本发明属中药制药领域，具体涉及一种多聚羟基孕甾烷化合物及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途。
背景技术：
：补体系统是人体重要的免疫防御系统之一，也是重要的炎症介质，介导许多炎症反应，补体系统的正常激活，能够消灭外来微生物、清除体内损伤、维持机体的平衡中起着重要的作用。然而，补体系统过度激活会造成人体自身正常组织的损伤，导致炎症性疾病，如引起血管扩张，增加血管通透性，使局部或全身发生炎症，不仅仅sars，急性肺损伤(ali)，急性呼吸窘迫综合征(ards)、类风湿性关节炎(ra)等重症炎症性疾病的发生都与补体过度激活，体内产生大量补体有关。而传统清热解毒、抗炎类中药，现代药理证实恰巧就是以抑制炎症早期的毛细血管通透性、渗出、水肿等机制。吉祥草为百合科植物吉祥草reineckiacarnea(andr.)kunth的全草，为贵州省道地药材，它是我国西南苗族地区常用的传统草药之一，属于苗药中比较重要的中药。在贵州地区别名为观音草、小叶万年青等。在地方收录为全草入药，能润肺止咳、平喘、祛风解毒。用于治疗肺结核咳嗽。临床上可用于慢性支气管炎、哮喘、风湿性关节炎以及咯血等。目前，尚未有文献报道吉祥草中的抗补体活性成分及其哪类化合物具有补体抑制活性。技术实现要素：本发明的目的在于一种多聚羟基孕甾烷化合物及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途。本发明提供一种多聚羟基孕甾烷类化合物(简称式i化合物)，具有式(i)所示结构：所述式(i)化合物为白色无定型粉末，分子式为c21h32o7，分子量：hr-ms395.2067[m-h]-；1h-nmr(600mhz,methanol-d4)δh:3.77(1h，d，h-1α，j＝3.8)，3.78(1h，m，h-2α)，4.11(1h，m，h-3α)，3.92(1h，d，j＝4，h-4α)，4.21(1h，m，h-6α)，1.81(1h，m，h-7α)，1.45(1h，m，h-7β)，2.13(1h，m，h-8β)，1.23(1h，m，h-9α)，1.50-1.64(2h，m，h2-11)，2.36(1h，m，h-12α)，1.33(1h，m，h-12β)，1.51(1h，m，h-14α)，2.11(1h，m，h-15α)，2.37(1h，m，h-15β)，6.92(1h，m，j＝3.8，j＝7.8，h-16)，1.45(3h，s，h3-18β)，0.94(3h，s，h3-19β)，2.24(3h，sh3-21)；13c-nmr(150mhz,methanol-d4)，δc：15.9(c-18)，16.5(c-19)，22.3(c-11)，27.4(c-21)，29.8(c-8)，33.59(c-15)，35.4(c-7)，36.1(c-12)，46.2(c-10)，46.6(c-9)，47.6(c-13)，57.1(c-14)，67.4(c-2)，70.1(c-4)，70.7(c-6)，75.9(c-3)，79.3(c-5)，80.1(c-1)，147.5(c-16)，156.5(c-17)，199.6(c-20)。本发明还提供所述多聚羟基孕甾烷类化合物的制备方法，包括以下步骤：取干燥吉祥草采用乙醇加热回流进行醇提，将提取液减压浓缩至无醇味后依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取并分别浓缩至干，正丁醇萃取物用大孔吸附树脂分离和硅胶柱色谱分离，再经过中压ods柱和hplc制备色谱进行纯化即得；所述多聚羟基孕甾烷类化合物具有式(i)所示结构。在本发明的实施方案中，所述的醇提步骤的乙醇浓度为80％。所述百分数为体积百分数。在本发明的实施方案中，所述醇提次数为1～4次；更优选地，所述醇提次数为3次。在本发明的实施方案中，所述大孔吸附树脂分离包括：采用30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇依次洗脱，收集60％乙醇洗脱部位。所述30％乙醇是指乙醇的体积百分数为30％的乙醇水溶液，60％乙醇和95％的乙醇依次类推。在本发明的实施方案中，所述硅胶柱色谱分离包括以二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，收集二氯甲烷与甲醇的体积比为1:1的洗脱液；优选地，二氯甲烷-甲醇的体积比为20:1～0:1。在本发明的实施方案中，所述中压ods柱包括采用甲醇-水进行梯度洗脱。优选地，甲醇-水的体积比为4:1～1:0。在本发明的实施方案中，所述hplc制备色谱的洗脱液为17％的乙腈/水。本发明还进一步提供所述的多聚羟基孕甾烷类化合物在制备抗补体药物中的用途。在本发明的实施方案中，所述多聚羟基孕甾烷类化合物对补体系统经典途径和旁路途径有抑制作用。将所述多聚羟基孕甾烷类化合物进行抗补体活性测试，结果表明，所述化合物对经典途径的抑制作用(ch50)为0.043mg/ml，对旁路途径的抑制作用(ap50)为0.074mg/ml。说明本发明所述多聚羟基孕甾烷类化合物对补体的经典途径和旁路途径均有较强的抑制作用，所述多聚羟基孕甾烷类化合物可用于制备抗补体药物。附图说明图1：所述式(i)化合物的提取分离流程图。具体实施方式本发明公开了一种多聚羟基孕甾烷化合物及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例涉及的试剂或原料若无特别说明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。实施例1.式(i)化合物的提取分离方法取市购吉祥草全草20kg(干燥)，80％乙醇加热回流提取3次，提取时间分别为2h、2h、1h，将三次提取液合并，减压浓缩至无醇味(约15l)，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并分别浓缩至干，其中得正丁醇萃取物780g。取正丁醇部位萃取物用大孔吸附树脂hp20分离，用乙醇:水(30％,60％,95％乙醇)依次洗脱，得30％乙醇洗脱部分fr.1(188g)、60％乙醇洗脱部分fr.2(241g)、95％乙醇洗脱部分fr.3(79g)。流份fr.2经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇(20:1-0:1)梯度洗脱，得到6个流份fr.4-9。