本发明涉及分子生物学和生物信息学领域，具体涉及一种基于LINE1转座子与微卫星引物相结合的猪基因组分子标记挖掘方法。
背景技术：
目前已有的遗传标记主要有形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记。形态学标记基于个体形状描述，得到的结论往往不够完善，且极易受环境的影响，并且有一些标记与不良形状连锁。细胞学标记基于染色体结构变异，不易受环境影响，但细胞遗传标记经常伴有对生物有害的表型效应，难以获得相应的标记材料，或者观测和鉴定比较困难。生化标记通过对一系列蛋白和同工酶的检测，但是，蛋白和同工酶都是基因的表达产物，非遗传物质本身，它们的表现易受环境和发育状况的影响。分子标记是以生物大分子的多态性为基础的标记技术，目前使用的分子标记是指DNA分子标记。具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，信息完整；遗传多态性高；在基因组中大量存在且均匀分布；选择中性；稳定性、重复性好；信息量大，分析效率高；检测手段简单快捷；开发和使用成本较低。
DNA分子标记技术经过历年来的发展，主要有以下几种标记，第一代分子标记技术：限制性片段长度多态性(RFLP)标记技术，优点：RFLP普遍存在，自然发生，不仅数量大，且同一位点有较多等位基因；等位基因间是共显性的；反应基因间的差异，无表型现象，不受环境条件和发育阶段的影响；在非等位的RFLP标记之间，不存在上位效应和其他形式的互作，RFLP标记之间互不干扰。缺点：具有种属特异性，在实际应用中受限制；要具有放射性探针和进行Southern转移及杂交、发射自显影，因而费时、繁琐、污染大，对环境和人体造成不良影响；对DNA含量与纯度要求高，多态性水平低。随机扩增多态DNA标记技术(RAPD)，优点：不需DNA探针，设计引物无需知道序列信息，且引物无种族特异性；技术简便；DNA样品需求量少，引物价格便宜，成本低。缺点：显性遗传，不能识别杂合子位点，这事的遗传分析相对复杂，在基因定位，做连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降；其次，RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度，Mg2+浓度，所以实验的重复性差。扩增片段长度多态技术(AFLP)，优点：它兼具RAPD与RFLP的优点，有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内监测到大量位点，各染色体上AFLP标记的数目与染色体长度呈正相关，通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的AFLP标记。缺点：对模板反应迟钝，谱带可能发生错配和缺失，成本较高，对技术要求苛刻。第二代分子标记技术，微卫星标记技术SSR，优点：具有很高的多态性,而且一般为共显性。缺点：工作量大，费用也高，实际应用少。第三代分子标记：单核苷酸多态性(SNP)优点：具有共显性，能获得的标记数量多，易于实现高通量。是基因组中最简单，最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。缺点：芯片成本高，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被捡起。
转座子在生物基因组中广泛存在，是一类在基因组上可以自由跳跃(复制或移位)的移动DNA序列，能在其寄主的基因组中复制、移动。与其它哺乳动物相似，转座子是猪基因组的重要组成成分，占整个基因组的39.40％，主要由反转录转座子组成，约占整个基因组的37％。L1/LINE反转录转座子是丰度最高的转座子，占整个基因组的24.55％，转座模式属于复制黏贴型的，即能在原位置保持不变时复制自身并插入到其他位置，因此，逆转录转座能在基因组上能产生大量插入多态性(Transposon insertion polymorphisims，TIP)。并且自身长度较长，自身携带如启动子、小RNA结合位点等多种调控相关元件，因此随着LINE1的转座，对寄主基因组的结构，对插入位置的基因的表达，对附近基因的调控都能产生显著的影响，从而对物种、品种、亚种、品系形成发挥了重要作用。通过TIP分子标记可以有效追溯哺乳动物共同祖先，重构哺乳动物系统生物学。TIP分子标记已经成功应用于哺乳动物遗传进化及人类医学研究。利用转座子插入多态性(TIP)建立的新型分子标记技术在遗传进化研究中的应用为我们理解高等生物基因组的进化提供了新视角，同时，TIP技术也成为生物多样性、遗传进化研究和分子育种的重要工具。
猪基因组学研究目前面临的主要挑战是虽然获得了大量数量性状变异的QTL，但缺乏足够密度的分子标记，难以进行基因精细定位，无法有效开展分子标记辅助选择。而TIP具有理想分子标记的诸多优点：如多态性高、共显性、基因组分布广泛、检测手段简单快速、重复性好和开发成本低等。并且相较其他标记的来源，LINE1的插入对猪基因组结构、基因表达的影响远大于SNP，微卫星等，因此基于猪LINE1转座子插入多态研发的分子标记必将大大推动分子育种的进程和猪功能基因学的研究；同时，TIP分子标记应用于猪群体遗传学研究也将加深人类对猪生物多样性、起源进化和品种种质特性形成的理解和认识。
