本发明涉及生物制剂的
技术领域：
，尤其涉及一种从海洋球石藻中提取神经酰胺的方法。
背景技术：
：海洋球石藻(coccolithophores)是一类单细胞海洋微型浮游植物，隶属于定鞭藻门(haptophyta＝prymnesiophyta)定鞭藻纲(prymnesiophyceae)。海洋球石藻代谢产物中富含多种生物活性物质，如二十二碳六烯酸(dha)、聚酮类化合物等，尤其是海洋微藻细胞中总脂含量最高可达细胞干重的50％，其中鞘脂类含量可达到细胞干重的0.914％，而其中99％为神经酰胺。神经酰胺具有良好的抑菌、抗炎、抗肿瘤等生物功能，在食品、化妆品及医药领域具有广阔的应用前景。但目前有关海洋球石藻神经酰胺类物质领域的研究较少。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从海洋球石藻中提取神经酰胺的方法，本案由此产生。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种从海洋球石藻中提取神经酰胺的方法，旨在通过薄层层析法、硅胶柱层析法、凝胶柱层析法、制备型薄层ptlc等方法对海洋球石藻石油醚相提取物的神经酰胺进行分离、纯化，以便于后续大规模化生产神经酰胺。为了解决上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种从海洋球石藻中提取神经酰胺的方法,依次以：用石油醚进行萃取；用反相硅胶柱进行层析；用葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20进行层析；用正相硅胶柱进行层析；用ptlc制备的方法从海洋球石藻中提取神经酰胺。作为实施例的优选方式，上述提取神经酰胺的方法具体包括以下步骤：步骤一、制备海洋球石藻石油醚相萃取物：以石油醚为萃取剂进行萃取处理，合并萃取液，减压浓缩得到海洋球石藻石油醚相萃取物；海洋球石藻生长至稳定期，收获，冷冻干燥获得海洋球石藻藻粉，用质量分数75％的乙醇浸提，获得乙醇浸膏，加入等体积的石油醚和水，反复萃取，收集石油醚相，合并、减压浓缩至干，获得海洋球石藻石油醚相萃取物；步骤二、反相硅胶柱层析制备神经酰胺粗品：将获得的海洋球石藻石油醚相萃取物以反相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到神经酰胺粗品；作为实施例的优选方式，将海洋球石藻石油醚相萃取物用适量的分析纯甲醇溶解后，进行反相硅胶柱层析；依次用体积比为95:5；90:10；85:15；80:20；70:30；60:40；50:50；40:60的乙酸乙酯/石油醚洗脱液进行洗脱，每个梯度洗脱100ml，流速控制为2ml/min，每10ml收集1管，60℃真空干燥，初步用tlc分析流出物，合并神经酰胺高浓度流分段，减压浓缩至干，获得神经酰胺粗品；步骤三、葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20层析制备神经酰胺一次精品：将获得的神经酰胺粗品以葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到神经酰胺一次精品；作为实施例的优选方式，将上述神经酰胺粗品用适量甲醇溶解后，上葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20，用体积比为1:1的氯仿：甲醇进行洗脱，流速控制6-10秒/滴，使用自动收集器收集各馏分，每30min收集一管，初步用tlc分析流出物，合并132至146管的馏分，减压浓缩至干，获得神经酰胺一次精品；步骤四、正相硅胶柱层析制备神经酰胺二次精品：将获得的神经酰胺一次精品以正相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到神经酰胺二次精品；将神经酰胺一次精品经过正相硅胶柱层析用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后用石油醚和乙酸乙酯进行洗脱，流速控制6-10秒/滴，石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:1，收集馏分，合并10-16管，减压浓缩至干，获得神经酰胺二次精品；步骤五、ptlc制备神经酰胺：将获得的神经酰胺二次精品进行ptlc，点样、展开，刮板，样品回收，保存于-20℃，得到神经酰胺纯品；将神经酰胺二次精品经过ptlc，最终得到神经酰胺；采用高效薄层层析板，在体积比为19:0.9:0.1的氯仿/甲醇/醋酸展开剂中展开，采用显色剂喷雾显色，用刀片刮取中间部分，合并，用甲醇溶解，高速离心，收集上清液，减压浓缩至干，最终得到神经酰胺。作为实施例的优选方式，所述显色剂为质量体积分数g/ml为1％的茜素-乙醇溶液。一种神经酰胺在制备肝癌抑药剂中的应用。由于本发明系统采用了上述的技术方案，使得本实用性具有以下有益效果：本发明首次采用薄层层析法、硅胶柱层析法、凝胶柱层析法、制备型薄层等方法对海洋球石藻石油醚相提取物的神经酰胺进行了分离、纯化，以便为后续大规模生产神经酰胺奠定基础。附图说明图1为本发明神经酰胺tlc的图；图2为本发明神经酰胺的结构图；图3为本发明化合物神经酰胺的1h-nmr的核磁谱；图4为本发明化合物神经酰胺的13c-nmr核磁谱；图5为本发明化合物神经酰胺的高分辨质谱图。