本发明属于水产养殖微生物检测技术领域，具体涉及一种检测高致病性副溶血弧菌的LAMP-LFD方法。
背景技术：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemo lyticus，简称VP)最早是由Fujino等于1953年从日本一个食物中毒患者中初次分离得到的，是一种革兰氏阴性嗜盐菌，常呈多态性，有鞭毛，无英膜和芽孢。副溶血弧菌分布于世界各地，通常广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中，是海水养殖中有极大危害的病原弧菌之一，可感染大黄鱼(Pseudosciaena crocea)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、真鲷(pagrosomus major)、石斑鱼(Epinephelus sp.)、南美白对虾(Litopenaeus vannamei)、文蛤(Meretrix mertrix)等大多数海水养殖动物。南美白对虾感染高致病性副溶血弧菌后体色呈白浊微红，多数肝胰腺肿大，质地松软，颜色呈淡白或淡黄色；发病期间，通常在趴伏于池塘边坡上，失去食欲，空肠空胃，该病发展十分迅速，死亡率和排塘率极高，从发病到排塘，最短仅2-3天，严重威胁对虾养殖业，2013年全球养殖对虾产量预计较2012年减少23％，其中泰国下降约50％，我国下降约17％。为有效控制副溶血弧菌病原的发生扩散，准确即时的检测手段是预防控制该菌传播的关键所在。
目前对副溶血弧菌常用的检测方法有生化鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等。但是这些方法在快速检测、定性和精确定量方面难以兼顾，并且传统方法费时费力，对于需要检测大量样本的出入境检疫、食品、卫生以及兽医部门的实验室是一种沉重的负担。且PCR检测方法需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。2000年，日本科学家Notomi等发明了一种全新的核酸扩增方法——环介导等温扩增技术(LAMP，loop-mediated isothermal amplification)。该法在等温条件下(60-65℃)就能完成扩增反应，它可以在1h内于恒温条件下特异地扩增DNA到109个拷贝，在保持PCR技术优点的基础上，进一步缩短了检测时间，现已在其他研究领域广泛地应用于病原菌的快速检测。然而，LAMP技术存在也存在着易发生交叉污染出现假阳性，特异性较差的缺点。横向流动试纸条技术(LFD，lateral flow dipstick)是一种新的试纸检测技术。此检测技术可以与LAMP技术通过单克隆抗体技术等免疫学方法有机结合，反应中异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，并与胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体结合形成三元复合物，结合在横向流动试纸条技术具有生物素抗体的检测线上；未杂交的异硫氰酸荧光素标记探针与胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体形成不含生物素的两元复合物，通过检测线，结合在控制线上。因此可以通过观察试纸条上显示，判断LAMP是否有扩增产物。该检测方法避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，并进一步提高了反应的特异性和灵敏度，且操作简便安全。
目前，该技术在对虾白斑病毒(WSSV，White spot syndrome virus)、鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV，Infectious spleen and kidney necros is virus)等养殖动物病毒性病原的检测上得到初步应用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种操作简便、检测快速准确、结果判断明显的检测高致病性副溶血弧菌的LAMP-LFD方法。
为了解决上述问题，本发明提供了一种检测高致病性副溶血弧菌的LAMP-LFD方法，其特征在于包括以下步骤：
a.根据高致病性副溶血弧菌的pVPA3-1质粒序列设计下述LAMP的两对引物核心和一条探针序列：
F3外引物：5’-CCAAATACACCAAATTAGTACAGAA-3’ 25
B3外引物：5’-AAATCATCATCGAGAATAAGCT-3’ 22
