本发明涉及一种手性复合材料的制备，尤其涉及一种多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖手性材料的制备，用于手性界面的构筑及手性识别色氨酸对映异构体，属于手性复合材料制备技术和电化学手性识别领域。
背景技术：
手性界面的构筑是手性电化学传感器制备的关键。近年来，报道了许多新的手性识别试剂，如牛血清蛋白、血红蛋白、人血清蛋白、dna、氨基酸及其衍生物、纤维素、壳聚糖和环糊精。天然多糖的独特手性结构，天然多糖得到了学多学着的关注，尤其β-环糊精、淀粉、纤维素和改性壳聚糖。像dna这样具有二维双螺旋结构对于手性识别是非常有利的，手性界面的设计是手性传感器制备过程中的一个挑战。
1933年，easson和stedman提出了三点作用力模型，根据此模型，设计手性界面是一项重要的工作。手性选择试剂的手性位点设计在手性界面设计中发挥了很大的作用。目前，改性壳聚糖得到了很多学者的关注，比如，羟丙基改性的土豆淀粉和磺化壳聚糖都改变了手性微环境。孔泳教授课题组报道了一种基于磺化壳聚糖的手性电化学传感器，对比实验发现，壳聚糖磺化后对色氨酸的识别效率大幅度提升。
碳纳米管复合材料具有优异的导电性和成膜性，已经被广泛应用于手性传感平台的构建。另外，碳纳米管已经商业化，不仅性能稳定、容易获取，而且碳纳米管的功能化较为便利。x.q.chen采用微波法制备了基于碳纳米管的壳聚糖手性复合材料，利用该材料制备的手性电化学传感器能够实现对色氨酸的手性识别。2017年报道的多壁碳纳米管-羟丙基壳聚糖纳米复合材料，由于羟丙基的引入，壳聚糖的水溶性得到改善，羟丙基壳聚糖对扁桃酸的识别效率1.48。所以基于碳纳米管纳米复合材料的手性电化学传感器研究是很有意义的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖手性复合材料的制备方法；
本发明的另一目的是提供一种上述多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖手性复合材料在手性识别色氨酸对映异构体中的应用。
一、多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖手性复合材料的制备
本发明多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖手性复合材料的制备方法，包括以下工艺步骤：
（1）羧基化多壁碳纳米管(mwcnts-cooh)的制备：将多壁碳纳米管置于浓硫酸-浓硝酸混合酸中，于80~90℃回流2~3h，稀释后过滤，洗涤，真空干燥，即得羧基化多壁碳纳米管mwcnts-cooh；混合酸中，浓硫酸与浓硝酸的体积比为1:0.3~1:0.5。
（2）氨基化多壁碳纳米管(mwcnts-ea)的制备：以水为溶剂，二环己基碳二亚胺（dcc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）作为交联剂，羧基化多壁碳纳米管(mwcnts-cooh)与乙二胺（ea）在70~80℃回流45~50h，离心，乙醇洗涤，真空干燥，得到氨基化多壁碳纳米管(mwcnts-ea)。
羧基化多壁碳纳米管(mwcnts-cooh)与乙二胺（ea）的质量比为1:20~1:25。
交联剂二环己基碳二亚胺（dcc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的总加入量为加入量为氨基化多壁碳纳米管(mwcnts-ea)质量的3~4倍；交联剂二环己基碳二亚胺（dcc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的质量比为1:1~1:1.5。
（3）n-羧甲基壳聚糖(nccs)的制备：在以水为溶剂，乙醛酸与壳聚糖在常温下搅拌3.5~4h进行缩合，再加入硼氢化钠，在20~25℃下连续搅拌10~12h进行还原，然后离心，用乙醇-水的混合液洗涤，真空干燥，得到n-羧甲基壳聚糖(nccs)。
