一种哈茨木霉菌基因敲除方法与流程

文档序号：14657806发布日期：2018-06-12 07:30阅读：909来源：国知局

本发明属于生物技术领域，涉及一种哈茨木霉菌基因敲除方法。

技术背景

重木霉属真菌是一类重要土壤习居菌，属于真菌界、双核菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、从梗孢科，其菌丝生长及孢子萌发能够适应较广的温湿度和pH范围，且腐生性强、繁殖速度快，可迅速占据有利空间。目前，木霉属真菌已广泛用于多种植物真菌病害的防治，是一种较理想的生防真菌和植物促生菌(Plant Growth Promoting Fungus，PGPF)(Shoresh et al. 2010)。近五年来，全球市场上的木霉制剂呈指数增长，正式注册登记的木霉制剂有38个(Woo et al.2014)。目前，约50％木霉制剂成分包含哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)。已登记的木霉制剂，主要用于土壤处理(与各种肥料混合施用)和种子处理(种子包衣)。由于土壤和作物种类的差异、土壤温度、湿度的变化以及土著微生物的存在显著影响着外源木霉的定殖，严重制约了功能木霉的进一步应用。通过遗传改造，获得稳定遗传的工程菌株，研究木霉拮抗病原真菌、促生和诱导植物抗性的机制，分析木霉秸秆固体发酵中关键基因，有利于木霉相关产品的规模化利用。

外源DNA进入真核细胞核后，以两种方式进入结合基因组中：基因打靶通过同源重组 (Homologous recombination,HR)实现；随机插入或异位整合和基因过量表达通过非同源性末端接合(NHEJ)完成。在转化过程中，HR和NHEJ都比较活跃，但在在丝状真菌中，NHEJ 效率比HR效率高出很多，直接导致基因敲除中脱靶，得到较多的假阳性。在敲除哈茨木霉基因中，同源重组效率约为2％(Montero Barrientos et al.,2011)，脱靶概率较高，目前国际上也鲜有哈茨木霉基因的敲除案例。本发明通过建立一套完整的哈茨木霉基因敲除方法，高效敲除靶标基因。

原生质体的制备与再生是PEG-CaCl2转化方法的基础，真菌的原生质体制备通常采用酶法消化细胞壁获得，目前常用的细胞壁裂解酶有纤维素酶、蜗牛酶、裂解酶等。一般采用幼嫩菌丝、分生孢子和担孢子来获得原生质体(李娟等，2006)。影响原生质体制备和再生的因素很多，包括液体培养基的成分、菌丝体的培养温度、菌丝体的生长期、制备原生质体的溶菌温度和溶菌时间等。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种哈茨木霉基因敲除方法，使同源同组效率达到20％；同时极大缩短获得阳性转化子的周期。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种哈茨木霉基因敲除方法，包括(1)构建敲除基因片段；(2)PEG-CaCl2原生质体转化；(3)菌落PCR筛选阳性突变子；

其中，构建敲除基因片段包括以下步骤：

以哈茨木霉基因组DNA为模板，分别PCR扩增目标基因约1200bpd的5’和3’端同源臂，以引物Hyg-F和Hyg-R扩增潮霉素抗性基因，Hyg-F与扩增5’同源臂的反向引物设置16bp 的重叠区域；Hyg-R与扩增3’同源臂的正向引物设置16bp的重叠区域；BamH1酶切载体 pUC19，利用一步法无缝克隆试剂盒进行体外重组并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用5’ 同源臂的上游引物5F和3’同源臂的下游引物3R扩增敲除片段验证阳性克隆；引物5F和3R 进行PCR扩展大量制备敲除片段，纯化敲除片段使敲除片段浓度达到500ng/μL。

