一种大蒜抗菌肽AR117及其应用的制作方法
本领域属于生物技术领域，具体涉及一种大蒜抗菌肽ar117及其应用。
背景技术：
病原菌可引起包括人类，牲畜，作物和其他生物的严重病害，造成严重的经济损失。引起植物病害的病原生物有五大类:真菌、细菌、病毒、线虫和寄生性种子植物,其中由细菌引起的植物病害仅次于由真菌和病毒引起的,位居第三。在迄今已鉴定出的1600多种细菌中,约有300种左右引起植物细菌性病害。已知由细菌引起的植物病害有500种以上,其中细菌性青枯病、软腐病和溃疡病等是世界性重要病害(廖咏梅,张君成,王忠文.植物病原细菌的分类地位及其在农科本科教学中的应用[j].广西农业生物科学,2007,(s1):191-195.)。植物细菌性病害在世界范围内引起严重的经济损失,如1976年美国31个州由43种细菌病害所造成的经济损失达20600万美元。
蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)在我国细菌性食物中毒中居前三位，是一种需氧、有芽孢、无荚膜、能运动的革兰氏阳性杆菌。该菌广泛存在于自然环境，是剩米饭、剩菜和凉拌菜等引起食物中毒的常见致病菌(刘淑惠.一起由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件的调查报告.医学动物防制.2016)。蜡样芽孢杆菌除引起食物中毒外，还可引发菌血症、心内膜炎、脑膜炎等(蒋荣荣.我国市售大米中食源性致病菌——蜡样芽孢杆菌的检测和致病性分析[d].武汉：武汉轻工大学,2013.)。然而其对18种抗生素存在不同程度的耐药，对杆菌肽b和磺胺甲亚唑两种药物的耐药率为100％，对苯唑西林、青霉素耐药率分别为96.2％(田万帆等.生鲜食品中蜡样芽孢杆菌毒力基因及耐药性研究[j].食品工业科技,2018)。所以急需寻找能够替代抗生素对抗蜡样芽孢杆菌的研究成果。
青枯病菌(ralstoniasolanacearum)属于假单胞菌属(pseudomonas)，它们生态适应性广，表型差异大，是一个非常异质的组群(彭炜.植物细菌性病害和病原细菌分类研究进展[a].2010:10.)。至今已发现可侵染44科近300多种植物,它引起的植物青枯病是一类毁灭性的土传病害。在我国主要农作物中马铃薯、番茄、烟草、茄子、辣椒、花生、姜、甘薯、木麻黄、桑、油橄榄、聚合草等均受青枯菌的为害,造成不同程度的损失。(卢同.我国作物细菌性青枯菌的研究进展[j].福建农业学报,1998,(02):34-41.)细菌性青枯病在高温多雨季节引起茄科植物的发病率达60％～100％,是茄科植物连作的限制因素。由于土传病害用化学药物难以控制,加之化防易产生抗药性,造成环境污染,因此，探究植物对这种病源的抗性机制，发现新的抗性基因具有深远意义。
番茄细菌性溃疡病菌(clavibatermichiganensissubsp.michiganense)属于棒形杆菌属。番茄溃疡病是一种维管束系统病害，从番茄育苗到收获期均可发生。是番茄生产中最为严重最具有毁灭性的病害之一。(赵廷昌,王振东.我国番茄细菌性病害研究概述[j].辽宁农业科学,1996,(02):30-34.)。目前番茄溃疡病在我国北京、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、新疆、河北、山西、山东、上海、海南等省、市、自治区都有发生，使许多地区番茄生产受到了不同程度的影响。因此，我国1995年将该病原菌列入《全国植物检疫对象名单),1997年列入《中国进境植物检疫潜在的植物危险性病、虫、杂草(三类有害生物)名录》(罗来鑫,赵廷昌,李健强,张乐,李勇,hasanbolkan.番茄细菌性溃疡病研究进展[j].)