乙醛酸与壳聚糖的质量比为1:5~1:6；壳聚糖与硼氢化钠的质量比为1:0.4~1:0.5。
（4）多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖(mwcnts-ea-nccs)的制备：在n,n-二甲基甲酰胺中，在交联剂ddc和nhs存在下，氨基化多壁碳纳米管(mwcnts-ea)与羧甲基化壳聚糖nccs在室温下交联反应20~24h，离心、水洗、真空干燥，得到产物目标产物mwcnts-ea-nccs。
氨基化多壁碳纳米管(mwcnts-ea)和羧甲基化壳聚糖nccs的质量比为1:2~1:2.5；交联剂二环己基碳二亚胺（dcc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的总加入量为羧甲基化壳聚糖质量的6~8倍；交联剂二环己基碳二亚胺（dcc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的质量比为1:1.2~1:1.5。
二、多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖手性复合材料的表征
1、红外光谱图
图1为壳聚糖cs（a）、n-羧甲基壳聚糖nccs（b）、羧基化多壁碳纳米管mwcnts-cooh（c）、氨基化多壁碳纳米管mwcnts-ea（d）、多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖mwcnts-ea-nccs（e）的红外光谱图。图中，在1154cm-1，1083cm-1，1021cm-1，889cm-1分别出现了cs的特征吸收峰。当壳聚糖的氨基上接枝羧基时，1335cm-1出现了一个显的-nh-伸缩振动峰，其次，3400cm-1出现了羧基的特征吸收峰与羟基吸收峰重叠。2931cm-1是ch2的非对称伸缩振动峰，2851cm-1是ch2的对称伸缩振动峰。1582cm-1和1320cm-1吸收峰略有增强，说明氨基上有少部分的羧甲基化。曲线c中，碳纳米管羧基化以后吸收峰明显增强，1730cm-1处的吸收峰是羧基的c=o伸缩振动引起的，1390cm-1and3429cm-1出的吸收峰是-oh振动引起的，2924cm-1是ch2的非对称伸缩振动峰，1629cm-1处c=c和c=o伸缩振动峰相互重叠，1394cm-1是-oso3h的伸缩振动和羧基的o-h弯曲振动峰。当ea接枝到碳纳米管上mwcnts-ea，1610cm-1是伯胺n-h弯曲振动吸收峰；1256cm-1是伯醇的吸收峰消失；1159cm-1被1063cm-1处的c-o吸收振动峰重叠，1159cm-1；1159cm-1和898cm-1处的吸收峰为壳聚糖糖苷键的特征吸收峰。当accs接枝与氨基化碳纳米管时，1627cm-1出现了一个新的吸收峰，推测是-nhco-生成。其次，在1407cm-1和1077cm-1分别出现了accs的特征吸收峰，推测accs接枝到了碳纳米管上。
2、xps分析
xps是表征材料表面化学组成的重要手段，通过检测电子结合能来实现对表面元素的定性分析。图2为mwcnts-ea(a)和mwcnts-nccs(b)复合材料光电子能谱图全谱图。图2中，分别在284.2ev、399.5ev和532.7ev出现了碳、氧和氮峰。mwcnts-ea中c、n和o元素分别是90.25%，4.55%和5.20%。mwcnts-nccs复合材料中o元素的比例上升到9.6%，说明nccs成功接枝到mwcnts。图3为mwcnts-ea(a)、mwcnts-nccs(b)的c1sxps分峰谱图。在图3（a）xps的c1s谱图中，284.7ev出现了c=c峰，285.7ev出现了c-c峰，其中，在285.7ev出现了c-nh2峰，这是mwcnts-cooh与ea发生酰胺化反应的结果，由此可见，ea通过共价键被接枝到了碳纳米管上。在图3（b）xps的c1s谱图中，287.8ev出现了o=c-nh峰，说明mwcnts-ea与nccs生成酰胺键。由此可见，nccs通过共价键被接枝到了氨基化碳纳米管上。
3、电扫描显微镜