其中，所述的PEG-CaCl2原生质体转化优选包括：制备哈茨木霉原生质体；将哈茨木霉原生质体悬浮液、纯化敲除片段、PEG溶液；用枪头混匀；加PEG溶液，轻轻混匀，常温下放置；加溶液B，轻轻混匀；将混合液涂布在覆盖层析纸的含1M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；将条形层析纸片转到含抗生素的PDA平板上，28℃，避光培养30-36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天；其中所述的溶液B配方为：1Msorbitol，50mM CaCl2，10mM TrisHCl，pH 7.5；所述的PEG溶液配方为：25％PEG6000，50mM CaCl2、10mM TrisHCl，pH 7.5。

所述的PEG-CaCl2原生质体转化进一步优选包括：制备哈茨木霉原生质体；冰上放置15mL 离心管，分别加200μL哈茨木霉原生质体悬浮液、10μL纯化敲除片段、50μL PEG溶液；用枪头混匀，冰上放置20min；加2mL PEG溶液，轻轻混匀，常温下放置5min；加2mL溶液 B，轻轻混匀；将2mL混合液涂布在覆盖层析纸的含1M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；将条形层析纸片转到含抗生素的PDA平板上，28℃，避光培养 36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天。

所述的制备原生质体的方法优选：接种哈慈木霉于PDA平板，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10mL生理盐水洗涤菌丝表面，经玻璃绒过滤，去除菌丝体，得到孢子悬液；在玻璃纸覆盖的PDA平板上，取200μL孢子悬液涂布，28℃，避光培养16-20h直至孢子萌发；取玻璃纸，用溶解酶溶液洗涤玻璃纸，收集萌发的孢子；28℃，100rpm培养萌发的孢子悬液90min；预冷离心机和转子，准备装有玻璃绒的离心管；90min后，萌发的孢子悬液经装有玻璃绒的离心管过滤，除去菌丝，用溶液A冲洗，终悬液体积控制在20-30mL； 4℃、2000rpm离心10min，去上清；加20mL溶液A，再次离心，去上清；加1mL溶液B，冰上得到原生质体；用血球板观察、计数，稀释原生质体至10⁸个/mL；所述的溶液A配方为： 1.2M sorbitol，0.1M KH2PO4，pH 5.6；所述的溶液B配方为：1Msorbitol，50mM CaCl2，10 mM TrisHCl，pH 7.5；所述的溶解酶溶液的配方为：0.15g溶解酶溶于20mL溶液A，0.2μm 滤膜过滤除菌；所述的生理盐水为0.8-0.9％NaCl加0.05％Tween。

所述的菌落PCR筛选阳性突变子包括直接刮取少量哈次木霉菌丝体，裂解后离心，利用菌落PCR试剂盒共同筛选阳性突变转化子；其中一对引物以5’端同源臂设置正向引物，潮霉素基因序列设置反向引物，跨5’端同源序列扩增片段；另外一对引物以潮霉素基因序列设置正向引物，3’端下游序列设置反向引物，跨3’端同源序列扩增片段。。在获得阳性敲除突变子后，光照培养至产孢子，再通过单孢分离纯化突变子。

本发明技术方案的详细内容为：

哈茨木霉菌中高效基因敲除方法

1.试剂：

2.操作流程

2.1敲除片段构建(2天)

高保真酶(Phusion high-fidelity DNA polymerase，New England Biolabs，分别扩增目标基因5’和3’同源臂，引物Hyg-F和Hyg-R扩增潮霉素抗性基因，各引物设置16bp的重叠区域。 BamH1酶切载体pUC19，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，利用体外重组酶技术( II One Step Cloning Kit.)，反应体系：4μL 5×CE buffer，2μL Exnase^TMII，1μL线性载体(0.06 pmol)，1μL PCR片段(0.03pmol)和10μL去离子水；37℃反应30分钟后冰浴。