据近年来多地的抽查，我国一些地区种植的葡萄、草莓、蔬菜等农作物产品因用药次数过多，病虫害的抗药性增加和农药残留等诸多问题以及大气、水域、食品的污染，使食品安全与环境安全的问题受到了广泛的关注。生物防治可以有效地克服这些弊端，对农业的可持续发展、农业生态环境的保护、食品安全的保障等提供了物质基础和技术支撑，因而生物农药越来越受到人们的重视。
抗菌肽是由基因编码在核糖体内合成的多肽，不同种类的抗菌肽通常有共同的特点:短肽(30～60个氨基酸)，强阳离子性(等电点范围为8.9～10.7)，热稳定性好(100℃，15min)，分子质量约为4ku，无药物屏蔽且不影响真核细胞。当今，抗菌肽已经可以由原核生物到人类的大部分有机生物体中成功分离和分类。抗菌肽通常作用于细菌，在真核生物的天然免疫方面发挥着重要作用，被认为是古代进化中哺乳动物体内有效保留的免疫分子(李冠楠,夏雪娟,隆耀航,李姣蓉,武婧洁,朱勇.抗菌肽的研究进展及其应用[j].动物营养学报,2014,26(01):17-25.)。
由于富含赖氨酸、精氨酸和组氨酸等碱性氨基酸,抗菌肽通常带有2～7个正电荷,等电点大于7,表现出较强的阳离子特征。抗菌肽一般都有两亲性结构,有1个疏水区域与脂质结合,1个带正电荷的亲水性区域与水或者带负电荷的残基结合。这些特性使得抗菌肽能够很好地与由两性分子构成、特别是呈电负性的细胞膜结合,这是抗菌肽与细菌细胞膜发生相互作用的结构基础(黎观红,洪智敏,贾永杰,瞿明仁.抗菌肽的抗菌作用及其机制[j/ol].动物营养学报,2011,23(04):546-555.(2011-03-30))。
由于全球抗生素药物的滥用，越来越多的细菌可能发展成为对传统抗生素耐药的菌株。人们迫切地寻找能够代替传统抗生素的药物，使得抗菌肽受到广泛的重视。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种大蒜抗菌肽ar117，所述的抗菌肽的氨基酸序列为seqidno.2所示，对应的优选的核苷酸序列为seqidno.1所示。
本发明的另一个目的在于提供了一种大蒜抗菌肽ar117的应用，包括利用该抗菌肽制备成生物抑菌剂。
为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：
申请人通过构建一个高质量的大蒜cdna文库，筛选能够使宿主细胞(wb800)自溶的基因，将出现自溶现象的菌株进行菌液pcr检测插入片段大小，提取质粒，重新转化wb800感受态细胞，pcr检测插入片段大小与之前相同，证明转化成功。在含卡那霉素的lb平板上再次划线，出现自溶现象，则表明自溶现象为插入基因引起。将其中自溶效果最好的菌株提取质粒，测序，最终获得抗菌肽ar117的核苷酸序列：
tacatgtatcgtgtgtgtgtaagcctttttaatggtatggatcatatagctgtcatgtatgtatatgtatgtttacataagggtatggattcgagcttgtta
对应的氨基酸序列如下：ymyrvcvslfngmdhiavmyvyvclhkgmdssll。
一种大蒜抗菌肽ar117的应用，包括利用本发明提供的抗菌肽制备成抑菌药物，或是制备成线虫抑菌剂，或制备成辣椒疫霉病抑菌剂。
以上所述的应用中，优选的，所述的抑菌药物为抑制番茄细菌性溃疡病菌、青枯病菌、炭疽杆菌、蜡状芽孢杆菌、小麦苗枯病菌、马铃薯环腐病菌或枯草芽孢杆菌的药物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明筛选出的大蒜抗菌肽，测序后在ncbi网站上对比基因序列，blast未发现相似性序列。将ar117基因与pbe-s分泌表达载体连接后，对ar117蛋白开展抑菌活性检测，发现ar117基因能有效抑制所有供试的革兰氏阳性细菌生长和一些革兰氏阴性细菌及真菌，特别是该抗菌肽对化学药物难以控制的番茄溃疡病菌、青枯病菌、小麦苗枯以及辣椒疫霉的生长具有较强的抑制作用，还能够抑制引起人食物中毒，腹痛、呕吐腹泻的蜡样芽孢杆菌和引起人炭疽病的炭疽杆菌。同时发现ar117基因能有效影响秀丽隐杆线虫的取食，溶血实验证明该基因虽对线虫有抑制作用，但对哺乳动物和人无害。该抗菌肽基因从大蒜中筛选，在后期研究中有望用于植物病虫害防治中的生物防治，或可作为抗菌、抗线虫药物应用。