FIP内引物：5’-CTTGTTGGCTCACATGAACTCC-ATACAATTACAGTAACATGAATCCG-3’ 47
BIP内引物：5’-AAGAAAAATACCCGGCCAGC-AAGTGAGTGATATAGTGCGAC-3’ 41
探针HP：5’-GTCATACTGGCAGCA AGGAGT-3’ 21
FIP内引物的5′端标有Biotin标记，在探针HP的5′端标标有FITC标记；
b.LAMP反应体系配置如下：包含20 mmol/L Tris-HCI，pH为8.8，10 mmol/L KCI，6.5 mmol/L MgSO4，10 mmol/L (NH4)2SO4，0.1％ Tween-20，0.8 mol/L Betaine，1.4 mmol/L dNTPs，1.6 μmol/L内引物，0.2 μmol/L外引物，8 U Bst DNA聚合酶，1 μl DNA模板，无菌双蒸水补至25 μl；
c.LAMP扩增反应：将上述反应体系进行扩增，反应温度为60-65℃，反应时间为20-60min；
d.LFD检测：扩增后在反应体系中加入20 pmol的探针HP，65℃杂交5min。反应结束后，取8 μl扩增产物，滴加到样品垫上，将LFD试纸条的样品垫向下竖立于含有100 μl缓冲液的酶标板中，15-30min后记录判读区的检测结果。
本发明具有如下有益效果：用LAMP-LFD方法能特异性检测出高致病性副溶血弧菌，且对高致病性副溶血弧菌纯培养物的检测灵敏度是常规PCR检测方法的1000倍；所用的引物根据高致病性副溶血弧菌六个不同区域设计，且有特异性探针，特异性比常规PCR要强；从DNA提取到检测完成，该方法可在2h内即可完成，比常规PCR方法节省2-3h；仪器设备要求低，仅一台水浴锅即可完成检测，检测结果肉眼观察即可判断，且检测过程中无需EB等有毒试剂。因此，LAMP-LFD检测方法安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，适合于现场快速检测，有利于检测和控制养殖过程中高致病性副溶血弧菌的感染和爆发。
附图说明
图1为本实施例中图1 LAMP引物设计示意图。
图2为LAMP反应的最适温度分布图。
图3为LAMP反应的最适时间分布图。
图4为LAMP特异性试验结果分布图。
图5(a)和图5(b)PCR(A)和LAMP(B)灵敏度试验结果分布图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例：
1、材料：高致病性副溶血弧菌是由本实验室从南美白对虾肝胰腺中分离并保存。核酸检测试纸条购买自杭州优思达生物技术有限公司。
2、细菌培养及基因组DNA的制备，将实验室保存的副溶血弧菌在Zobell 2216E固体培养基中进行斜面划线，28℃过夜培养，传代培养。细菌基因组DNA的制备采用试剂盒法(生工生物工程(上海)有限公司)完成，提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
3、LAMP引物设计：以NCBI上公布的高致病性副溶血弧菌的pVPA3-1质粒序列(登陆号KM067908)为目的基因序列，利用在线软件Primer Explorer V4设计用于LAMP扩增的4条特异性引物，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP。在内引物FIP的5′端标记生物素(Biotin)；利用Oligo7设计探针HP：5’-GTC ATA CTG GCA GCA AGG AGT-3’(位于F2和F1之间，见图2)，在HP的5′端标记异硫氰酸荧光素(FITC)用于LFD杂交试验(表1、图1)，以上引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
表1 引物序列：
4、LAMP反应条件的确定：LAMP反应体系包含20 mmol/L Tris-HCI(pH 8.8)，10 mmol/L KCI，6.5 mmol/L MgSO4，10 mmol/L (NH4)2SO4，0.1％ Tween-20，0.8 mol/L Betaine，1.4 mmol/L dNTPs，1.6 μmol/L内引物，0.2 μmol/L外引物，8 U Bst DNA聚合酶，1 μl DNA模板，无菌双蒸水补至25μl。阴性对照管不加DNA模板。反应混合物在一定温度下温育后，经80℃热激5min终止反应，利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。分别在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃进行LAMP反应，确定适宜的反应温度；设置20min、30min、40min、50min、60min五组不同的反应时间进行LAMP反应，确定适宜的反应时间。
