增的反应体系为：模板2μL，上、下游引物各2μL，Premix Taq 25μL，ddH2O将反应体系总体积补齐至50μL；此PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，重复30个循环，最后72℃延伸5min；

B)将步骤A)所得产物经电泳、切胶回收后连接到pMD19-T质粒载体上；

C)以步骤B)所得的重组质粒为模板，以序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的DNA片段分别为上、下游引物，执行PCR扩增；此PCR扩增的反应体系为：模板1μL，上、下游引物各2μL，10×Buffer5μL，2.5mM浓度的dNTP 4μL，Pfu酶1μL，ddH2O将反应体系总体积补齐至50μL；此PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，40～60℃退火30s，72℃延伸60s，重复30个循环，最后72℃延伸5min；PCR扩增产物即为所述鲁式酵母URA表达基因1～804bp的片段。

作为优选，步骤1)中所述扩增鲁式酵母URA表达基因1603～2180bp的片段，具体包括以下操作：

α)提取鲁式酵母基因组DNA并以其为模板，以序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的DNA片段分别为上、下游引物，执行PCR扩增；此PCR扩增的反应体系为：模板2μL，上、下游引物各2μL，Premix Taq 25μL，ddH2O将反应体系总体积补齐至50μL；此PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸60s，重复30个循环，最后72℃延伸5min；

β)将步骤α)所得产物经电泳、切胶回收后连接到pMD19-T质粒载体上；

γ)以步骤β)所得的重组质粒为模板，以序列为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的DNA片段分别为上、下游引物，执行PCR扩增；此PCR扩增的反应体系为：模板1μL，上、下游引物各2μL，10×Buffer5μL，2.5mM浓度的dNTP 4μL，Pfu酶1μL，ddH2O将反应体系总体积补齐至50μL；此PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，40～60℃退火30s，72℃延伸60s，重复30个循环，最后72℃延伸5min；PCR扩增产物即为所述鲁式酵母URA表达基因1603～2180bp的片段。

作为优选，步骤2)具体包括以下操作：

i)取1μL步骤1)所得的鲁式酵母URA表达基因1～804bp的片段，2μL步骤1)所得的鲁式酵母URA表达基因1603～2180bp的片段，10×Buffer5μL，2.5mM浓度的dNTP 4μL，Pfu酶1μL，ddH2O将反应体系总体积补齐至50μL，以此作为反应体系执行PCR反应；此PCR反应的程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，重复30个循环，最后72℃延伸10min；

ii)将步骤i)所得产物进行50倍体积稀释并以此作为模板，以序列为SEQID NO:3、SEQ ID NO:8的DNA片段分别为上、下游引物，执行PCR扩增；此PCR扩增的反应体系为：模板2μL，上、下游引物各2μL，Premix Taq 25μL，ddH2O将反应体系总体积补齐至50μL；此PCR反应的程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，重复30个循环，最后72℃延伸10min；PCR产物经电泳后切胶回收，然后将回收产物连接入pMD-19T载体，转化，验证正确连接入载体之后，挑取其中一株阳性菌株进行扩大培养，并提取质粒，即得到敲除载体。

作为优选，步骤6)中所使用的培养基包括由SD培养基、DO Supplement-Ura所组成的YNB培养基，以及由SD培养基、DO Supplement-Ura、Ura、5’-FOA所组成的梯度筛选培养基；所述梯度筛选培养基有若干个，每个梯度筛选培养基所含的Ura含量均为20μg/mL，各梯度筛选培养基中5’-FOA含量呈梯度分布。

作为优选，步骤6)具体包括以下操作：取100μL步骤5)所得产物涂布于同时含有Ura和5’-FOA的YNB培养基固体平板中，30℃培养2～4d，挑取较小菌落利用PCR方法验证是否为Ura缺陷型菌株，将Ura缺陷型菌株利用梯度筛选培养基和YNB培养基中进行进一步的验证，并得到稳定菌株。

作为优选，步骤6)所述培养基中Ura的浓度为1～20μg/mL，5’-FOA的浓度为0.1～4mg/mL。

在以上技术方案中，所述鲁式酵母URA表达基因是NCBI数据库中登录号为AB665419.1的基因片段。在以上技术方案中，所述DO Supplement-Ura又称为缺陷型氨基酸混合物-Ura，可自市面购得。在本发明中，所述上游片段是指鲁式酵母URA表达基因1～804bp的片段；所述下游片段是指鲁式酵母URA表达基因1603～2180bp的片段。