具体实施方式实施例1一种从海洋球石藻中提取神经酰胺的方法本发明揭示了一种从海洋球石藻中提取神经酰胺的方法,依次以：用石油醚进行萃取；用反相硅胶柱进行层析；用葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20进行层析；用正相硅胶柱进行层析；用ptlc制备的方法从海洋球石藻中提取神经酰胺。作为实施例的优选方式，上述提取神经酰胺的方法具体包括以下步骤：步骤一、制备海洋球石藻石油醚相萃取物：以石油醚为萃取剂进行萃取处理，合并萃取液，减压浓缩得到海洋球石藻石油醚相萃取物；(海洋球石藻生长至稳定期，收获，冷冻干燥获得海洋球石藻藻粉18.6706g，用75％的乙醇浸提获得乙醇浸膏，加入等体积的石油醚和水，反复萃取，收集石油醚相，合并、减压浓缩至干，获得海洋球石藻石油醚相萃取物5.2613g步骤二、反相硅胶柱层析制备神经酰胺粗品：将获得的海洋球石藻石油醚相萃取物以反相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到神经酰胺粗品；将5.2613g海洋球石藻石油醚相萃取物用体积尽量少的分析纯的甲醇溶解后，进行反相硅胶(180g)柱层析；依次用95:5；90:10；85:15；80:20；70:30；60:40；50:50；40:60(v/v)的乙酸乙酯/石油醚洗脱液进行洗脱，每个梯度洗脱100ml，流速控制为6-10秒/滴，每10ml收集1管，60℃真空干燥，初步用tlc分析流出物，合并神经酰胺高浓度流分段，减压浓缩至干，获得神经酰胺粗品；步骤三、葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20层析制备神经酰胺一次精品：将获得的海洋球石藻神经酰胺粗品以葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到神经酰胺一次精品；将神经酰胺用少量甲醇溶解后，上葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20，用氯仿:甲醇(1:1)进行洗脱，流速控制6-10秒/滴，使用自动收集器收集各馏分，每30min收集一管，初步用tlc分析流出物，合并132至146管的馏分，减压浓缩至干，获得神经酰胺一次精品；步骤四、正相硅胶柱层析制备神经酰胺二次精品：将获得的神经酰胺一次精品以正相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到神经酰胺二次精品；将神经酰胺一次精品经过正相硅胶柱层析用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后用石油醚和乙酸乙酯进行洗脱，收集石油醚:乙酸乙酯＝1:1的馏分，合并10-16管，减压浓缩至干，获得神经酰胺二次精品；步骤五、ptlc制备神经酰胺：将获得的神经酰胺二次精品进行ptlc，点样、展开，刮板，样品回收，保存于-20℃，得到神经酰胺纯品；将神经酰胺二次精品经过ptlc，最终得到神经酰胺；采用高效薄层层析板，在氯仿/甲醇/醋酸(19:0.9:0.1)展开剂中展开，1％茜素一乙醇进行喷雾显色，结果如图1所示，用刀片刮取中间部分，合并，用甲醇溶解，高速离心，收集上清液，减压浓缩至干，最终得到神经酰胺。采用核磁共振方法对上述获得的神经酰胺的结构进行解析，如图2-5所示，分别为神经酰胺的结构图、1h-nmr的核磁谱、13c-nmr的核磁谱、高分辨质谱图。如表1所示，为化合物神经酰胺的波谱数据。表1化合物神经酰胺的波谱数据no13c1h114.10.92222.71.39332.22.114-2029.71.322136.92.2722173.9‐2354.53.99，3.752462.53.962574.74.3626128.85.5827134.45.832832.32.0729-3729.71.303825.81.683922.71.394014.10.926.26c25-oh实施例2细胞毒活性实验a.细胞冻存：配制10％dmso小牛血清冻存液；取对数期生长的lo2、hepg2细胞，用胰蛋白酶消化单层生长细胞；1000rpm离心5min；移除上清，加入新的冻存液；分装于冻存管中，标好名称、时间；将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，迅速取出冻存管，移入液氮中冻存。b.细胞复苏：从液氮中取出细胞冻存管，37℃水浴中迅速解冻，控制这个过程在1分钟之内；吸出细胞悬浮液至离心管中并加入10倍培养基，轻轻混匀；1000rpm离心5min；倒掉上清液，重复洗一次，血球计数板计数，静置co2培养箱37℃培养；次日更换培养基继续培养。c.mtt法检测细胞活力：本实验所选的肿瘤细胞为肝癌细胞系hepg2和正常肝细胞lo2。用胰酶消化对数生长期的肿瘤细胞，加入新鲜培养液后用血球计数板计数，调整好细胞浓度后接种于96孔板，置于37℃co2培养箱内培养24h。将神经酰胺配制成浓度为20μg/ml的药液，每个浓度三个平行实验，以顺铂为阳性对照。每孔中加入20μlmtt溶液，37℃培养4h。去除上清，每孔加入dmso150μl。37℃摇床培养2小时，在酶标仪490nm处测定光密度(od490)值，计算抑制率。抑制率％＝(1-实验组平均od值/对照组平均od值)×100％。表2神经酰胺对lo2(正常)和hepg2(肝癌)细胞的抑制率如表2所示，细胞毒活性实验表明，神经酰胺对hepg2肝癌细胞的抑制效果较强，高达62.64％。以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。当前第1页12