流份fr.6(洗脱液中二氯甲烷与甲醇的体积比为1:1)经中压ods柱以甲醇:水(4:1-1:0)进行梯度洗脱，再经hplc制备液相(17％乙腈/水)进行纯化分离，得到所述式(i)化合物10.2mg。所述式(i)化合物为白色无定型粉末，分子式为c21h32o7，分子量：hr-ms395.2067[m-h]-；1h-nmr(600mhz,methanol-d4)δh:3.77(1h，d，h-1α，j＝3.8)，3.78(1h，m，h-2α)，4.11(1h，m，h-3α)，3.92(1h，d，j＝4，h-4α)，4.21(1h，m，h-6α)，1.81(1h，m，h-7α)，1.45(1h，m，h-7β)，2.13(1h，m，h-8β)，1.23(1h，m，h-9α)，1.50-1.64(2h，m，h2-11)，2.36(1h，m，h-12α)，1.33(1h，m，h-12β)，1.51(1h，m，h-14α)，2.11(1h，m，h-15α)，2.37(1h，m，h-15β)，6.92(1h，m，j＝3.8，j＝7.8，h-16)，1.45(3h，s，h3-18β)，0.94(3h，s，h3-19β)，2.24(3h，sh3-21)；13c-nmr(150mhz,methanol-d4)，δc：15.9(c-18)，16.5(c-19)，22.3(c-11)，27.4(c-21)，29.8(c-8)，33.59(c-15)，35.4(c-7)，36.1(c-12)，46.2(c-10)，46.6(c-9)，47.6(c-13)，57.1(c-14)，67.4(c-2)，70.1(c-4)，70.7(c-6)，75.9(c-3)，79.3(c-5)，80.1(c-1)，147.5(c-16)，156.5(c-17)，199.6(c-20)。实施例2.式(i)化合物的体外抗补体经典途径试验本例通过经典途径抗补体活性来反映式(i)化合物对补体作用大小。实验方法如下：1、供试品对照组的配制方法：称取供试品约3mg，用20uldmso溶解后，加入780ul巴比妥缓冲液，吸取400ul于ep管中，依次稀释成八个浓度梯度，待测。各加入200ul补体，100ul溶血素和绵羊红细胞。2、补体组的配制方法：补体组加入200ul补体，100ul溶血素和绵羊红细胞，再加入200ul巴比妥缓冲液。3、实验方法：取补体(豚鼠血清)0.1ml，加入巴比妥缓冲液(bbs)配制成1:10的溶液，用bbs对倍稀释成1:10、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280的补体溶液。取1:1000溶血素、0.2ml各浓度补体及2％羊红细胞(srbc)各0.1ml溶于0.2mlbbs中，混合均匀，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定其吸光度。实验同时设置全溶血组(0.1ml2％srbc溶于0.5ml三蒸水)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为x轴，溶血百分率为y轴作图。选择达到相似溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取临界浓度的补体与供试品混匀，加入适量bbs、溶血素和2％srbc，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度。实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组。将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率，以供试品浓度作为x轴，溶血抑制率作为y轴作图，计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(ch50)。结果见表1。实施例3.式(i)化合物的体外抗补体旁路途径试验本例通过旁路途径抗补体活性来反映式(i)化合物对补体作用大小。实验方法如下：1、供试品对照组的配制方法：称取供试品约3mg，用20uldmso溶解后，加入780ul巴比妥缓冲液，吸取400ul于ep管中，依次稀释成八个浓度梯度，待测。各加入200ul补体，100ul溶血素和兔红细胞。2、补体组的配制方法：补体组加入200ul补体，100ul溶血素和兔红细胞，再加入200ul巴比妥缓冲液。3、实验方法：取补体(人血清)0.2ml，加入ap稀释液(巴比妥缓冲液，ph＝7.4,含5mmmg2+,8mmegta)配制成1:1的溶液，对倍稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64和1:128的溶液。取各浓度补体0.15ml、ap稀释液0.15ml及0.5％兔红细胞(re)0.20ml，混匀，37℃水浴30min后置于低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.20ml0.5％re溶于0.3ml三蒸水)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为x轴，溶血百分率为y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，于37℃预水浴10min后，加入0.2ml0.5％re。将每管37℃水浴30min后置于低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后，分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定其吸光度。实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组。将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率，以供试品浓度作为x轴，溶血抑制率作为y轴作图，计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(ap50)。结果见表1。表1.化合物对补体系统经典途径和旁路途径的抑制作用(mean±sd,n＝3)名称ch50(mg/ml)ap50(mg/ml)式(i)化合物0.043±0.0030.074±0.005阳性对照(肝素)0.026±0.0030.062±0.004当前第1页12