一种抗凝肽SYAP-1及其突变体和包括抗凝肽和/或突变体的抑制剂的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种抗凝肽syap-1及其突变体和包括抗凝肽和/或突变体的抑制剂。

背景技术：

现阶段，全球脑卒中发病逾1800万例/年，随着老年人口的增加呈逐年增长的趋势，严重威胁着人类生命健康和生活质量，研究治疗脑卒中的药物具有巨大的社会需求和重要的社会意义。

脑卒中是一种突发性的脑血液循环障碍性疾病，缺血后首先出现能量代谢障碍以及细胞内外离子失衡失，然后出现水肿、炎症及细胞死亡等损伤变化，最后出现结构和功能损伤。最近研究表明，血栓性炎症是引起脑细胞死亡的主要原因之一，多聚磷脂和带负电的表面暴露，接触激活的第十二因子引发了内源性凝血途径级联反应，促使凝血酶生成和纤维蛋白聚集，导致血栓；另一方面，第十二因子同时激活了接触-激肽系统，第十二因子切割激肽释放酶原(ppk)形成具有活性的激肽释放酶(pk)，激活的pk切割高分子量激肽原，从而释放出炎性多肽激素缓激肽(bk)；bk与血管内皮细胞上的受体b1r和b2r激活，起始了引起血管内皮细胞被破坏的信号通路，引起血管水肿和炎症因子的释放，导致神级细胞炎症产生，最终造成神经细胞的死亡。

尽管使用溶栓类药物t-pa溶栓治疗能够恢复脑部供血供氧，但是并不能修复以及阻止受损脑区病变。因此，寻找新型药物以阻断第十二因子引发的血液凝固级联反应、防止激肽释放酶引发的血栓性炎症反应是目前脑缺血药物治疗的研究重点。但是目前还没有找到专一性作用于第十二因子和激肽释放酶的有效药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抗凝肽syap-1及其突变体，对第十二因子和激肽释放酶具有很强的专一性抑制作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗凝肽syap-1，所述抗凝肽syap-1的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了上述方案所述抗凝肽syap-1的突变体，所述抗凝肽syap-1的突变体的氨基酸序列如seqidno.2～seqidno.7任一项所示；

所述seqidno.2、seqidno.5和seqidno.7中的x1独立为e、r、w、f、l或d；

所述seqidno.3中的x2为k、r、w、f、l或d；

所述seqidno.4和seqidno.6中的x3独立为k、r、w、e、l或d；

所述seqidno.6中的x4为k、r、w、f、l或d；

所述seqidno.7中的x5为k、r、w、f、l、p或d，x6为k、r、w、f、l或d。

本发明还提供了一种抑制第十二因子和/或抑制激肽释放酶的抑制剂，包括上述方案所述的抗凝肽syap-1和/或上述方案所述的抗凝肽syap-1的突变体。

优选的，所述抑制剂包括药学上可接受的药物辅料。

本发明提供了一种抗凝肽syap-1，所述抗凝肽syap-1的氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明提供的抗凝肽syap-1能够抑制第十二因子和/或激肽释放酶，进而具有抗凝和抑制脑卒的作用，机理为能够同时抑制凝血和血栓性炎症。

附图说明

图1为显示抗凝肽syap-1及其突变体的复性；

图2为显示抗凝肽syap-1及其突变体的抗凝作用；

图3为显示抗凝肽syap-1及其突变体的抗脑卒作用。

具体实施方式

本发明提供了一种抗凝肽syap-1，所述抗凝肽syap-1的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述抗凝肽syap-1具体的氨基酸序列如下所示：

tsepvcacpkmlfwvcgkdgetythpciakchnvevehdgkck。

本发明还提供了上述技术方案所述抗凝肽syap-1的突变体，所述抗凝肽syap-1的突变体的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述抗凝肽syap-1的突变体具体的氨基酸序列如下所示：

tsepvcacpkmlfwvcgx1dgetythpciakchnvevehdgkck，其中x1为e、r、w、f、l或d。

本发明还提供了上述技术方案所述抗凝肽syap-1的突变体，所述抗凝肽syap-1的突变体的氨基酸序列如seqidno.3所示，所述抗凝肽syap-1的突变体具体的氨基酸序列如下所示：