本发明提供了一种无抗性标记营养缺陷型鲁式酵母的制备方法，该技术方案首先分析了鲁式酵母的URA表达基因，分别针对其CDS序列的上游片段和下游片段设计引物，以鲁式酵母总DNA为模板扩增得到目的片段后，分别与pMD19-T载体连接，再以重组质粒为模板、使用Pfu酶分别扩增，得到含有同源片段的上、下游片段；此步PCR扩增中由于使用了Pfu酶，因此产物片段为平末端，更有利于后续重组。在此基础上，本发明通过融合PCR程序将上、下游片段连接，从而得到敲除了CDS序列的鲁式酵母URA表达基因，利用该同源重组片段进行工程菌的构建。

基于该同源重组片段，本发明利用pMD19-T载体构建重组质粒，而后通过PEG-醋酸锂方法高效转化野生型菌株，对转化产物先以限制性培养基初筛，再通过PCR方法直接验证，最后利用含梯度浓度5-氟乳清酸的培养基进一步验证。本发明方法在基因修饰层面准确、有效，同时设计了高效率的转化方法和筛选手段，所构建的工程菌具有严格的Ura营养缺陷特征，同时遗传稳定性良好。

附图说明

图1是本发明实施例1中鲁式酵母URA表达基因三片段的PCR扩增结果电泳图；图中：第一泳道为上游片段(1～804bp的片段)；第二泳道为CDS片段(805～1602bp的片段)；第三泳道为下游片段(1603～2180bp的片段)。

图2是本发明实施例1中上、下游两个片段插入T载体后酶切验证结果电泳图。

图3是本发明实施例1中基因敲除菌落URA基因CDS片段的PCR扩增结果电泳图。

图4是本发明实施例1中URA基因CDS区域敲除之后上下游基因片段的扩增结果电泳图；图中：第一泳道为野生型鲁式酵母整个URA基因的扩增结果；第二泳道为URA基因CDS区域敲除之后上下游基因片段的扩增结果。

图5是本发明实施例1中利用梯度筛选培养基培养后的菌落形态图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例所用到的培养基如下：

完全培养基(YPD)：酵母提取物1％，胰蛋白胨2％，定容至900mL。

SD培养基，以及DO(缺陷型氨基酸混合物-Ura)，购自Coolaber公司。

基础筛选培养基(SD+DO)：YNB(含硫酸铵):6.7g，DO(Ura):1.29g，琼脂粉：2g/100ml。加700ml去离子水，充分溶解，调节PH至6.8左右。加水定容至900m，每瓶分装90ml溶液。另外，为了防止葡萄糖或是半乳糖与培养基中物质反应，需要另外配置20％的葡萄糖或半乳糖，使用时每瓶添加10ml。

20％的葡萄糖/半乳糖：葡萄糖/半乳糖20g定容至100ml。高温灭菌，4℃保存备用。

梯度筛选培养基(SD+DO+Ura+5’-FOA):在基础培养基的基础上添加Ura至浓度为：20μg/mL，分别添加5’-FOA浓度至0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml。

LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，PH 7.0。

实施例1

1、菌株和质粒

大肠杆菌E.coli DH5ɑ、鲁氏酵母菌为本实验室所有。pMD19-T质粒载体自市面购得。

2、主要试剂

Premix Taq^TM(Ex Taq^TMVersion 2.0)、DNA Marker、pMD^TM19-T Vector Cloning Kit、所需限制性内切酶均购自宝生物(大连)；Pfu DNA Polymerase，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化(北京)科技有限公司；5’-FOA、琼脂糖均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；基因组提取试剂盒购自飞净有限公司。其他所用试剂都为分析纯。

3引物设计与合成

根据NCBI搜索的得到鲁式酵母URA基因片段(登录号：AB665419.1)。分析URA基因片段，发现在这2180bp的基因片段中其CDS区域为805..1602。本实验将CDS区域以外的片段通过融合形成一个片段，在导入酵母细胞，通过同源重组把URA基因的CDS区域敲除掉，形成营养缺陷型菌株。设计引物如表1所示：

表1引物列表

以上引物均由华大基因合成。其中实线下划线标注的为酶切位点，虚线下划线标注的为与上下游同源的片段。

4实验流程及结果

4.1酵母基因组的提取

分别挑取适量斜面保存的鲁氏酵母在YPD固体培养基30℃培养活化之后，挑出单菌落进行转接，并30℃、180rpm/min过夜振荡培养，之后取适量菌液按照酵母基因组提取试剂盒说明书进行酵母基因组的提取。