技术实现要素：
本发明是针对现有分子标记的不足，基于猪LINE1转座子在猪基因组上具有含量丰富，分布广泛，并且在不同的个体间存在插入多态性的特点，以及微卫星多态信息含量丰富，杂合度高，分布广泛的特点，提供一种基于LINE1转座子与微卫星引物相结合的猪基因组分子标记挖掘方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种基于LINE1转座子与微卫星引物相结合的猪基因组分子标记挖掘方法。获取方式，包括以下步骤：
(1)利用LINE1的5’端核苷酸序列或3’端核苷酸序列作为参考序列，设计特异性引物；一般可以使用5’端核苷酸序列的前300-500核苷酸或3’端核苷酸序列的末端300-500核苷酸作为参考序列；
(2)利用生物信息学分析软件分析猪的基因组，筛选出分布广泛的微卫星序列设计微卫星引物；选择猪基因组中重复数较高的微卫星序列设计相应的微卫星引物，在微卫星引物3'端添加选择性碱基，并调整微卫星引物的TM值至合适的温度。(3)将步骤(1)和步骤(2)中的引物结合，在不同品种猪中扩增检测；
(4)筛选条带比较清晰、多态性高，重复性好的微卫星引物组合，对多态性条带克隆测序；
(5)将测序结果比对分析，设计旁侧特异性引物；要对测序所得到所有LINE1插入位点的序列进行比对分析，最后获得具有代表性的测序结果；根据测序结果设计旁侧特异性引物。
(6)利用步骤(5)所得的旁侧特异性引物与步骤(1)的特异性引物组合，PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得有效的分子标记。
其中，LINE1家族的成员序列有差异，可以用任何一个作为参考序列，获得的位点都属于LINE1转座子的插入位点。所述LINE1的5’端500个核苷酸序列包括但不限于SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12；所述3’端500个核苷酸序列包括但不限于SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22或SEQ ID No.23。
上述方法的实例1是：
(1)利用LINE1的3’端核苷酸序列SEQ ID No.16作为参考序列，设计了一条特异性引物Primer L1-3'UTR，如表1所示。特异性引物序列SEQ ID No.24；
(2)利用生物信息学分析软件分析猪的基因组，选择重复数大于1000的微卫星序列设计相应的微卫星引物，筛选出13个，在微卫星引物3'端添加选择性碱基，并调整微卫星引物的TM值至60℃左右。微卫星引物名称及序列如表1所示，Primer AC：SEQ ID No.26、PrimerAG:SEQ ID No.27、Primer CT:SEQ ID No.28、Primer CA:SEQ ID No.29、Primer GT:SEQ ID No.30、Primer GA:SEQ ID No.31、Primer TG:SEQ ID No.32、Primer TC:SEQ ID No.33、Primer AAC:SEQ ID No.34、Primer CAA:SEQ ID No.35、Primer CCT:SEQ ID No.36、Primer CTC:SEQ ID No.37、Primer CTT:SEQ ID No.38；
(3)将特异性引物Primer L1-3'UTR和上述(2)中的13条微卫星引物分别组合，在七个猪品种(长白、杜洛克、梅山、姜曲海、藏猪、巴马香猪、野猪)中进行反转录转座子品种间插入多态性检测；
(4)筛选扩增条带清晰且重复性好的组合，获得两个组合，分别是Primer CT与PrimerL1-3'UTR和Primer TC与Primer L1-3'UTR，并对其出现的条带清晰、易于分辨、具有品种差异性的条带进行克隆测序；
(5)对克隆的33个不同品种猪基因组中的插入位点的序列比对分析，得到14型克隆，并依此设计14条特异性侧翼序列引物，特异性侧翼序列引物位于LINE1插入位点的基因组侧翼序列，与Primer L1-3'UTR进行组合。对应的标记名称，引物组合，引物序列如表2所示；
(6)利用14对待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，检测这些插入位点在群体中的分布频率，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记，共获得8个有效标记：L1-31-1、L1-31-2、L1-31-5、L1-31-7、L1-31-8、L1-31-9、L1-31-11、L1-31-12。
其中，步骤(3)中PCR扩增的操作可以是包括以下步骤：
1)人工合成上述特异性引物和13条微卫星引物；
2)提取不同品种的不同个体基因组；
3)以不同品种的不同个体基因组为模板进行PCR扩增；
4)对PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
步骤(6)中PCR扩增的操作可以是包括以下步骤：
1)人工合成上述14对待验证分子标记引物；
2)提取不同品种的不同个体基因组；
3)以不同品种的不同个体基因组为模板进行PCR扩增；
4)对PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