附图说明
图1为筛选出的ar117自溶菌株与无自溶效果as118菌株生长不同时间后的菌株效果图；
其中图1中a为ar117菌株(左)和无自溶效果as118菌株(右)生长12h状态；图1中b为ar117菌株(左)和无自溶效果as118菌株(右)生长60h状态。
图2为抗菌肽ar117、wb800菌株蛋白和as118蛋白抑菌圈示意图。
对峙的指示菌共9种分别标注在图的下方，其中3号为ar117抗菌肽，1号和2号分别为wb800菌株蛋白和as118蛋白作为对照。
图3为抗菌肽ar117、wb800菌株蛋白和as118蛋白抑制辣椒疫霉平板示意图。
其中图中1号为抗菌肽ar117，2、3号和4号分别为wb800菌株蛋白和as118蛋白作为对照。
图4为在紫外灯下拍摄抗菌肽ar117和as118蛋白防治辣椒疫霉示意图。
其中图4中a为喷施as118蛋白后接种辣椒疫霉的烟草叶片，图4中b为喷施抗菌肽ar117后接种辣椒疫霉的烟草叶片。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
大蒜抗菌肽ar117的获得：
1)构建一个高质量的大蒜cdna文库，初步筛选能够使宿主细胞(wb800)自溶的基因：取-70℃保存的枯草芽孢杆菌大蒜cdna文库1700个菌株和wb800菌株解冻备用，在含kana的lb平板上划线处理，每12h观察结果，记录原本长势良好而后期出现自溶现象的菌株编号。
2)复筛：对于初筛有效果的菌株在含kana的lb平板上再次进行划线处理，每个菌株进行3个重复，每12h观察平板上长势，最终确定自溶效果稳定的菌株，如图1中a所示，在ar117号菌株和as118号菌株生长12h时均长势良好且表型相同，而在60h时如图1中b所示ar117号菌株发生了明显的自溶现象。
3)自溶菌株稳定性鉴定：将出现自溶现象的菌株进行菌液pcr检测插入片段大小，提取质粒，重新转化wb800感受态细胞，pcr检测插入片段大小与之前相同，证明转化成功。在含kana的lb平板上再次划线，出现自溶现象，则表明自溶现象为插入基因引起。
4)将其中自溶效果最好的菌株提取质粒，测序后在ncbi上blast比对，未比对到相似序列，ar117的核苷酸序列为：
tacatgtatcgtgtgtgtgtaagcctttttaatggtatggatcatatagctgtcatgtatgtatatgtatgtttacataagggtatggattcgagcttgtta
对应的氨基酸序列如下：
ymyrvcvslfngmdhiavmyvyvclhkgmdssll。
实施例2：
抗菌肽ar117的制备方法，包括以下步骤：
1)融合表达载体pbe-s-ar117的构建
用t4连接酶将ar117基因与含有nde1和xba1酶切位点的酶切后线性化pbe-s载体连接，获得目的基因融合表达载体pbe-s-ar117。
2)抗菌肽ar117表达与分离纯化
将测序正确的融合表达载体pbe-s-ar117质粒，用热激法转化到大肠杆菌hst08高效感受态细胞中扩增，提取质粒再转入wb800感受态细胞中获得pbe-s-ar117融合表达菌株wb800/ar117。利用组成型表达载体pbe-s的分泌表达特性，摇培lb(含kana)液体培养基72h获得wb800/ar117发酵液，离心获得上清并用硫酸铵饱和溶液析出蛋白，4℃过夜后离心，用磷酸盐饱和溶液溶解沉淀，于4℃透析48h，纯化后即得目的蛋白抗菌肽ar117，包含seqidno.2所示序列。
实施例3：
抗菌肽ar117抑菌效果：
1)抗菌肽ar117抑制细菌效果：