将酶连反应产物与大肠杆菌DH5α感受态混合冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴2 min，转接600μL LB液体培养基中，于37℃，120rpm条件下复苏1-2h后涂布于 Amp-X-Gal-IPTG平板中(LB固体培养基中加入100μL 24mg/mL IPTG、100μL 100mg/mL Amp，200μL 20mg/mL X-Gal 200μL)，37℃培养14-16h后挑取白斑，用质粒提取试剂盒 (Axygen)提取质粒，引物5F和3R扩增敲除片段验证阳性克隆；引物5F和3R扩展大量制备敲除片段，纯化后PCR片段浓度达到500ng/μL。

2.2木霉原生质体的制备(1天)

接种木霉于PDA平板，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10mL生理盐水 (0.8-0.9％NaCl,0.05％Tween)洗涤菌丝表面，经玻璃绒过滤，去除菌丝体，得到孢子悬液；

在玻璃纸覆盖的PDA平板上，取200μL孢子悬液涂布，28℃，避光培养16-20h。观察 PDA平板上孢子是否萌发，如未萌发，延长培养时间；

配制溶解酶溶液：0.15g溶解酶(Lysing enzyme，Sigma:L1412)溶于20mL溶液A，0.2 μm滤膜过滤除菌；

取玻璃纸，用溶解酶溶液洗涤玻璃纸，收集萌发的孢子；28℃，100rpm培养萌发的孢子悬液90min；

预冷离心机和转子，准备装有玻璃绒的离心管(打通离心管底部，加入一层玻璃绒)；

90min后，萌发的孢子悬液经装有玻璃绒的离心管过滤，除去菌丝，用溶液A冲洗，终悬液体积控制在20-30mL；4℃、2000rpm离心10min，去上清；

加20mL溶液A，再次离心，去上清；加1mL Solution B，冰上得到原生质体；用血球板观察、计数，稀释原生质体至10⁸个/mL。

2.3原生质体转化(3天)

冰上放置15mL离心管，分别加200μL原生质体悬浮液、10μL纯化PCR产物、50μL PEG；用枪头混匀，冰上放置20min；

加2mL PEG，轻轻混匀，常温下放置5min；加2mL溶液B，轻轻混匀；

将2mL混合液涂布在覆盖层析纸(Whatman)的含1M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；

将条形层析纸片转到含抗生素的PDA平板上，28℃，避光培养36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天。

2.4阳性突变子筛选和纯化(3天)

跨同源臂设置引物，如图所示，扩增P1和P2直接筛选阳性突变子；28℃光照培养阳性突变子至产孢(约3天)，稀释梯度法进行单孢分离，纯化突变子，获得稳定遗传敲除突变子。本发明的有益效果：

本发明构建一套完整的哈次木霉基因敲除、转化体系，攻克了哈茨木霉敲除难题，跨同源臂设计引物，结合菌落PCR高效筛选敲除突变子，8天能够获得阳性转化子，极大缩短实验周期。为阐述哈茨木霉拮抗病原真菌、促进植物生长、诱导植物抗性和秸秆固体发酵机制奠定方法基础。

PEG-CaCl2介导的真菌遗传转化以原生质体为感受态细胞，将受体细胞悬浮于含质粒DNA 的溶液中，转化在一定浓度的PEG、CaCl2和pH 8-9条件下进行。PEG是一种能够促进原生质体吸收外源DNA的化学诱导剂，在高pH情况下，PEG通过电荷间相互作用与外源DNA 形成紧密的复合物，受体细胞通过内吞作用吸收这些复合物到细胞内，随后进入细胞核并整合到受体基因组中。利用菌落PCR试剂盒(Plant Direct PCR kit，Thermo Secientific)扩增跨同源臂的区域(图2，引物1和2)，筛选阳性克隆。再获得阳性敲除突变子后，光照培养至产孢子，再通过单孢分离纯化突变子，极大缩短筛选周期，简化操作流程。

