本发明属于水稻多样性分析的分子标记技术领域，具体涉及一种用于粳稻遗传多样性分析的SSR标记、分析方法及应用。
背景技术：
黑龙江省土壤有机物含量较高，昼夜温差大，日照时间长，是世界上最寒冷的稻作区，也是我国粳稻的主要种植区。种植面积和产量逐年上升，2015年，种植面积超过400万hm2，产量达到2200万吨，是中国最重要的商品稻谷生产基地。黑龙江省五常和方正产区盛产的稻米是中国知名品牌和地理标志保护产品，但这些产区的水稻品种鉴定、种子纯度和真实性鉴定、品种权保护和水稻生产加工安全层面上与发达国家仍存在较大差异，存在假冒伪劣和以次充好的严重市场问题。因此，对黑龙江省主栽粳稻品种进行鉴定和原产地保护，可以大大提高品牌的真实性，促进稻米市场健康运行，提供优质和营养的粳米产品。
DNA指纹图谱技术为水稻品种的区别鉴定提供了一种高效、精准的方法。构建水稻DNA指纹图谱对水稻育种、鉴定、区试品种监控和种子管理等具有重要意义。美国、日本、韩国等国家早已构建了水稻品种的DNA指纹图谱。我国四川、辽宁、浙江、安徽等省市也完成了对历年推广和参加省区试的水稻品种DNA指纹图谱的构建。因此，深入了解黑龙江省主栽水稻育成品种的遗传多样性对开发新的种质资源、合理利用优异亲本等具有重要意义。
由于SSR分子标记具有操作简便快捷、重复性好、数量丰富且多态性检出率高等特点，已广泛应用于DNA指纹图谱构建、遗传多样性分析、品种纯度与真实性的鉴定。Sarao等(Sarao N K,Vikal Y,Singh K,et al.SSR marker-based DNA fingerprinting and cultivar identification of rice(Oryza sativa L.)in Punjab state of India[J].Plant Genetic Resources,2010,8(1):42～44)利用75对SSR标记引物对印度栽培的14个水稻品种进行了遗传性分析。Akagi等(Akagi H, Yokozeki Y,Inagaki A,et al.Highly polymorphic microsatellites of rice consist of AT repeats,and a classification of closely related cultivars with these microsatellite loci[J].Theoretical and Applied Genetics,1997,94(1):61～67)利用20个SSR标记对59个日本粳稻品种的遗传多样性进行分析。在中国，肖小余等(肖小余,王玉平,张建勇,等.四川省主要杂交稻亲本的SSR多态性分析和指纹图谱的构建与应用[J].中国水稻科学,2006,20(1):1～7)利用24对SSR标记引物对四川省42个主推杂交水稻品种进行了DNA指纹图谱构建和品种鉴定研究。李小华等(李小华,叶胜海,赵小燕,等.浙江省46个粳稻新品种SSR指纹图谱构建及遗传多样性分析[J].浙江农业学报,2014,26(5):1158～1163)采用农业部推荐的12对水稻SSR引物对2008年以来由浙江省主要育种单位育成的46个常规粳稻品种构建DNA指纹图谱，并分析其亲缘关系。
上述学者虽然水稻进行了基于SSR标记的遗传性进行了分析，但选用的品种中范围较小，未能全面反映主栽品种，并且由于不同地区的水稻品种基因和表型的差异，使现有技术中缺乏一种能够全面反映黑龙江省水稻遗传多样性的 SSR标记。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供的一种用于粳稻遗传多样性分析的 SSR标记、分析方法及应用，在分析黑龙江省查哈阳地区、建三江地区、五常地区、方正地区和响水地区的50个主栽粳稻品种多样性有良好的应用前景。
本发明提供了一种用于粳稻遗传多样性分析的SSR标记，包括RM297，位于1号染色体第32093949位；RM71，位于2号染色体第8761504位；RM85，位于3号染色体第36287160位；RM5414，位于4号染色体第2021760位； RM274，位于5号染色体第26661876位；RM190，位于6号染色体第1764638 位；RM336，位于7号染色体第21818658位；RM72，位于8号染色体第6757363 位；RM219，位于9号染色体第7887585位；RM311，位于10号染色体第9347372 位；RM209，位于11号染色体第17767906位；RM19，位于12号染色体第2432080 位。
本发明还提供了一种利用权利要求1所述的SSR标记分析粳稻遗传多样性的方法，包括以下步骤：
S1，水稻样品的基因组DNA提取和PCR扩增；
其中RM297对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2；RM71 对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4；RM85对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6；RM5414对应的扩增引物编号为SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO.8；RM274对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.9-SEQ ID NO. 10；RM190对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12；RM336对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14；RM72对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16；RM219对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18；RM311对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20；RM209对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.22；RM19 对应的扩增引物编号为SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.24；