以1％的接种量摇培番茄细菌性溃疡病菌、青枯病菌、炭疽杆菌、蜡状芽孢杆菌、小麦苗枯病菌、马铃薯环腐病菌、b.subtilissck6、b.subtilis330-2(ahmadz,wuj,chenl,dongw.isolatedbacillussubtilisstrain330-2anditsantagonisticgenesidentifiedbytheremovingpcr.scientificreports.2017；7(1):1777.)、b.subtilis168，分别在37℃和28℃摇床中170r/min，震荡培养8-10h；摇培后，取300μl指示菌菌液于10ml摇菌管中，混入4ml50℃的半固体牛肉膏培养基，快速混匀，迅速倒入固体lb培养基平板中，平铺整个皿，放置5min，使培养基充分凝固晾干；将培养皿分为四个区域，每个区域中心放置无菌的滤纸片，使之与培养基充分粘合；吸取蛋白抗菌肽ar11720μl，缓慢滴在一个区域的滤纸片上，使液体缓慢均匀扩散，按同样的方法将对照ar118蛋白和wb800菌株的蛋白滴在另两个区域的滤纸片上，无菌工作台内吹干；分别在37℃和28℃培养箱倒置培养，6h-12h后观察，通过测定抑菌圈大小来计算抗菌肽ar117的抗菌活性。共进行3次实验，每次实验进行3次技术重复。如图2和表1中所示，滴有抗菌肽ar117的滤纸片周围都出现大的抑菌圈，而对照部分没有明显的抑菌圈出现。抗菌肽ar117展现出了广谱的抑菌活性，在9种细菌平板上均展现出了不同程度的抑制作用，且平均抑菌圈直径都在1.5厘米以上，表现出高效的抑菌能力。
表1抗菌肽ar117抑制细菌活性
2)抗菌肽ar117抑制真菌效果：
在v8平板上活化辣椒疫霉病原真菌，用打孔器沿菌丝外缘打孔，放置于v8平板正中央，于28℃培养。待菌丝生长至1-2cm左右时，将培养皿分为四个区域，每个区域中心放置无菌的滤纸片，使之与培养基充分粘合；吸取蛋白抗菌肽ar11720μl，缓慢滴在一个区域的滤纸片上，使液体缓慢均匀扩散，按同样的方法将对照ar118蛋白和wb800菌株的蛋白滴在另两个区域的滤纸片上，无菌工作台内吹干；28℃培养箱正置培养，约1-2后观察，并记录抑菌圈大小。结果如图3所示，与对照相比，滴有抗菌肽的滤纸片周围真菌菌丝生长受到阻止，无法越过滤纸片，而对照部分菌丝则能够顺利到达滤纸片的边缘，且呈现平滑的弧线。抗菌肽ar117的抑菌直径的计算结果见表2。
表2抗菌肽ar117抑制真菌活性
实施例4：
抗菌肽ar117在植物抗病中的应用
为了检测抗菌肽ar117作为生防制剂用于提高植物对真菌病害的抗性的潜力，发明人在烟草叶片表面喷施一定浓度的抗菌肽ar117，随后接种辣椒疫霉病原真菌，48小时后测定病斑大小。具体方式如下：
取5-6叶期烟草叶片，在叶片表面均匀涂抹一层浓度为30μg/ml抗菌肽ar117溶液。在v8平板上培养辣椒疫霉病原真菌，当菌丝即将铺满平板时，用
表2烟草叶片接种48小时后病斑直径(单位：cm2)
实施例5：
抗菌肽ar117的抑线虫效果：
1)虫体培养：
1、活化大肠杆菌op50并涂布在ngm平板上，过夜培养后备用；
2、用灭过菌的药匙在培养5天的秀丽隐杆线虫ngm平板上切下一小块带虫的培养基，接种到提前准备好的大肠杆菌op50平板上，继续培养3天；
3、用灭过菌的ddh2o洗下平板上的线虫于1.5mlep管中，于室温下1600r/min离心1.5min，并小心弃上清；
4、配制混合液(0.5mlhclo、0.5ml5m的naoh、4mlddh2o)，每管加1ml混合液，振荡混匀约2min，并小心弃上清。此步骤是为了裂解虫体，释放出虫卵，若振荡不充分会降低裂解率；
5、每管加入1mlm9缓冲液，混匀后1600r/min离心1.5min，弃尽上清。重复2-3次。此时虫卵可在m9缓冲液中保存1-2天；
6、800r/min离心1.5min，弃上清，将所有沉淀放于提前准备好的含有大肠杆菌op50的ngm平板边缘培养40-44h后使用；
7、将放置沉淀的一侧移除，用m9缓冲液洗下所有线虫备用。此时洗下的线虫处于l4时期，用于后续实验。