基因打靶通过同源重组实现；随机插入或异位整合和基因过量表达通过非同源性末端接合完成。在转化过程中，HR和NHEJ都比较活跃，但在在丝状真菌中，NHEJ效率比HR效率高出很多，直接导致基因敲除中脱靶，得到较多的假阳性。在敲除哈茨木霉基因中，同源重组效率约为较低，脱靶概率较高，目前国际上也鲜有哈茨木霉基因的敲除案例。本发明通过建立一套完整的哈茨木霉基因敲除方法，同源同组效率达到20％；同时结果菌落PCR技术，极大缩短获得阳性转化子的周期，高效敲除靶标基因。

附图说明

图1.体外重组构建敲除载体示意图

图2.基因敲除和突变子筛选策略的示意图

注：hyg：潮霉素B抗性基因

图3.PCR筛选SQR-T037的hfb4缺失突变子(P1)

注：泳道1：1kb Marker，泳道2：SQR-T037野生型扩增P1；泳道3-17：突变子中扩增P1 图4.PCR筛选SQR-T037的hfb4缺失突变子(P2)

注：泳道1：1kb Marker，泳道2：SQR-T037野生型中扩增P2；泳道3-17：突变子中扩增P2 图5.图4.PCR筛选CBS 226.95的hfb10缺失突变子

注：泳道1：1kb Marker，泳道2：CBS 226.95中扩增P1；泳道3-7：转化子中扩增P1；泳道10：CBS 226.95野生型扩增P2；泳道11-15：转化子中扩增P2

图6.SQR-T037Δhfb4突变子与CBS 226.95Δhfb10突变子P验证

注：泳道1：DL 2000Marker；泳道2：CBS 226.95野生型扩增P3；泳道3：纯化后CBS 226.95Δhfb10扩增P3；泳道6：SQR-T037野生型扩增P3；泳道7-10：纯化后SQR-T037Δhfb4 扩增P3

生物材料保藏信息

SQR-T037，分类命名为哈茨木霉Trichoderma harzianum，保藏日期是2009年9月22日，保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3308。

具体实施方式

下面结合具体实施案例进一步阐述本发明。列举的实施案例仅用于举例说明本发明的实施方法，不用于限制本发明的使用范围。凡未注明具体实施条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件进行。

LB培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl溶于1000mL去离子水中，高温灭菌；

PDA培养基：39g Potato Dextrose Agar(Difco Laboratories,Detroit)溶于1000mL水中， 12l℃高压蒸气灭菌20min；

PDA蔗糖培养基：500mL水中，加19.5g PDA粉末，171.15g蔗糖，高温灭菌；

溶液A(200mL)：1.2M sorbitol，0.1M KH2PO4，pH 5.6；

溶液B(100mL)：1Msorbitol，50mM CaCl2，10mM TrisHCl，pH 7.5；

PEG溶液(100mL)：25％PEG6000，50mM CaCl2、10mM TrisHCl，pH 7.5。

实施例1哈茨木霉恐水性蛋白基因敲除

1.木霉菌株：木霉Trichoderma harzianum SQR-T037(CGMCC No.3308)和Trichoderma harzianum CBS 226.95(联合基因研究所Joint Genome Institute(JGI)，CBS 226.95)。

2.敲除载体构建及敲除片段的扩增(2天)

转录组学分别分析木霉SQR-T037和CBS 226.95拮抗病原真菌尖孢镰刀菌(Foc4)， SQR-T037中恐水性蛋白hfb4和CBS 226.95中hfb10的转录水平显著提高。通过基因敲除构建突变子，分析恐水性蛋白在木霉拮抗病原真菌的功能。