tsepvcacpkmlfwvcgkdgx2tythpciakchnvevehdgkck，其中x2为：k、r、w、f、l或d。

本发明还提供了上述技术方案所述抗凝肽syap-1的突变体，所述抗凝肽syap-1的突变体的氨基酸序列如seqidno.4所示，所述抗凝肽syap-1的突变体具体的氨基酸序列如下所示：

tsepvcacpkmlx3wvcgkdgetythpciakchnvevehdgkck，其中x3为k、r、w、e、l或d。

本发明还提供了上述技术方案所述抗凝肽syap-1的突变体，所述抗凝肽syap-1的突变体的氨基酸序列如seqidno.5所示，所述抗凝肽syap-1的突变体具体的氨基酸序列如下所示：

tsepvcacpkmlfwvcgkdgx1tythpciax1chnvevehdgkck，其中x1为e、r、w、f、l或d。

本发明还提供了上述技术方案所述抗凝肽syap-1的突变体，所述抗凝肽syap-1的突变体的氨基酸序列如seqidno.6所示，所述抗凝肽syap-1的突变体具体的氨基酸序列如下所示：

tsepvcacpkmlx3wvcgkdgx3tythpciakchnvx4vehdgkck，其中x3为k、r、w、e、l或d，x4为k、r、w、f、l或d。

本发明还提供了上述技术方案所述抗凝肽syap-1的突变体，所述抗凝肽syap-1的突变体的氨基酸序列如seqidno.7所示，所述抗凝肽syap-1的突变体具体氨基酸序列如下所示：

tsepvcacpx1mlfwvcgkdgetytx5pciakchnvevx6hdgkck。其中x1为f、r、w、e、l或d，x5为k、r、w、f、l、p或d，x6为k、r、w、f、l或d。

本发明对所述抗凝肽syap-1和抗凝肽syap-1的突变体的制备优选在自动多肽合成仪中制备全序列，所述制备方法采用常规制备多肽序列的方法即可。

本发明还提供了一种抑制第十二因子和/或抑制激肽释放酶的抑制剂，包括上述方案所述的抗凝肽syap-1和/或上述方案所述的抗凝肽syap-1的突变体。

在本发明中，所述抑制剂中抗凝肽syap-1的有效剂量优选为1.2～25um，更优选为5～22um，最优选为20um；所述抑制剂中辅料优选为氯化钠、磷酸钠、醋酸钠、甘露醇、聚乙二醇或右旋糖酐。

在本发明中，所述抑制剂的制备方法优选包括：将1～20mgsypa-1与所述辅料按照1:(1～100)的比例混合，得到抑制剂。在本发明中，所述抑制剂在使用时优选加入0.1～10ml纯水配制成溶液后再使用。

在本发明中，所述抑制剂中抗凝肽syap-1的突变体的有效剂量优选为0.5～7um，更优选为2～6um，最优选为5um；所述抑制剂中辅料优选为氯化钠、磷酸钠、醋酸钠、甘露醇、聚乙二醇或右旋糖酐。

在本发明中，所述抑制剂的制备方法优选包括：将1～20mgsypa-1的突变体与所述辅料按照1:(1～100)的比例混合，得到抑制剂。在本发明中，所述抑制剂在使用时优选加入0.1`10ml纯水配制成溶液后再使用。

下面结合实施例对本发明提供的一种抗凝肽syap-1及其突变体和包括抗凝肽和/或突变体的抑制剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

抗凝肽syap-1及其突变体的合成：

用fmoc-lys(boc)-wangresin进行合成。

1，树脂溶胀

称取替代度为0.3的fmoc-leu-wangresin5g，倒入反应柱中，加入50ml二氯甲烷溶胀，浸泡30min。

2，去保护

抽干反应柱中二氯甲烷，加入哌啶/甲酰胺溶液脱除fmoc,氮气鼓动30min，抽干，以甲酰胺洗涤5遍，抽干，哌啶/甲酰胺溶液中哌啶的的体积百分含量为20％，甲酰胺的体积百分含量为80％。

3，缩合反应

一般采用tbtu/diea激活剂组合进行缩合，以3倍投料量计算称取的tbtu及连接氨基酸，该序列合成第二位氨基酸为c，故称取tbtu1.44g,fmoc-cys(trt)-oh2.63g，用50ml甲酰胺溶解加入反应柱中，加入diea1.55ml，氮气鼓动，反应1小时。