2)线虫的取食偏好性测定：
1、用无菌镊子夹取有机相滤膜放置na平板上使其与培养基紧紧贴合；
2、取蛋白抗菌肽ar117和as118蛋白300μl分别滴至平板两边的滤膜上，静置40min，平放至37℃培养箱中过夜培养；
3、取-70℃保存的op50，以1-2％的接种量接种于液体na培养基中，37℃，震荡培养8-10h；
4、用无菌镊子将平板上的滤膜取下，弃之；
5、取50μl新鲜op50菌液滴于原滤膜处，静置，自然晾干，25℃培养6h；
6、用m9buffer将培养了44h的线虫从ngm平板上冲洗下来，共洗2次，于室温下离心800r/min离心90sec，小心弃上清；
7、加入m9buffer(加入m9buffer体积的多少视线虫的数量而定)上下摇匀，以免线虫沉淀；
8、取20μl含有线虫的m9buffer(约60-70只线虫)，滴至两个对峙蛋白的中心位置；
9、将上述平板于25℃培养箱中培养，6h后显微镜观察线虫的食物趋向性选择结果。
根据线虫的食物趋向性选择，在光学显微镜下观察线虫的动态，滴有as118蛋白范围内线虫的爬行痕迹较多，说明线虫可以在菌苔上自由爬行，虫体比较活跃，抗菌肽ar117范围内线虫爬行痕迹较少，且虫体行动相对迟缓，统计线虫数量于表3所示，由此可看出抗菌肽ar117对线虫具有一定的影响作用，致使线虫对as118蛋白更有倾向性。
表3抗菌肽ar117抑线虫活性
实施例6：
抗菌肽ar117的溶血实验：
由于抗菌肽ar117具有影响线虫取食的能力，发明人对抗菌肽ar117进行哺乳动物红细胞毒性测试。具体方式如下：
1.取新鲜的羊血(鼠、猪等哺乳动物均可)100ul，4℃离心5000rpm，10min。
2.小心弃上清，用0.2m的pbs缓冲液(ph＝7.2)重悬浮沉淀3次，每次均4℃离心3000rpm，5min。
3.用相同的pbs缓冲液将红细胞稀释至0.5％或1％，并将蛋白调至不同浓度。
4.取50μl红细胞悬浮液与50μl不同浓度的蛋白于96孔细胞培养板中37℃孵育1h，阳性对照为1％triton-100x(完全溶血)，阴性对照为上述pbs缓冲液(不溶血)。
5.孵育1h后，4000rpm，离心10min，除去细胞碎片。
6.取80μl上清于新的96孔细胞培养板中，测定吸光值(羊、鼠血为540nm，猪血为450nm)。
7.计算公式:溶血率(％)＝(实验组a540–阴性对照a540)/(阳性对照a540–阴性对照a540)×100％
为了评估抗菌肽ar117对哺乳动物红细胞的毒性，我们检测了其在各种浓度下对羊红细胞的溶血活性。在共孵育1小时后，即使在1000μg/ml的浓度下溶血活性非常低(表4)，且500μg/ml浓度以下溶血活性为零。实验结果表明，该抗菌肽对哺乳动物细胞相对安全，可作为肽抗生素候选药物或线虫抑制剂。
表4抗菌肽ar117的溶血活性
序列表
<110>华中农业大学
<120>一种大蒜抗菌肽ar117及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>102
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tacatgtatcgtgtgtgtgtaagcctttttaatggtatggatcatatagctgtcatgtat60
gtatatgtatgtttacataagggtatggattcgagcttgtta102
<210>2
<211>34
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tyrmettyrargvalcysvalserleupheasnglymetasphisile
151015
alavalmettyrvaltyrvalcysleuhislysglymetaspserser
202530
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