分别扩增目标基因(SQR-T037中hfb4(SEQ ID NO.1)和CBS 226.95中hfb10(SEQ ID NO.2))的5’和3’同源臂引物：

以SQR-T037基因组DNA为模板，引物hfb4_5F：GACGGCCAGTGAATTCTTGGAGTAGGGATGGGACGA(SEQ ID NO.3)和hfb4_5R： TCTCGGATCC TAGAGGTTGGGAGATGCTGTTG(SEQ ID NO.4)扩增SQR-T037中基因hfb4 的上游臂；引物hfb4_hygF：CCAACCTCTAGGATCCGAGAGCTACCTTACATC(SEQ ID NO.5) 和hfb4_hygR：TTCACCATCA CTCGAGGGTACTATGGCTTAGATG(SEQ ID NO.6)从质粒 pPcdna1-cel7b(SEQ ID NO.27)扩增潮霉素抗性基因；引物hfb4_3F：TACCCTCGAG TGATGGTGAATGAGTTGTTGCAC(SEQ ID NO.7)和引物hfb4_3R：TGATTACGCCAAGCTT GGTTCATGGGTCAGGGTGGT(SEQ ID NO.8)扩增hfb4的下游臂，纯化后备用。BamH1酶切载体pUC19获得线性载体，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。利用体外重组酶技术 (II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司))，反应体系：4μL 5×CE buffer，2μL Exnase^TM II，1μL线性载体(0.06pmol)，1μL PCR片段(0.03pmol)和10μL 去离子水；37℃反应30分钟后冰浴；将酶反应产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，蓝白斑筛选，挑取白斑接入含Amp的LB液体培养基中37℃，170rpm培养14-16h，用质粒提取试剂盒(Axygen)提取质粒，引物hfb4_5F和hfb4_3R扩增hfb4敲除片段，1％琼脂糖凝胶电泳验证阳性克隆；使用高保真酶(Phusion High-fidelity DNA polymerase，New England Biolabs)，以重组质粒为模板，引物hfb4_5F和hfb4_3R扩增制备敲除片段，纯化后PCR片段浓度达到 500ng/μL。

构建敲除CBS 226.95的基因hfb10的片段，利用引物hfb10_5F： GACGGCCAGTGAATTCACGAGAAGCGGATAGGATG(SEQ ID NO.9)和hfb10_5R： TCTCGGATCCTTCCTCCTTCATTGCCTCC(SEQ ID NO.10)高保真酶(Phusion high-fidelity DNA polymerase，New England Biolabs)PCR扩增木霉CBS 226.95中基因hfb10的上游臂；以 pPcdna1-cel7b为模板，引物hfb10_hygF：GAAGGAGGAAGGATCCGAGAGCTACCTTAC(SEQ ID NO.11)和hfb10_hygR：ATTTAGTCATCTCGAGGGTACTATGGCTTA(SEQ ID NO.12)扩增潮霉素抗性基因；引物hfb10_3F：TACCCTCGAGATGACTAAATGCCCTCCTC(SEQ ID NO.13)和引物hfb10_3R：TGATTACGCCAAGCTTTTATCACCGTATCCGCAA(SEQ ID NO.14) 扩增CBS 226.95中基因hfb10的下游臂。酶切及转化同上。以构建的敲除hfb10目标基因的质粒为模板，hfb10_5F和hfb10_3R扩增hfb4敲除片段，纯化后PCR片段浓度达到500ng/μL。 3原生质体与突变子筛选

SQR-T037和CBS 226.95原生质体的制备流程同操作流程2.2，200μL 4742原生质体悬浮液、10μL纯化PCR产物、50μL PEG用枪头混匀，冰上放置20min；加2mL PEG，轻轻混匀，常温下放置5min；加2mL溶液B，轻轻混匀；将2mL混合液涂布在覆盖层析纸(Whatman) 的含1M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；

将条形层析纸片转到含抗生素的PDA平板上，28℃，避光培养36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天。