利用电扫描显微镜表征mwcnts-ea和mwcnts-ea-nccs的形貌。图4为扫描电镜图mwcnts-cooh(a)和mwcnts-ea-nccs(b)复合材料的电扫描显微镜图。从图4可知，羧基化碳纳米管呈现网络交织分布状态，羧基化后分散性改善，碳纳米管羧基化后有断面出现，氨基化碳纳米管分散性有明显改变，碳纳米管表面比较光滑，在羧基化碳纳米管管表面嫁接羧甲基壳聚糖后，碳纳米管的分散性得到提高，管径有明显的增加，个别地方有堆积现象，说明羧甲基壳聚糖成功嫁接到碳纳米管表面。
三、手性复合材料识别trp对映异构体
1、手性电化学传感器的构建：将玻碳电极(gce)表面用氧化铝浆料进行抛光后用超纯水进行清洗，在氮气氛下干燥；将6μlmwcnt-nccs手性复合材料的水分散液滴涂到电极表面，在红外灯下干燥即得。
2、手性识别trp对映异构体
利用上述构建的手性电化学传感器，在含有5.0mm[fe(cn)6]4−/3−的pbs缓冲溶液里，采用循环伏安法（cv）对trp异构体进行手性识别。mwcnts-ea-nccs手性传感器识别trp的最佳条件为ph=6.0、最佳温度为20℃，响应时间300s。
图5为裸电极（a）、mwcnts-ea滴涂的玻碳电极（b）、mwcnts-cs滴涂的玻碳电极（c）及mwcnts-nccs滴涂的玻碳电极（d）在含有5.0mm[fe(cn)6]4−/3−的pbs缓冲溶液里（ph=6.0）对色氨酸对映异构体的手性识别cv图。由图a可以看出，玻碳电极经过打磨后，在铁氰化钾溶液里呈现准可逆的氧化还原峰，表明玻碳电极表面达到洁净化的要求。裸玻碳电极界面没有手性环境，对于trp对映异构体没有识别效果。采用滴涂法在裸玻碳电极表面6μl的mwcnts-ea，氧化峰电流明显提高，主要是氨基化碳纳米管优异的导电性能加速电子转移。但是由于缺少手性位点，对于trp对映异构体没有识别效果（如图b所示）。而将mwcnts-cs复合材料滴涂于玻碳电极表面，由于壳聚糖提供了手性位点，手性识别效率id-trp/il-trp=1.27，显而易见，cs的手性识别效率比较低（如图c所示）。当cs上引入羧基时，生成了亚氨基，有利于nccs与trp之间形成氢键，尤其亚氨基为手性识别发挥了一定的作用。l-trp通过氢键在mwcnts-cs表面很容易的形成稳定的薄膜，阻碍了[fe(cn)6]4−/3−的迁移，氧化还原电流下降，d-trp形成薄膜的速率和稳定性不如l-trp，响应电流强于l-trp，nccs对trp的手性识别效率2.11。说明该发明构建的手性电化学传感器wcnts-ea-nccs/gce对trp对映异构体具有很好的识别效果（如图d所示）。
3、手性电化学传感器对l-trp消旋体溶液的检测
图6为wcnts-ea-nccs/gce手性电化学传感器被用于l-trp和d-trp对映异构体的手性识别的cv曲线。其中trp对映异构体的比例按照0:100，20:80，40:60，60:40，80:20和100:0配制了消旋体溶液。通过对trp消旋体溶液检测发现，ip随着l-trp比例增加而下降。显然ip与l-trp%存在线性关系，回归方程为y=-0.53x+15.94，r2=0.9938。其中，x代表l-trp的百分比浓度，y代表响应电流μa。所以mwcnts-ea-nccs/gce能够用于检测l-trp消旋体溶液的检测。
综上所述，本发明先利用壳聚糖与乙醛酸反应在壳聚糖的氨基上准确的引入羧基得到nccs，同时采用交联试剂ddc\nhs，将羧基化碳纳米管与乙二胺交联，得到氨基化碳纳米管(mwcnts-ea)；再次采用交联试剂ddc\nhs，将nccs通过共价键接枝到氨基化多壁碳纳米管上，得到碳纳米管/n-羧甲基壳聚糖纳米复合材料(mwcnts-nccs)，最后采用滴涂法构建手性电化学传感器。本发明在壳聚糖的氨基上引入羧基，同时能得到亚氨基，壳聚糖的手性位点增加，有利于形成氢键，并且所形成的空间结构更有益于与l-色氨酸结合，从而提高对色氨酸（trp）对映异构体的识别效果。在mwcnts-ea-nccs的制备中，采用ddc\nhs交联试剂，避免了nccs的相互交联，保护了手性位点，进一步提高了对色氨酸（trp）对映异构体的识别效果。图7是本发明基于滴涂法制备的手性电化学传感器及其手性识别的机理图。