4，检测，洗涤

用取样管从反应柱中取少许树脂，倒入小试管中，甲酰胺洗涤一遍，倒掉甲酰胺，分别加入a,b,c液各3滴(a液：2％的茚三酮酒精溶液，b液：20％酒精80％苯酚混合溶液，c液：重蒸吡啶)，放入加热器中120℃加热3分钟，取出观察溶液及树脂颜色，溶液黄树脂无色或淡黄，表明缩合反应完全，停止反应柱中反应，抽干，甲酰胺洗涤3遍。

5，复投

如检测出树脂颜色为其他颜色，例绿色蓝色紫色等，则表明反应未完全，同样抽干洗涤3遍，称取当前反应同样的量投入反应柱中重新反应，直至检测反应完全为止。

6，继续缩合

后续氨基酸的连接重复2-5步骤，不同的氨基酸称取的量用同样的算法计算称取，tbtu/diea的量保持不变。

7，收缩

最后一个氨基酸连接完成后，继续重复2步骤，然后二氯甲烷洗涤3遍，甲醇洗涤3遍，抽干，将树脂倒出，烘灯烘干装入500ml烧杯中。

8，切割

向烧杯中加入100ml切割液(体积比例为三氟醋酸/苯甲硫醚/苯酚/乙二硫醇/水＝86/5/4/3/2)，将烧杯置于磁力搅拌器上，烧杯中放入磁子，在120rpm的条件下搅拌反应2小时，后用砂芯漏斗过滤，以乙二硫醇润洗砂芯中树脂2次，然后倒入600ml的冰乙醚中，此时多肽析出形成多肽乙醚悬浮液，使用大号离心机离心分离，离心分离的转速为12000rpm，离心分离的时间为1h，倒掉上清液，沉淀加入乙醚洗涤，重复3次，后用烘灯烘烤(40～70℃，1～14小时)去除乙醚残留，得到的固体即为目标多肽粗品。

9，纯化

将粗品用水溶解，过滤，用高效液相色谱法进行分离纯化，最终得到纯度为95％以上的目标多肽精品。

10.制备

把7克粗品溶解在乙腈与水体积比为1:4的溶液里面，溶液中多肽终浓度1-100mg/ml，取一点小样分析一下样品的出峰时间。(高相液相色谱仪hplc分析)在选择制备柱子100dac的柱子，把样品进到柱子里面，根据粗品的出峰时间选择梯度，进去分离，根据hplc图把杂质分开收，通过lc-ms来判断收的产品是不是需要的，把需要的物质留下来进行检测。hplc合格的产品进行旋蒸、冻干，得到所需要的产品的量。

实施例2

抗凝肽syap-1及其突变体的复性：

1.谷胱甘肽法氧化复性条件

合成的多肽溶解于复性缓冲液中(5mmol/lgsh和0.5mmol/lgssg的0.1mol/ltris-hcl，0.1mol/lnacl)，浓度小于1％，使用ph7.4，温度28℃，复性时间为24h。

2.复性蛋白使用c18rp-hplc分离纯化

c18柱(xbridgetmbeh300prep10×250mm)，有机溶剂为乙腈(tedia)、tfa为挥发剂。溶剂a：0.1％tfa的超纯水溶液，溶剂b：0.1％tfa的乙腈溶液。洗脱使用线性浓度梯度：0-3min，b：5％；3-4min，b：5-20％；4-24min，b：20-40％；24-25min，b：40-100％。流速为1.5ml/min，上样量为0.5mg合成复性蛋白，结果见图1。

从图1中可以得出，合成的线性多肽已经形成二硫键。

实施例3

抗凝肽syap-1及其突变体的药理实验：

1.酶动力学：在96孔板中10μl样品与10μl终浓度为0.2μm的第十二因子混合于40μl缓冲液(100mmnacl、50mmtris-hcl(ph8.0)、5mmcacl2)中。室温放置5分钟后，加入30μl缓冲液与10μl终浓度为0.04mm发色底物h-d-pro-phe-arg-pna·2hcl的混合液，终体积为100μl。凝血反应的动力学使用epoch(biotek)酶标仪、genchs1.09软件检测od405，20min，间隔47s。样品浓度为10μm。syap-1对凝血酶、fxa等无抑制作用。可以抑制第十二因子和激肽释放酶。经计算syap-1对第十二因子和激肽释放酶的抑制常数分别为2.9μm、17.8nm，结果见图2。其突变体具有相同活性。