S2，将上述PCR扩增得到的扩增产物进行毛细管电泳，得到具有多态性的等位基因；
S3，利用软件分析水稻间的遗传相似系数与遗传距离；聚类分析水稻品种；建立DNA指纹图谱。
本发明还提供了一种所述的SSR标记在分析黑龙江省查哈阳地区、建三江地区、五常地区、方正地区和响水地区的50个主栽粳稻品种多样性的应用。
与现有技术相比，本发明提供一种用于粳稻遗传多样性分析的SSR标记、分析方法及应用，具有以下有益效果：
本发明以黑龙江省50份主栽粳稻为材料，利用NY/T 1433-2007(中华人民共和国农业部.NYT 1433-2007水稻品种鉴定DNA指纹方法.2007)推荐的 12对首选SSR引物进行遗传多样性分析及构建DNA指纹图谱。
常规的PCR产物鉴定主要是凝胶电泳，是基于电场力作用利用凝胶通道使分子发生迁移，以染色条带记录结果；本发明利用毛细管电泳技术评价基于SSR 标记的PCR产物，毛细管电泳技术则是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，以电压信号强度记录结果，比凝胶电泳方法更为高效。因此，提高了结果的准确性，并为黑龙江省粳稻品种资源鉴定和原产地保护提供技术支持。
附图说明
图1为50个粳稻样品分布品种和对应的地区图；
图2为50个水稻品种的聚类分析图；
图3为50个水稻品种的DNA指纹图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，50个主栽粳稻分别源于黑龙江省五个地区的种质资源保持中心，其中查哈阳地区采集11个品种，建三江地区采集12个品种，五常地区采集4个品种，方正地区采集12个品种，响水地区采集11个品种，黑龙江省五个水稻主产区的50个粳稻样品分布品种和对应的地区图如图1所示，图1 中查哈阳地区在图1中对应的编号为ChaHaYang(1)，建三江地区在图1中对应的编号为JianSanJiang(2)，五常地区在图1中对应的编号为WuChang(3)，响水地区在图1中对应的编号为XiangShui(4)，方正地区在图1中对应的编号为FangZheng(5)。
本发明提供的一种用于粳稻遗传多样性分析的SSR标记，包括RM297，位于1号染色体第32093949位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为 SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2；RM71，位于2号染色体第8761504位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4；RM85，位于3号染色体第36287160位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6；RM5414，位于4号染色体第2021760位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8；RM274，位于5号染色体第26661876位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10；RM190，位于6号染色体第1764638位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12；RM336，位于7号染色体第21818658位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为 SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14；RM72，位于8号染色体第6757363位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16； RM219，位于9号染色体第7887585位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18；RM311，位于10号染色体第9347372 位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为SEQ ID NO.19-SEQ ID NO. 20；RM209，位于11号染色体第17767906位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.22；RM19，位于12号染色体第 2432080位，对应的扩增引物在核苷酸序列表中的编号为SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.24。12个SSR标记在水稻染色体中的位置及其引物序列如表1所示。
表1 12个SSR标记在水稻染色体中的位置及其引物序列
基于同一种发明构思，本发明还提供了一种利用上述SSR标记分析粳稻遗传多样性的方法，包括以下步骤：
S1，水稻样品的基因组DNA提取和PCR扩增
S11，基因组DNA提取：50个水稻种子在30℃恒温恒湿培养箱中发芽至3 叶期，取叶尖后，采用修订的的CTAB方法提取和纯化DNA，-20℃保存备用。
S12，PCR扩增：进一步合成荧光引物，在表1中的12对引物中的每对引物中随机选择1条引物的5’加FAM/HEX/Tamra等标记。
PCR扩增体系为10μL，反应液中包括0.3μL正向引物(10μM)，0.3μL 反向引物(10μM)，2μL 5×PCR Buffer，1μL Enhancer，0.8mmol/L dNTP(10 mM)，0.12μL Taq DNA聚合酶，1ng DNA模板，用ddH2O补足10μL。
PCR反应程序：运行touch down PCR，PCR反应程序如表2，不同引物的退火温度(Tm)如表1，共40个循环。
表2Touch down PCR程序
S2，将上述PCR扩增得到的扩增产物进行毛细管电泳，得到具有多态性的等位基因；
使用3730XL测序仪对S12中PCR扩增得到的产物进行毛细管电泳，利用 Genemarker中Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。
经毛细管电泳共检测到40个等位基因，平均每对引物扩增到3.3个等位基因，具有良好的多态性。标记RM72在所有水稻品种中检测到的等位基因数最多，为11个等位基因，而RM85、RM209和RM274检测到的等位基因数最少，为1个等位基因。标记RM297和RM219检测到5个等位基因，标记RM5414 和RM336检测到4个等位基因，RM71、RM190、RM311和RM19检测到2 个等位基因。
本发明的SSR标记多态性如下：
利用POPGENE version 1.32软件计算SSR引物的遗传距离(Genetic distance，GC)、遗传相似系数(Genetic distance，GD)、多态性频率(Polymorphism frequency，PF)、等位基因数(Number of alleles，Na)、有效等位基因数(Effective number of alleles，Ne)(Kimura and Crow(1964))、多态性信息含量值 (Polymorphism information content，PIC)、尼尔森基因多样性(Nei's(1973)gene diversity，h)、香农多样性系数(Shannon’s diversity index，I)，利用Originpro version 9计算主成分分析。
上述12个SSR标记的多态性频率PF值变化范围是0～0.667，平均值为 0.234。各标记的多态性存在着一定的差异性，RM72和RM219标记的PF值大于0.5000，多数标记的PF值介于0～0.667之间。而RM274、RM311、RM209 三个标记的PF值均为0，在50个水稻品种中没有等位基因多态性。
SSR标记的多态性信息量PIC值范围为0.093～0.493，平均值为0.266。染色体RM72和RM19具有最大的PIC值(0.493)，其次是染色体RM311(0.467)，染色体RM297和RM71具有PIC值最小(0.093)。50个品种的SSR标记多态性不丰富，表现为黑龙江省水稻品种的遗传多样性水平相对较低。
有效等位基因数(Ne)范围为1.000(RM72)～1.779(RM19)，平均值为1.341。尼尔森遗传多样性(h)范围为0～0.442，平均值为0.204。香农信息指数(I)范围为0～0.608，平均值为0.319。
表3 12对引物的多态性信息
2、5个水稻产区间的遗传相似系数与遗传距离
5个水稻产区间的遗传相似系数与遗传距离的信息统计如表4所示，群体间遗传相似系数变化范围为0.850～0.982，平均值为0.928。建三江地区和查哈阳地区水稻品种之间的遗传相似性最高(0.982)，而五常地区和查哈阳地区水稻品种之间的遗传相似性最低(0.850)。结果表明，遗传变异较小，5个地区水稻品种遗传相似性较高，遗传基础狭窄。
表4 5个水稻产区间的遗传相似系数与遗传距离
注：右上三角为各群体间遗传相似系数，左下三角为各群体间遗传距离，****表示该单元格内没有数据。
3、聚类分析水稻品种
利用OriginPro软件经Nearest Neighbor和Euclidean计算得到50个粳稻品种聚类分析图，如图2所示，以相似系数3.4为界值，可以将50个品种分为八类。水稻品种间的聚类分析结果如表5所示。根据基因相似系数，可将黑龙江省五个粳稻产区的水稻进行进一步区分，其中第Ⅰ类包含种类最多有12个品种，第Ⅲ类最少只有3个品种，五常地区的全部四个品种分布在一个区域，响水地区5个和方正地区4水稻品种分别全部在第Ⅳ和Ⅷ类(如表5所示)。结果显示黑龙江粳稻基因信息含量复杂，但具有地理标志的五常大米可以准确的进行鉴定。
表5水稻品种间的聚类分析结果
注：“-”表示数据为0。
4、建立DNA指纹图谱
根据首选的12对水稻引物扩增和毛细管电泳测定的结果，以0/1的方式记录多态性片段的有无，构建了50个品种的DNA指纹图谱，如图3所示，其中黑色部分表示有该条带，空格部分表示无该条带。图3中1-40号条带对应的片段大小分别为217bp、252bp、121bp、148bp、162bp、165bp、173bp、175bp、 182bp、185bp、188bp、191bp、197bp、200bp、203bp、84bp、118bp、120bp、 123bp、189bp、193bp、195bp、199bp、201bp、151bp、181bp、189bp、191bp、 193bp、195bp、164bp、298bp、148bp、154bp、160bp、163bp、97bp、99bp、 111bp、113bp。
黑龙江省粳稻种植面积和产量均居全国第一位，由于独特的地理位置和自然条件，稻米品质和营养闻名全国，因此，对黑龙江省粳稻的种质资源进行鉴定和保护研究尤为重要。借助分子标记的方法对稻米的基因多样性进行分析和评价，保证了黑龙江粳稻的真实性，可以维护稻米品牌，为消费者带来保障。同时，稻米种质资源的改进和育种技术的提升，不仅使稻米食用品质和种植效益大大提升，也导致了名优品种基因多样性的复杂。