附图说明
图1为cs（a）、nccs（b）、mwcnts-cooh（c）、mwcnts-ea（d）、mwcnts-ea-nccs（e）的红外光谱图。
图2为mwcnts-ea(a)和mwcnts-nccs(b)复合材料光电子能谱图全谱图。
图3为mwcnts-ea(a)、mwcnts-nccs(b)的c1sxps分峰谱图。
图4为扫描电镜图mwcnts-cooh(a)和mwcnts-ea-nccs(b)复合材料的电扫描显微镜图。
图5不同修饰电极对trp的手性识别cv曲线。
图6为wcnts-ea-nccs/gce对trp对映异构体混合液的检测。
图7wcnts-ea-nccs/gce手性电化学传感器的制备及其手性识别的机理图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明一种用于识别色氨酸对映异构体的手性电化学传感器的构建方法作进一步说明。
实施例一、手性复合材料的制备
（1）羧酸化多壁碳纳米管(mwcnts-cooh)的制备：称取1.00g多壁碳纳米管放置于250ml圆底烧瓶中，加入120ml浓硫酸和40ml浓硝酸，在90℃回流3h，稀释后过滤洗涤，真空干燥，即得。
（2）乙二胺-羧酸化多壁碳纳米管(mwcnts-ea)的制备：将1.0g羧酸化多壁碳纳米管(mwcnts-cooh)分散于20mlea（乙二胺）中，再加入1.4gdcc和0.9gnhs，在80℃回流48h，过滤，用乙醇洗涤，60℃下真空干燥8h，得到乙二胺-羧酸化多壁碳纳米管(mwcnts-ea)。
（3）n-羧甲基壳聚糖(nccs)的制备：将1.00g壳聚糖加入到50ml超纯水中，用醋酸溶液(1wt%)调节溶液的ph值，直至壳聚糖完全溶解后，利用氢氧化钠溶液调节混合液ph=5。然后加入6.0ml乙醛酸，搅拌反应4h。再用氢氧化钠溶液(10wt%)调节ph至9。最后加入0.50g硼氢化钠，在20℃下连续搅拌12h，过滤，用乙醇-水的混合液(醇水体积比4:1)多次洗涤，60℃下真空干燥12h干燥，得到n-羧甲基壳聚糖(nccs)。
（4）乙二胺-羧酸化多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖(mwcnts-nccs)的制备：将0.10gmwcnts-ea和0.20gnccs加入到10ml二甲基甲酰胺中超声分散后，加入0.65gddc和0.78gnhs，持续搅拌反应24h。过滤、水洗数次、在50℃下真空干燥12h，得手性复合材料——乙二胺-羧酸化多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖(mwcnts-nccs)。
实施例二、手性电化学传感器的构建和应用
1、手性电化学传感器的构建
本实验选择玻碳电极作为工作电极(gce，φ=3mm)，甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。玻碳电极在使用之前分别用三氧化二铝抛光粉打磨，氧化还原峰电位差值约等于70mv时，玻碳电极表面洁净化程度可以认为是可以接受的，分别用乙醇和超纯水超声，洗涤晾干保存待用。然后在氮气氛下干燥得到表面处理干净的玻碳电极(gce)。
然后将多壁碳纳米管-n-羧甲基壳聚糖（mwcnt-nccs）复合材料配置成浓度15mg/ml的水分散液，使用微型移液枪移取6μlmwcnts-ea-nccs分散液，涂到玻碳电极中心圆点位置，使用红外灯烤干，氮气吹扫，即得手性电化学传感器，低温保存待用。
2、手性电化学传感器识别色氨酸对映异构体
利用上述构建的手性电化学传感器，在含有5.0mm[fe(cn)6]4−/3−的pbs缓冲溶液里（ph=6.0），采用循环伏安法（cv），在温度20℃，响应时间300s下对trp异构体进行手性识别。氧化峰电流较高的为l-trp，氧化峰电流较底的为d-trp，从而实现对trp对映异构体的手性识别。nccs对trp的手性识别效率为2.11。