4.2URA基因CDS区域上下游基因的扩增

先是使用ExTaq酶扩增出上下游片段，连入T载体，提取质粒，-20℃保存用于后续实验。并送样测序进一步验证片段的正确性。具体PCR反应体系如下：

反应体系如下：基因组DNA2μL，引物F2μL，引物R2μL，Premix Taq25μL，ddH2Oup to 50μL。

上游片段PCR反应程序如下：预变性95℃2min；变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃60s，30个循环；再延伸72℃5min。12℃forever

下游片段的PCR反应程序除了退火温度Tm：45℃之外，其余的步骤相同。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收(天根琼脂糖凝胶回收试剂盒)，将得到的纯化PCR产物分别连接到pMD19-T载体上，挑取阳性克隆，菌液PCR验证，选取其中一个扩大培养，提取质粒(得到质粒为Ura-上游-19T，Ura-下游-19T)，送样由华大公司测序。

然后，使用Pfu酶分别扩增上下游基因片段，该酶扩增出来的片段为平末端，更有利于后续的片段重组。使用梯度PCR扩增两片段，找到两条片段的都能够扩出来的共同的退火温度。便于下一步实验。使用的引物为上游-F2，上游-R2；下游-F2，下游-R2，使用Ura-上游-19T，Ura-下游-19T为模板，扩增代有同源片段的上下游基因片段，并切胶回收。

反应体系为：质粒DNA1μL，引物F2μL，引物R2μL，10*Buffer5μL，dNTP(2.5mM)4μL，Pfu1μL，ddH2Oup to 50μL。

PCR反应程序如下：预变性95℃2min；变性95℃30s，退火40～60℃30s，延伸72℃60s，30个循环；再延伸72℃5min。12℃forever

4.3URA基因CDS区域上下游基因的融合

将1.4.2中回收得到的片段进行融合：

反应体系如下：上游片段1μL，下游片段2μL，10*Buffer5μL，dNTP(2.5mM)4μL，Pfu1μL，ddH2Oup to 50μL。

PCR反应程序如下：预变性95℃2min；变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃120s，30个循环；再延伸72℃10min。12℃forever

将PCR产物进行50倍的稀释。进行下一步反应：

反应体系如下：融合片段2μL，上游-F22μL，下游-R22μL，Premix Taq25μL，ddH2Oup to 50μL。

反应程序如下：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，重复30个循环，最后72℃延伸10min；

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收(天根琼脂糖凝胶回收试剂盒)，将得到的纯化PCR产物分别连接到pMD19-T载体上，挑取阳性克隆，菌液PCR验证，选取其中一个扩大培养，提取质粒(得到含有融合片段的质粒，命名为：Ura-SX-19T)。

4.4酵母感受态制备及转化

酵母感受态制备：

a.从平板上挑取单菌落，于20ml YPD液体培养基过夜培养。

b.将1ml菌液转接至新鲜30ml YPD液体培养基中，使菌体浓度OD600为0.2～0.25，30℃振荡培养。

c.菌体浓度OD600为0.7～1.0时，离心收集菌体，并用无菌水离心洗涤，离心条件为4000rpm/min，5min。

d.沉淀用合适体积的100mMLiAc重悬(30mL的酵母最多用不超过1ml100mMLiAc，通常100μL的酵母细胞用于一个质粒的转化)。

e.将悬浮的酵母细胞分装到1.5ml灭菌EP管中，-80℃可短时间保存。

酵母转化：

a.配制预混液，每转化一个质粒即一个反应需要360μL的预混液。加入质粒DNA 100-500ng，鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml)5μL，50％PEG240μL，1M的LiAc36μL，加水补齐至360μL。

b.将配制好的预混液加入到感受态中，用枪反复吹打，使酵母与预混液充分混合。

c.30℃保温30min，每10min混匀一次。

e.转移至42℃水浴锅中热激30min，每10min混匀一次。

f.12000rpm，离心1min，弃掉上清。

g.沉淀中加入200μL去无菌离子水悬浮沉淀。

4.5Ura营养缺陷型菌株的筛选：

将转化后的酵母涂布于外源添加有Ura和5’-FOA的YNB-OD(Ura)酵母菌合成培养基上，30℃培养3～4d使转化子形成单菌落。同时做一组未进行转化质粒的酵母菌对照。将长出的菌落直接进行菌落PCR验证，分别使用CDS引物以及上游F2以及下游R2引物进行扩增，验证。选取阳性单菌落进行饥饿培养至菌体浓度不再增长，将其均匀涂布于加有尿嘧啶的完全培养基和不添加尿嘧啶的基本培养基上做对比。经多次复筛和分离纯化获得遗传性状稳定的尿嘧啶营养缺陷型菌株进行保存。为了能够进一步验证Ura营养缺陷型的菌株表型，在YNB添加了葡萄糖为碳源的培养基中另外添加Ura和不同浓度的5’-FOA，进行双重鉴定。