5、横向流动试纸条检测：利用优化后的LAMP反应体系，使用经生物素标记的FIP进行LAMP反应，不经过终止反应，在反应体系中加入20pmol的探针HP，65℃杂交5min，再80℃终止反应。结束后，取8 μl扩增产物，滴加到样品垫上，将核酸检测试纸条的样品垫向下竖立于含有100 μl缓冲液的酶标板中，15-30 min后记录判读区的检测结果。
6、LAMP-LFD的特异性分析：为了验证LAMP-LFD反应的特异性，防止非特异反应的发生，本研究选择水产品中的常见病原菌用于检测LAMP-LFD的特异性试验，除高致病性副溶血弧菌外，还包括哈维氏弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、恶臭假交替单胞菌及鳗弧菌等5种病原菌，利用试剂盒法提取基因组DNA，以它们的基因组DNA分别作为模板，按照上述优化步骤中选择的最适反应时间和反应温度进行LAMP-LFD反应，重复实验三次，通过检测扩增结果，来验证LAMP-LFD反应特异性。
7、LAMP-LFD的灵敏度分析：高致病性副溶血弧菌原始浓度(约200 ng/μL)的基因组DNA进行10倍梯度，分别作为模板，按照上述步骤进行LAMP-LFD扩增。同时在相同模板浓度下，进行常规PCR扩增。重复实验三次。PCR扩增引物为F：5’-TCA CCC GAA TGC TCG CTT GTG G-3’；R：5’-CGT CGC TAC TGT CTA GCT GAA G-3’。PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 60sec，25～30个循环，72℃ 10min。
8、LAMP反应的优化
a.反应温度的优化
依次设置温度梯度为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃验证LAMP反应的最佳反应温度，如图2所示，62℃～65℃温度下都能发生反应，当65℃时条带最亮，所以选择65℃为最适反应温度。图2中，M：DNA Marker，1、2均为60℃，3、4均为61℃，5、6均为62℃，7、8均为63℃，9、10均为64℃，11、12均为65℃，其中1、3、5、7、9、11是以高致病副溶血弧菌的基因组DNA为模板做阳性反应管，2、4、6、8、10、12是以灭菌双蒸水为模板做阴性对照反应管。
b.反应时间的优化
依次设置反应温度为20min、30min、40min、50min、60min验证LAMP反应的最佳反应时间，如图3所示，在30min～60min都能发生反应，当60min时条带最亮，所以选择60min为最适反应时间。图3中，M：DNA Marker，1、2均为20min，3、4均为30min，5、6均为40min，7、8均为50min，9、10均为60min，其中1、4、5、8、10是以高致病副溶血弧菌的基因组DNA为模板做阳性反应管，2、3、5、7、9是以灭菌的双蒸水为模板做阴性对照反应管。
c.LAMP-LFD的特异性检测
按照优化的LAMP反应条件，进行LAMP扩增反应，扩增产物用横向流动试纸条检测。由图4可知，高致病性副溶血弧菌呈现阳性反应，其他5种病原菌均为阴性反应，水作为阴性对照也无条带。说明本研究建立的LAMP检测方法特异性较高。图4中，M：DNA Marker，1：阴性对照，2-7模板分别为高致病性副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、恶臭假交替单胞菌及鳗弧菌。
d.LAMP-LFD的灵敏度检测
将原始浓度(约200 ng/μL)的高致病性副溶血弧菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，分别进行PCR反应和LAMP-LFD反应，结果如图5所示，PCR法可检测到的最低模板浓度约为2ng/μL(稀释度为10-2)，但电泳条带亮度较弱，肉眼观察不易识别，易造成误判；LAMP-LFD法可检测到的的最低模板浓度约为2×10-3 ng/μL(稀释度为10-5)。由此可见，LAMP-LFD法具有很高的灵敏度，图5中，M：DNA Marker，1：阴性对照，2-8分别为稀释度100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，上述假设的这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。