表1.反转录转座子引物和微卫星引物的信息
表2.RTIP标记和插入位置的信息
实例2：
(1)利用LINE1的5’端核苷酸序列SEQ ID No.1作为参考序列，设计了一条特异性引物Primer L1-5'UTR，如表1所示。特异性引物序列SEQ ID No.25；
(2)同实例1(2)；
(3)将特异性引物Primer L1-5'UTR和上述(2)中的13条微卫星引物分别组合，在八个猪品种(巴马香猪、姜曲海、梅山、沙乌头、野猪、苏姜、大白、长白)中进行反转录转座子品种间插入多态性检测；
(4)同实例1(4)；
(5)对克隆的14个不同品种猪基因组中的插入位点的序列比对分析，得到3型克隆，并依此设计3条特异性侧翼序列引物，特异性侧翼序列引物位于LINE1插入位点的基因组侧翼序列，与Primer L1-5'UTR进行组合。对应的标记名称，引物组合，引物序列如表2所示；
(6)利用3对待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，检测这些插入位点在群体中的分布频率，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记，共获得2个有效标记：L1-51-1、L1-51-2。
其中，步骤(3)中PCR扩增的操作可以是包括以下步骤：
1)人工合成上述特异性引物和13条微卫星引物；
2)提取不同品种的不同个体基因组；
3)以不同品种的不同个体基因组为模板进行PCR扩增；
4)对PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
步骤(6)中PCR扩增的操作可以是包括以下步骤：
1)人工合成上述3对待验证分子标记引物；
2)提取不同品种的不同个体基因组；
3)以不同品种的不同个体基因组为模板进行PCR扩增；
4)对PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明主要通过以获取LINE1序列为参考序列，设计特异性引物和微卫星引物，特异性引物与微卫星引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳等步骤获得插入多态的条带，进行克隆测序分析后，再以此设计旁侧特异性引物与之前的位于LNE1上的特异性引物组合进行PCR，琼脂糖凝胶电泳等步骤获得其在品种间或品种内的插入信息，据此建立基于转座子插入多态性检测方法。为猪的品系鉴定，育种中的标记辅助选择提供有用的分子标记。
附图说明
图1是LINE1特异性引物Primer L1-3'UTR与微卫星引物Primer TC组合在7个不同品种的不同个体中的扩增结果。marker为宝生物的DL5000，从左到右分别是长白猪，杜洛克猪，梅山猪，姜曲海猪，藏猪，巴马香猪，野猪和空白对照。除野猪1个个体外，其余个体3个。白色箭头代表多态性条带，指示不同的LINE1插入基因位点。
图2是8个有效分子标记在7个不同品种的不同个体的扩增结果。marker为宝生物的DL2000，8个标记在7个品种中多态性检测。从左到右分别是长白猪，杜洛克猪，梅山猪，姜曲海猪，藏猪，巴马香猪，野猪和空白对照。除野猪一个体外，其余个体3个。
图3是LINE1特异性引物Primer L1-5'UTR与微卫星引物Primer TC组合在8个不同品种的不同个体中的扩增结果。marker为宝生物的DL5000，从左到右分别是巴马香猪、姜曲海猪、梅山猪、沙乌头猪、野猪、苏姜猪、大白猪、长白猪。每个个体3个样。白色箭头代表多态性条带，指示不同的LINE1插入基因位点。
图4是8个有效分子标记在8个不同品种的不同个体的扩增结果。marker为宝生物的DL2000，2个标记在8个品种中多态性检测。从左到右分别是巴马香猪、姜曲海猪、梅山猪、沙乌头猪、野猪、苏姜猪、大白猪、长白猪。每个个体3个样。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
一、第一轮PCR引物的设计
两部分引物，首先利用LINE1的3’端核苷酸序列SEQ ID No.16和5’端核苷酸序列SEQ ID No.1作为参考序列，设计特异性引物，分别命名为Primer L1-3'UTR和Primer L1-5'UTR。另一种是微卫星引物，选择广泛分布在猪基因组中的重复数目超过1000个的进行设计。设计了13个微卫星引物Primer AC：SEQ ID No.26、PrimerAG:SEQ ID No.27、Primer CT:SEQ ID No.28、Primer CA:SEQ ID No.29、Primer GT:SEQ ID No.30、Primer GA:SEQ ID No.31、Primer TG:SEQ ID No.32、Primer TC:SEQ ID No.33、Primer AAC:SEQ ID No.34、Primer CAA:SEQ ID No.35、Primer CCT:SEQ ID No.36、Primer CTC:SEQ ID No.37、Primer CTT:SEQ ID No.38。使用Primer5.0软件进行引物设计，其他参数使用软件默认设置。设计好的各引物用Olige 7进行分析评价，然后由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