表2筛选培养条件下各实验组菌株生长情况统计表

实验结果如图5和表2所示，由此双重验证了基因敲除成功，构建出了尿嘧啶营养缺陷型菌株。可用其作为筛选标记，进行其他功能基因的研究。

实施例2

一种无抗性标记营养缺陷型鲁式酵母的制备方法，包括以下步骤：

1)分别扩增鲁式酵母URA表达基因1～804bp的片段及1603～2180bp的片段；

2)将步骤1)所得的两片段进行融合PCR连接；

3)将步骤2)所得产物连接到pMD19-T载体上，筛选阳性克隆，即得到重组质粒；

6)利用同时含有Ura和5’-FOA的YNB培养基培养步骤5)所得产物，筛选得到目的菌株。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)所述扩增鲁式酵母URA表达基因1～804bp的片段，具体包括以下操作：

B)将步骤A)所得产物经电泳、切胶回收后连接到pMD19-T质粒载体上；

步骤1)中所述扩增鲁式酵母URA表达基因1603～2180bp的片段，具体包括以下操作：

β)将步骤α)所得产物经电泳、切胶回收后连接到pMD19-T质粒载体上；

步骤2)具体包括以下操作：

ii)将步骤i)所得产物进行50倍体积稀释并以此作为模板，以序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8的DNA片段分别为上、下游引物，执行PCR扩增；此PCR扩增的反应体系为：模板2μL，上、下游引物各2μL，Premix Taq 25μL，ddH2O将反应体系总体积补齐至50μL；此PCR反应的程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，重复30个循环，最后72℃延伸10min；PCR产物经电泳后切胶回收，然后将回收产物连接入pMD-19T载体，转化，验证正确连接入载体之后，挑取其中一株阳性菌株进行扩大培养，并提取质粒，即得到敲除载体。

步骤6)中所使用的培养基包括由SD培养基、DO Supplement-Ura所组成的YNB培养基，以及由SD培养基、DO Supplement-Ura、Ura、5’-FOA所组成的梯度筛选培养基；所述梯度筛选培养基有若干个，每个梯度筛选培养基所含的Ura含量均为20μg/mL，各梯度筛选培养基中5’-FOA含量呈梯度分布。

步骤6)具体包括以下操作：取100μL步骤5)所得产物涂布于同时含有Ura和5’-FOA的YNB培养基固体平板中，30℃培养2～4d，挑取较小菌落利用PCR方法验证是否为Ura缺陷型菌株，将Ura缺陷型菌株利用梯度筛选培养基和YNB培养基中进行进一步的验证，并得到稳定菌株。

步骤6)所述培养基中Ura的浓度为1～20μg/mL，5’-FOA的浓度为0.1～4mg/mL。

实施例3

一种无抗性标记营养缺陷型鲁式酵母的制备方法，包括以下步骤：

1)分别扩增鲁式酵母URA表达基因1～804bp的片段及1603～2180bp的片段；

2)将步骤1)所得的两片段进行融合PCR连接；

3)将步骤2)所得产物连接到pMD19-T载体上，筛选阳性克隆，即得到重组质粒；

6)利用同时含有Ura和5’-FOA的YNB培养基培养步骤5)所得产物，筛选得到目的菌株。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

实施例4

一种无抗性标记营养缺陷型鲁式酵母的制备方法，包括以下步骤：

1)分别扩增鲁式酵母URA表达基因1～804bp的片段及1603～2180bp的片段；

2)将步骤1)所得的两片段进行融合PCR连接；

3)将步骤2)所得产物连接到pMD19-T载体上，筛选阳性克隆，即得到重组质粒；

6)利用同时含有Ura和5’-FOA的YNB培养基培养步骤5)所得产物，筛选得到目的菌株。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江西科技师范大学

<120> 一种无抗性标记营养缺陷型鲁式酵母的制备方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA