本发明属于细胞工程领域，特别是属于兽用生物制品领域，更为具体的说是涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体和应用。
背景技术：
牛传染性鼻气管炎( Infectious bovine rhinotracheitis, IBR) 是由牛传染性鼻气管炎病毒( Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV) 引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病。IBRV又称牛疱疹病毒1型、坏死性鼻炎病毒和传染性脓疱外阴-阴道炎病毒。该病以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征，还可引起生殖系统损害, 出现流产和死胎以及发生肠炎和小牛脑炎等症状, 有时也发生眼结膜炎和角膜炎。继发性的细菌感染能导致更严重的呼吸道疾病。
我国规定, 进出口牛及其肉制品必须检测IBRV, 这使得该病的检测方法迅速发展起来。实践中对于该病的检测首先要结合流行病学和临床检查做出初步诊断, 然后再根据实验室方法做出确切的判断。
对于牛传染性鼻气管炎病毒的检测，传统方法多为血清学方法，如中和试验、间接血凝试验等。这些方法存在着不同程度的缺点，或灵敏度不高，或需要时间较长。PCR是目前检测牛传染性鼻气管炎病毒比较快速、灵敏、简单的方法之一，特别是对牛传染性鼻气管炎病毒潜伏感染的确诊，特异性强，还可做活体检查，但假阳性率较高。除了初步建立的PCR方法，目前国内尚未见有其他抗原诊断方法的报道，为此，开展牛传染性鼻气管炎病毒抗原诊断方法的研究，为我国牛传染性鼻气管炎病毒流行病学调查，提供一种良好的抗原检测手段，对今后疫病的防控和消灭都具有重大意义。
作为实验室诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。
目前国内外针对IBRV的单克隆抗体制备及利用相关单克隆抗体进行IBRV检测的方法研究还未见报道。因此制备得到能稳定分泌抗牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞，对于商品化开发生产快速、敏感的IBRV检测方法具有重要意义，是快速、敏感IBRV检测方法研究的坚实基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株能稳定分泌抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明中能稳定分泌抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株5F9，已于2016年8月31日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，其保藏编号是：CGMCC No.12700。
在本发明中所述的杂交瘤细胞株5F9的制备方法是：由纯化的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)为抗原免疫BALB/c小鼠，细胞融合后，用间接IBRV-ELISA和细胞间接免疫荧光进行筛选获得能稳定分泌抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的细胞株。该细胞株体外传代培养稳定，培养上清ELISA效价为10000，染色体数目为99条。
并且，本发明保护由所述杂交瘤细胞株5F9产生的单克隆抗体。
进一步地，在本发明中保护由所述杂交瘤细胞株5F9产生的单克隆抗体制备得到的抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆荧光抗体。
这一荧光抗体的制备方法是将前述方法获得的抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体与异硫氰酸荧光素（FITC）结合而成。
其具体的制备方法是：利用小鼠体内诱生法制备单克隆抗体，提前7~10天用弗氏不完全佐剂腹腔接种8~10周龄SPF级雌性Balb/c小鼠进行预处理，将处于对数生长期的杂交瘤细胞腹腔接种小鼠，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，小鼠腹部明显隆起时采集腹水，离取中间淡黄色上清液即为单克隆抗体。
在本发明中同时保护所述杂交瘤细胞株5F9产生的单克隆抗体及由该单克隆抗体制备的得到的单克隆荧光抗体在检测牛传染性鼻气管炎病毒中的应用。
应用方式主要包括两种，一种是利用该单克隆抗体建立间接免疫荧光方法，此方式主要适用于杂交瘤细胞株5F9产生的单克隆抗体；另一种是利用该单克隆抗体制备的单克隆荧光抗体建立直接免疫荧光检测方法，可进一步组装免疫试剂盒、免疫试纸条、免疫试剂等，这一方式主要适用于由杂交瘤细胞株5F9产生的单克隆抗体制备得到的荧光抗体；
其中，在第二种方式中，检测方法是以FITC标记的5F9单克隆抗体作为检测抗体。优选的检测条件为以下任意一项或者多项条件：（1）抗原固定剂为80%丙酮+20%甲醇和10%甲醛，（2）固定温度为-20℃，（3）固定时间为30分钟，（4）标记抗体工作浓度为1：100；（5）最佳抗体孵育时间为45 min。
本发明通过筛选获得能稳定分泌抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并以该细胞株分泌的单克隆抗体制备形成相关单克隆荧光抗体，进而建立了快速、敏感的IBRV检测方法。对于我国进出口牛及其肉制品IBRV检测具有重要意义。
附图说明
图1为显微镜下5F9杂交瘤细胞形态；
图2为5F9培养上清的抗原特异性反应荧光图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中涉及到的杂交瘤细胞株5F9，已于2016年8月31日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，其保藏编号是：CGMCC No.12700，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1 杂交瘤细胞的建立、鉴定和传代
1、病毒抗原液的制备
（1）病毒的增殖 将IBRV NM株病毒接种单层MDBK细胞，待CPE达80%时收获病毒液。按Spearman Karber公式计算获得的IBRV NM株病毒TCID50/mL为108.5。
（2）病毒的浓缩纯化 对收获的病毒液用0.45µm滤膜过滤去除细胞碎片，取滤过液35000 r/min超速离心2 h，沉淀悬浮于适量的PBS缓冲液（pH 7.2）中，4℃过夜使其充分溶解，然后把病毒溶液小心加入到蔗糖梯度离心管上层液面，蔗糖密度梯度自上而下分别为25%，45%，65%，不同蔗糖梯度间要求界面明显，25000 r/min离心2 h，用弯头长针小心吸出位于45%～65%蔗糖之间的白色病毒层面，溶解在35mL PBS缓冲液中，再35000 r/min超速离心2 h，取沉淀溶解在1mL PBS中，此溶液即为浓缩纯化后的病毒液，将收集的纯化抗原液通过0.22μm滤膜过滤除菌，于-20℃冻存。
（3）病毒的灭活及检验 加入3nM的BEI，混合均匀，置37℃灭活36小时，期间不停搅拌，置2-8℃保存，应不超过30日。取灭活病毒液原液接种75cm2方瓶MDBK单层细胞，37℃感作1h，再加入细胞生长液，同时设一瓶MDBK细胞对照，在37℃，5%CO2培养箱中培养72h，观察CPE，应该没有CPE出现。盲传1代，37℃继续培养72h，观察CPE，应无CPE出现，则判灭活检验合格。
（4）病毒蛋白含量测定 用分光光度计测定病毒蛋白含量，蛋白浓度的计算公式为：蛋白浓度(mg/mL)=(1.45×D280nm-0.74×D260nm)×稀释倍数。测得纯化后IBRV NM株的蛋白含量为4.84mg/mL。
（5）动物免疫 首免用纯化的IBRV NM株与弗氏完全佐剂乳化后，腹腔注射免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠，二免与三免分别于首免后的第14 d和第28 d进行，均用弗氏不完全佐剂乳化，三免后第14 d 断尾采血分离血清，检测血清的抗体效价。融合前3 d经尾静脉注射强化免疫1次。
2、 细胞融合及杂交瘤细胞的筛选与纯化
（1）融合前24 h取健康BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞制备饲养细胞，37℃培养，按常规方法无菌制备脾细胞，与SP2/0细胞在PEG作用下进行细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养7~10d。当有融合细胞集落出现时，更换HT培养基继续培养。当融合细胞集落长满孔底的1/3~1/2时，用间接ELISA检测其上清液。方法如下：
①包被 用抗原稀释液将纯化的IBRV NM株稀释到10ug/ml的浓度，充分混匀，每孔包被量100μl，将加注包被液的微孔板2~8℃包被过夜。
②洗涤 以0.01mol/L pH值为7.4的PBST作洗涤液，每孔300μl，室温作用2~3分钟，重复5次，拍干至无水印为止。
③封闭 用含5％脱脂奶粉的PBST，注入微孔板中，37℃孵育1小时，按照1.2.3.2方法洗涤。
④加检测样品，每孔100μl，37℃孵育0.5小时，以免疫小鼠血清作阳性对照，免疫前血清作阴性对照。按照1.2.3.2方法洗涤。
⑤以PBST作1：5000倍稀释HRP标记羊抗小鼠IgG酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育0.5小时，按照1.2.3.2方法洗涤。
⑥显色 每孔加显色剂50μl，37℃避光作用15分钟。
⑦终止 每孔加终止液50μl，于酶标仪450nm波长下读值。
⑧结果判定 以阳性A值≥1.0，阳性A值/阴性A值>2.1时为阳性判定标准。
（2）取ELISA检测阳性细胞孔上清再用细胞间接免疫荧光试验（IFA）进一步检测，方法如下：
①细胞的培养与准备：MDBK细胞，胰蛋白酶消化后，以含6%新生牛血清的DMEM培养基分散，调整细胞密度1.5×105个/ml，按照100μl/孔加到96孔细胞培养板各孔中，37℃，5%CO2条件下，培养12~24h，使其长成单层。
②病毒接种：病毒用DMEM培养基稀释至一定稀释度，充分混匀后，用多道移液器加至单层细胞各孔，设阴性细胞对照。
③孵育 37℃，5%CO2培养箱内培养48~60小时。
④固定 弃96孔细胞培养板各孔培养液于废液缸（含氢氧化钠），清空板内液体，用PBS，200L/孔清洗1次。在各孔内加入预冷固定剂100L/孔，迅速将板子置于-20C作用30min，室温自然晾干。
⑤清洗 在各孔内加入PBS，200 L/孔，清洗1次。
⑥按工作浓度，以PBS稀释抗病毒的阳性血清或单克隆抗体，以多道移液器每孔加入50µl，37℃湿盒内温育45分钟~1小时，同时设阴性对照（未接毒孔）和空白对照（接毒孔，一抗加PBS孔）。
⑦清洗 在各孔内加入PBS，200 µL/孔清洗2次。
⑧按工作浓度，以PBS稀释荧光标记的二抗，以多道移液器每孔加入50µl，37℃湿盒内温育45分钟~1小时。
⑨清洗 在较暗环境中用PBS，200 µl/孔，清洗3次。
10结果判定 在荧光显微镜下，阳性细胞呈特异性荧光，染色细胞应为胞浆着色，细胞轮廓清晰可辨，阴性细胞对照孔和空白对照应无特异性荧光，只要有一个细胞被染色，即可判定检测样品为阳性，否则记为“阴性”。
ELISA和IFA检测都是阳性的单克隆孔即可确认为阳性细胞克隆株。将筛选到的阳性细胞克隆株克隆化，直至所有单克隆细胞孔检测阳性率为100%时，方可确定获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将获得的杂交瘤细胞克隆株分别进行扩大培养，并冻存于液氮中。
5、 杂交瘤细胞株的鉴定
（1）细胞形态观察：用含10%新生牛血清的DMEM细胞培养液，37℃、5%CO2培养箱培养2h即可轻轻着壁，24h可长满单层。显微镜下观察细胞形态。杂交瘤细胞形态如图1所示。
（2）纯净性检测：按现行《中国兽药典》附录进行检测，无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。
（3）染色体分析：选取处于细胞对数生长期的杂交瘤细胞，加入0.08μg/ml秋水仙素在37℃温箱中。37℃继续培养8~10h。收集分裂细胞，1000r/min 离心10min。吸除上清，加入预温至38℃的0.075mol/L的KCl溶液10ml，在温箱内静止20~30min。然后向悬液中加入新鲜配制的醋酸-甲醇固定液（1：3）1.0ml，用吸管吹打均匀，使细胞表面轻微固定，从而防止固定时细胞粘连成块。然后经1000r/min离心10min，吸去上清。加上述固定液5~10ml，轻轻吹打均匀，置室温固定15~20min。然后离心，吸除上清，再重复固定1次。将上述细胞离心，仔细吸去上清，留固定液约0.5ml，将细胞混匀。取冷载玻片1张，在约30cm高度向载玻片滴细胞悬液1~2滴，然后置室温中令其自然干燥。用姬姆萨染色。取母液姬姆萨1份，用（PBS pH6.8）9份稀释，染色10min。然后水洗，晾干。在油镜下进行染色体记数分析，5F9杂交瘤细胞平均染色体数目为99，符合SP2/0细胞与脾细胞的染色体数目之和，证明5F9杂交瘤细胞为SP2/0与脾细胞融合而成。
（4）分泌单克隆抗体的活性：取杂交瘤细胞培养上清，做1：10，1：100，1：1000，1：10 000，1：100 000，1：1000 000系列稀释，用间接IBRV-ELISA检测。5F9杂交瘤细胞的培养上清的ELISA效价≥1: 10000。
（5）分泌单克隆抗体的特异性
抗原交叉反应试验：取杂交瘤细胞培养上清，对BVDV、IBRV感染的MDBK细胞进行间接免疫荧光检测，筛选的杂交瘤传代培养上清应仅与IBRV特异反应。结果显示5F9培养上清仅与IBRV特异性反应，有较强的特异性荧光，呈现显著阳性，MDBK细胞和SP2/0细胞培养上清作阴性对照均成立，结果见图2。
与不同IBRV分离株的交叉反应：取杂交瘤传代的培养上清，对不同IBRV分离毒株：IBRV Bartha Nu 67株，IBRV LN株感染的MDBK单层细胞进行间接免疫荧光检测，筛选的杂交瘤传代培养上清应能与这些IBRV分离毒株反应。结果显示5F9能与IBRV-M、IBRV-LN、IBRV Bartha Nu 67特异性反应，有较强的特异性荧光，呈现显著阳性，MDBK细胞和SP2/0细胞培养上清作阴性对照均成立，结果见表1。
表1 5F9单抗与不同IBRV分离株的交叉反应结果
分泌单克隆抗体的稳定性：体外传代培养，每隔5代取培养上清用间接免疫荧光检测，每隔10代冻存复苏取培养上清检测1次，继续传至30代，间接ELISA检测培养上清。结果显示杂交瘤细胞可以稳定分泌单克隆抗体。
6、杂交瘤细胞传代培养方法：选生长3日已形成单层的细胞，用吸管轻柔把细胞从瓶壁上吹打下来，使之分散成单个细胞，按1:5~1:6分散率将细胞传到新的细胞瓶中，补加生长液，于37℃培养，24~48小时形成良好的单层。
实施例2 单克隆抗体的制备与检验
1、 单克隆抗体腹水的制备
（1）BALB/c小鼠的预处理 选择8~10周龄SPF级BALB/c小鼠，接种IBR杂交瘤细胞前7~10天对BALB/c小鼠腹腔接种弗氏不完全佐剂，0.5ml/只。
（2）杂交瘤细胞的培养及处理 将长满单层的IBR杂交瘤细胞，弃去营养液，吹散均匀，按1:3~1:5比例传代，于37℃、含5%CO2培养箱中培养24~48h处于对数生长期，收集IBR杂交瘤细胞，1000r/min离心10min，用PBS（pH值7.4，0.01mol/l）调整IBR杂交瘤细胞密度为5~10×106个/ml。
（3）杂交瘤细胞的接种及腹水收集 对预处理的BALB/c小鼠腹腔接种IBR杂交瘤细胞，0.5ml/只。当小鼠腹腔明显隆起时采集腹水，2~8℃静置过夜，8000r/min离心10min，弃上层油脂和膜物质、下层细胞碎片等杂质，IBR单克隆抗体主要存在于中间淡黄色或淡红色液体中，加入防腐剂Proclin300至终浓度为0.02％，分装后于-70℃以下保存。
2、单克隆抗体腹水的检验
（1）性状 淡黄色液体。
（2）纯净 按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌、霉菌污染。
（3）抗体效价检测 取IBR单克隆抗体腹水做1:4000，1:5000，1:6000，1:7000，1:8000......系列稀释，进行间接免疫荧光检测，IBR单克隆抗体腹水的抗体效价为1：100000。
3、单克隆抗体的纯化
（1）油脂、膜物质和细胞碎片的去除 在漏斗中垫上足量的玻璃纤维（取时带手套），加入腹水，收集过滤后的腹水，最后用戴手套的手挤压玻璃纤维以获得所有样品；在室温(15～25℃) 条件下，将过滤后的腹水于20000g离心30 min，取上清，弃沉淀中的膜物质和细胞碎片。
（2）杂蛋白的去除取1份腹水加入2份醋酸缓冲液（PH值4.8，0.06 mol/l），调pH值至4.8；按每毫升腹水加33μl正辛酸的比例在室温(15～25℃)搅拌下逐滴加入正辛酸，室温(15～25℃)条件下混匀30min；2~8℃静置至少2h，20000g离心35min，取上清液；若上清液中仍存在沉淀，重复离心一次。
（3）硫酸铵沉淀 按照上清液体积的1/10加入PBS(10X，pH值7.2，0.1 mol/l)，调pH值至7.2；在冰水浴中按0.277～0.310g/ml将硫酸铵慢慢加入腹水中，边加边搅拌，至45%～50%饱和度，冰水浴中混匀30min，2~8℃静置至少2h，20000g离心1h，弃上清。
（4）透析除盐 用适量PBS溶解沉淀，混匀后装入透析袋中，在2~8℃条件下用1000倍体积的PBS（pH值7.4，0.01 mol/l）透析24~48h，期间更换缓冲液至少3次，20000g离心10min，除去不溶性沉渣，加入5%体积甘油，分装于-70℃以下冻存。
实施例3 单克隆抗体的标记
1、1mg/mL FITC溶液的配制 按1mg FITC粉剂加1mL碳酸盐缓冲溶液(PH值9.0，0.1mol/l)的比例混匀，蜗旋至完全溶解，此溶液必须现用现配，5min内用完。
2、搅拌法标记 按照1mL IgG溶液(5mg/mL)加250uL FITC溶液(1mg/mL)的比例，向纯化的单克隆抗体中逐滴加入FITC溶液(1mg/mL)，边加边搅拌（90rpm/min），室温(15～25℃)避光轻柔搅拌2h。
3、游离荧光素的去除 使用葡聚糖G-25M柱子去除游离荧光素，分管收集洗脱液。用紫外分光光度计280nm波长检测每管洗脱液的吸收值，可见有2个洗脱峰，偶联物出现在第一个洗脱峰；汇集主要的偶联物，收集A280≥0.4的洗脱液。
实施例4 牛传染性鼻气管炎病毒直接免疫荧光检测方法的建立及检测试剂盒组装
1、牛传染性鼻气管炎病毒直接免疫荧光检测方法的建立
（1）细胞的培养与准备：MDBK细胞，胰蛋白酶消化后，以含6%新生牛血清的DMEM培养基分散，调整细胞密度1.5×105个/ml，按照100μl/孔加到96孔细胞培养板各孔中，置于37℃，5%CO2培养箱内培养12~24h，使其长成80~90%单层。
（2）病毒的接种：取待检病毒，用含2%新生牛血清的DMEM培养基稀释病毒至100TCID50/50µl，按50µl/孔加至相应细胞孔。置于37℃，5%CO2培养箱内培养48~60小时，并设阴性细胞对照。
（3）洗涤 0.01mol/L PH7.4的PBS清洗1次，200L/孔，室温静止2~3分钟，甩掉洗液。
（4）固定 弃96孔细胞培养板各孔培养液于废液缸（含氢氧化钠），清空板内液体，用PBS清洗1次。在各孔内加入预冷抗原固定剂100ul/孔，迅速将板子置于-20℃作用30分钟。弃掉固定液，室温自然干燥。其中所述的抗原固定剂为80%丙酮+20%甲醇和10%甲醛。
（5）洗涤方法同步骤（3）。
（6）按工作浓度用PBS稀释FITC标记的5F9单克隆抗体，按50µl/孔加至相应细胞孔。本荧光抗体在使用前5分钟内配制，避免强光线直射，最好在较暗的环境中进行。其中所述标记抗体工作浓度为1:100。
（7）孵育 37℃避光水浴孵育45分钟。
（8）PBS洗涤3次，方法同步骤3。
（9）结果判定 荧光显微镜下观察，阳性孔有特异性荧光，染色细胞轮廓清晰，胞浆着色，阴性对照孔应无特异性荧光，凡有不少于1个荧光细胞的孔，即判为“阳性”，否则判为“阴性”。
2、基于直接免疫荧光方法的检测试剂盒的组装
（1）添加保护剂 按1g小牛血清白蛋白溶解于100ml荧光抗体半成品的比例混合均匀，再加入防腐剂Proclin300至终浓度为0.02％，0.45µm过滤。
（2）分装 无菌分装于灭菌棕色管中，2~8℃保存。
（3）成品的检验
①性状 本品为黄绿色透明液体，无臭、无味、无沉淀物。
②无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
③抗体效价检测 本品做1：100，1：200，1：300，1：400，1：500，1：600......系列稀释，对IBRV感染细胞进行直接免疫荧光检测，测定成品抗体效价。以荧光显微镜下可见特异性荧光的最大稀释倍数为成品的抗体效价。成品抗体效价为1：2000。
④敏感性检验 分别用103.0、102.0、101.0、1TCID50/ml四个稀释度的IBRV感染细胞进行成品的直接免疫荧光试验，测定荧光抗体的敏感性。所有稀释度的接毒细胞，CPE阳性孔全部检测到特异性荧光。
⑤特异性检验 对牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV1）、牛病毒性腹泻2型病毒（BVDV2）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛副流感3型病毒（PIV3）感染的MDBK细胞进行直接免疫荧光试验，测定成品的特异性。成品仅与IBRV感染细胞发生特异性反应，与BVDV1、BVDV2、PIV3都不反应。
实施例5 牛传染性鼻气管炎病毒间接免疫荧光检测方法的建立
1、细胞的准备 MDBK细胞经胰蛋白酶消化后，用含6%马血清的DMEM培养基分散，调整细胞密度为2.0×105个/ml，加到96孔细胞培养板中，0.1ml/孔，置37℃、含5%CO2培养箱中培养16h~20h，使其长成70%～90%MDBK细胞单层。
2、病毒接种 用含3.5%马血清的DMEM培养基将BVDV NM01株稀释至103.0TCID50/ml，接种已长成良好MDBK细胞单层的96孔细胞培养板，0.1ml/孔，同时设阴性细胞对照。置37℃、含5%CO2细胞培养箱中培养48h~72h。
3、洗涤 弃液，用PBST（含0.5‰Tween-20的PBS，pH值7.4，0.01 mol/l）洗涤1次，200ml/孔。
4、固定 加入4%甲醛，0.1ml/孔，25±1℃下固定10min，弃液。
5、洗涤 方法同3。
6、通透 每孔加入0.5% TritonX-100 0.1ml，25±1℃下作用10min，弃液。
7、洗涤 方法同3。
8、加样 将样品接种上述96孔细胞培养板，设PBS为对照，0.1ml/孔，置37℃湿盒中孵育45～60min，弃液。
9、洗涤 用PBST（含0.5‰Tween-20的PBS，pH值7.4，0.01 mol/l）洗涤2次，200ml/孔。
10、加二抗 每孔加入用1% BSA的PBS（pH值7.4，0.01mol/l）稀释至工作浓度（0.0025mg/ml）的羊抗鼠荧光抗体（二抗）0.1 ml，置37℃湿盒中孵育45～60min，弃液。
11、洗涤 方法同9。
12、观察 在荧光显微镜下，PBS对照孔无特异性荧光，IBR杂交瘤细胞培养上清染色细胞可见特异性荧光，染色细胞为胞浆着色，细胞轮廓清晰可辨。