本发明通过对50中粳稻品种的多样性分析研究表明，利用SSR标记鉴定北方水稻的研究已经广泛流行，实验中的平均Ne和PIC分别为1.341和0.266，低于已有的报道，显示出北方水稻具有较低的基因多样性。因此，有必要通过选择适当的育种方式增加黑龙江省典型粳稻的基因多样性。由于地理分布、积温不同和种植差异等也可能导致水稻基因多样性增加。因此，研究中的稻花香和龙粳系列在不同种植地区出现明显的基因差异，如五常地区的四个DHX品种和响水地区的五个品种，各地区的LJ和KD等。研究显示，早期东北水稻品种大多选育自日本，现在的东北水稻品种经过杂交育种后，基因和遗传距离仍然较窄，因此，应适当引入精英基因和加强适于当地种植条件的育种途径进行黑龙江省优质粳稻的种质改进，更应考虑接入稻米营养品质和感官特性的基因，提高基因的多样性和稻米的食用品质。
利用本发明的12对SSR引物进行水稻DNA指纹鉴定已有报道，并成功构建了279个品种的DNA指纹图谱数据库，证明这些引物在构建水稻品种特异性和年度间试种一致性鉴定是可行的。同样，本研究中利用这12对引物也可将黑龙江省主栽50种水稻进行区分，遗传距离结果显示，五常地区与其他地区差异性较大，但总体上遗传距离较窄。SSR品种鉴定技术能够检测到DNA水平上一些细微的差异。但是一些在形态特征上有明显差异的品种，可能在较少引物的鉴别中扩增带型相同，即所选引物不一定保证能够鉴别开。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 用于粳稻遗传多样性分析的SSR标记、分析方法及应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tctttggagg cgagctgag 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgaagggtac atctgcttag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctagaggcga aaacgagatg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggtgggcga ggtaataatg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccaaagatga aacctggatt g 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcacaaggtg agcagtcc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accatggttc aagagtgaaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acagctcaac ctgttgagtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cctcgcttat gagagcttcg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cttctccatc actcccatgg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctttgtctat ctcaagacac 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttgcagatgt tcttcctgat g 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cttacagaga aacggcatcg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gctggtttgt ttcaggttcg 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccggcgataa aacaatgag 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcatcggtcc taactaaggg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgtcggatga tgtaaagcct 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
catatcggca ttcgcctg 18
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tggtagtata ggtactaaac at 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcctatacac atacaaacat ac 22
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
atatgagttg ctgtcgtgcg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
caacttgcat cctcccctcc 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
caaaaacaga gcagatgac 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctcaagatgg acgccaaga 19