2.aptt和pt实验：将aptt试剂平衡至室温，轻轻倒置混匀aptt试剂。50μlaptt试剂、50μl正常血浆和5μl样品混匀后，在37℃的水浴锅中孵育3分钟，加入50μl预热的50mmcacl2溶液，立即混匀，用酶标仪记检测od650。pt实验：37℃预热凝血酶原试剂15分钟，50μl正常血浆与5μl样品在37℃水浴锅中孵育3分钟，加入预热的凝血酶原试剂100μl，立即混匀，用酶标仪记录od650。syap-1对pt实验无作用，对aptt实验具有浓度依赖效果，表明syap-1及其突变体抑制内源性凝血途径，与第十二因子抑制剂的结果一致，结果见图2。其中，a：syap-1可抑制第十二因子；b：syap-1抑制第十二因子的酶动力学；c：syap-1可抑制激肽释放酶；d：syap-1激肽释放酶的酶动力学；e：syap-1可抑制胰蛋白酶；f：syap-1抑制胰蛋白酶的酶动力学；a：syap-1延长atpp；b：syap-1不能延长pt。

3.脑卒中线栓模型：使用2％戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉昆明小鼠(30～35g)，中深度麻醉后，颈正中切口逐层切开大鼠皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露右侧颈总动脉(cca)，颈内动脉(ica)和颈外动脉(eca)，使用电凝器凝结eca上甲状腺动脉和咽动脉并剪断。结扎eca的远心端，并在其近心端挂线，暂时夹闭cca和ica，剪断eca，将线栓从eca残端插入ica，结扎eca残端，移除ica的动脉夹，由ica向内上方缓慢推进。适当调整方向，插入到线栓标记处(从cca分叉处计算10mm)，开始计时，1h后移去线栓，观察无活动性出血后缝合切口。整个过程用电热毯保温，温度为36～37℃。将苏醒后的动物放回笼内，使其自由饮食。

脑卒中24h，按bedersonscore评分法评估并记录神经功能缺损评分：0分为无功能障碍；1分为不能伸展右前肢；2分为向右侧旋转；3分为向右倾倒；4分为无自主活动伴意识障碍；5分为死亡。

24h后麻醉剪下头部，取出脑组织，置于脑模具中(冰上)，沿视交叉向后切成2mm厚的切片，将其放入2％ttc的磷酸盐缓冲液，于37℃温箱中染色30min，再用4％多聚甲醛过夜固定并拍照。缺血体积百分数＝[缺血体积-(左半脑体积-右半脑体积)]/右半脑体积×100。缺血再灌注前10min，尾静脉给药1次，实验组分别为1、3、5mg/kg，对照组为生理盐水，体积100μl。缺血再灌注后10min内，尾静脉给药1次，剂量同上；6h再给药一次。每组6只。syap-1及其突变体可以有效减轻脑卒中再灌注造成的损伤，结果见图3。其中，a：syap-1对脑缺血体积的影响；b：syap-1对脑缺血体积影响的统计结果；c：syap-1对脑缺血动物行为学的改善作用；d：syap-1突变体对脑缺血体积的影响；e：syap-1突变体对脑缺血体积影响的统计结果；f：syap-1突变体对脑缺血动物行为学的改善作用；syap-1对鼠尾血栓模型的作用，g为12小时，h为24小时，i为36小时，j为48小时。

由以上实施例可知，本发明提供了一种抗凝肽syap-1及其突变体能够抑制第十二因子和/或激肽释放酶，进而具有抗凝和抑制脑卒的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院昆明动物研究所

<120>一种抗凝肽syap-1及其突变体和包括抗凝肽和/或突变体的抑制剂

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>43

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

thrsergluprovalcysalacysprolysmetleuphetrpvalcys

151015

glylysaspglygluthrtyrthrhisprocysilealalyscyshis

202530

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<210>2

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<213>人工序列(artificialsequence)

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