转化后，获得NJAU4742的转化子15株。引物hfb4_P1F：GAATCGTGTTGGTCCGCTAA (SEQ ID NO.15)和hfb4_P1R：GAACAGAAGCCGCATCGTC(SEQ ID NO.16)扩增片段 P1，引物hfb4_P2F：CTGGCAAACTGTGATGGACG(SEQ ID NO.17)和hfb4_P2R： CATTCGGCAGTGGATGGAGT(SEQ ID NO.18)扩增P2，直接筛选阳性转化子。如图3和4 所示，筛选出4株阳性转化子。稀释梯度法进行单孢分离，纯化突变子，获得稳定遗传敲除突变子。引物hfb4_P3F：ATGAAGTTCCTCACTGTTGCCG(SEQ ID NO.19)和hfb4_P3R5： GCCTGCAAGATCGTTAGTATCAAT(SEQ ID NO.20)扩增P3片段，验证成功获得4株hfb4 缺失菌株(图6)，确定得到阳性转化子的效率为26.6％。

PEG-CaCl2转化CBS 226.95获得5株转化子，培养2天后，引物hfb10_P1F： ACCCTCTCCATACCACTTTCG(SEQ ID NO.21)和hfb10_P1R：GCGGTGAGTTCAGGCTTTT (SEQ ID NO.22)扩增P1，引物hfb10_P2F：TGCAAGACCTGCCTGAAAC(SEQ ID NO.23) 和hfb10_P2R：CACTCCTGATCCAATTGCCA(SEQ ID NO.24)扩增P2，筛选阳性转化子。如图5所示，筛选出1株阳性转化子。稀释梯度法进行单孢分离，纯化突变子，获得稳定遗传敲除突变子。引物hfb10_P3F：GATGCCCAGGTGGTCTTACT(SEQ ID NO.25)和hfb10_P3R5： CCGGCCTAGATACAAGAGC(SEQ ID NO.26)扩增P3片段，验证成功敲除CBS 226.95菌株中目标基因hfb10(图6)，确定得到阳性转化子的效率为20％。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种哈茨木霉菌基因敲除方法

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 532

<212> DNA

<213> 哈茨木霉SQR-T037(Trichoderma harzianum SQR-T037)

<400> 1

ttaggcgcca gggacacctt ggcaaaggag gtcttggccg gcctgcaaga tcgttagtat 60

caataaagtg aagagaattt gtcttcgtaa aagtcactta caacggggag aacacagcaa 120

actgcctgct tgcctgtagt agcacagccg tttttgaaag cggagggact ttggacagag 180

gtagctatac ttttgtaagc atcaaagagt ttcaaattga aggcaaagca gtagacttac 240

gagtgctaca gtcgagtcca acaatgccaa gaacgagggt agagcagcat tgggggttgc 300

tatagaggcc cgcggggcat accgcgccgc cgctggtgtt gccgttgcca ttaccgttac 360

catgaccgtt gccgttacca ttgccattgc cattgccatt gccattgcca cctgcaggca 420

gggtatagct aggaggagga ggggcatagg taggaggagg aggagggggg tagttgcctg 480

gggcggcgag gacagcagtg aagaagacgg cggcaacagt gaggaacttc at 532

<210> 2

<211> 422

<212> DNA

<213> 哈茨木霉 CBS 226.95(Trichoderma harzianum CBS 226.95)

<400> 2

atgaagttct tcgccgtcgc cgctctcttc gtcgccagcg ccatggccag cccaatgggc 60

agcgaaggat gcccaggtgg tcttactaac accgttccgc tctgctgtgc caccaacgtc 120

ctcggcgtcg cgaccctcga ttgcagcacc cgtaagtctc tatccccacc ttgggaagtc 180

acggtgatga tttgtagcta acttgtatac ggcagccact gttccggtac ccaatgtcgg 240

catcttccag gcccactgtg cttccaaggg caaacagcct gtctgctgca ctgttcccgt 300

tgtaagtgta cctccagagc gagacgaagg gaaaaaaaaa atcccgttac agctgctaat 360

tgcgctcttg tatctaggcc ggcctgggcc tcctttgcca gaagcccact ggagcccagt 420

ag 422

<210> 4

<211> 36

<212> DNA