二、反转录转座子特异性引物与微卫星引物在7个不同品种中的筛选
1、基因组的准备：
(1)实例1选取7品种(长白猪，杜洛克猪，梅山猪，姜曲海猪，藏猪，巴马香猪，野猪)，除野猪一个体外，其余个体3个。实例2选取8品种(巴马香猪、姜曲海、梅山、沙乌头、野猪、苏姜、大白、长白)，每个个体三个样。采集耳组织，用TIANamp Genomic DNA Kit提取各自基因组，主要步骤如下：
a)取2-25mg的耳组织，打碎，加入200微升的缓冲液GA、20微升的Proteinase K和4微升Rnase A(100mg/ml)，56℃水浴至组织完全裂解。b)向裂解液中加入200微升缓冲液GB，充分颠倒混匀后，70℃放置10分钟,简短离心去除管盖内壁的水滴。c)加200微升无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心除去管盖内壁的水滴。d)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，弃滤液。e)向吸附柱CP3中加入500微升缓冲液GD，12000rpm离心30秒，弃滤液。f)将600微升的漂洗液PW加入至CP3中，12000rpm离心30秒，弃滤液。g)重复操作步骤f。h)将吸附柱CP3放回收集管上，12000rpm离心2分钟，弃废液。i)将吸附柱CP3安置于新的1.5ml的离心管上，室温静置数分钟，在吸附膜的中央处悬空滴加80微升的灭菌水，室温静置5分钟。j)12000rpm离心2分钟洗脱DNA。
(2)调整各个基因组浓度成为40ng/μl，以此作为模板进行PCR扩增，分装后-20℃保存。2、第一轮PCR扩增
设计以下PCR反应体系：
(1)在灭菌PCR管中配制20μl反应体系
(2)将PCR管置于PCR仪中，进行如下反应程序
注：1：南京诺唯赞生物科技有限公司
3、琼脂糖凝胶检测
(1)制作1.5％的琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖放入三角烧瓶中，加入100ml 1×TAE溶液，放于微波炉中加热使之完全溶解，取出冷却至约60℃时，将琼脂糖胶倒入插有胶梳的模具中，并检查有无气泡存在。室温放置30min待凝胶完全凝固后，小心拔出胶梳，浸没于加有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中。
(2)PCR产物电泳：用移液器吸取6μl PCR扩增产物依次加入到凝胶孔中，同时点4μl DNAMaker作为参照，120V恒压电泳，待指示剂到达胶块的2/3处停止电泳，然后将凝胶放到溴化乙锭溶液中，染色10分钟，将凝胶拿出放到紫外灯下观察并拍照记录。
三、多态位点的克隆测序
1、多态位点的扩增
通过第二步，经过特异性引物Primer L1-3'UTR(SEQ ID No.24)与13个微卫星引物(Primer AC：SEQ ID No.26、PrimerAG:SEQ ID No.27、Primer CT:SEQ ID No.28、Primer CA:SEQ ID No.29、Primer GT:SEQ ID No.30、Primer GA:SEQ ID No.31、Primer TG:SEQ ID No.32、Primer TC:SEQ ID No.33、Primer AAC:SEQ ID No.34、Primer CAA:SEQ ID No.35、Primer CCT:SEQ ID No.36、Primer CTC:SEQ ID No.37、Primer CTT:SEQ ID No.38)在七个品种中的筛选。特异性引物Primer L1-5'UTR(SEQ ID No.25)与13个微卫星引物(Primer AC：SEQ ID No.26、PrimerAG:SEQ ID No.27、Primer CT:SEQ ID No.28、Primer CA:SEQ ID No.29、Primer GT:SEQ ID No.30、Primer GA:SEQ ID No.31、Primer TG:SEQ ID No.32、Primer TC:SEQ ID No.33、Primer AAC:SEQ ID No.34、Primer CAA:SEQ ID No.35、Primer CCT:SEQ ID No.36、Primer CTC:SEQ ID No.37、Primer CTT:SEQ ID No.38)在八个品种中的筛选。根据不同引物组合的扩增产物电泳结果，筛选扩增条带清晰且重复性好两个微卫星引物分别是Primer CT和Primer TC。
2、切胶回收
a)使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。b)在紫外灯下切出含有品种间和品种内有差异的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶，切碎胶块，至于2ml离心管中。c)按3倍体积量加胶块溶解液Buffer GM,室温混合溶解胶块。d)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，将上述溶液转移至Spin Column中，700微升每次，12000rpm离心1分钟，弃滤液，直至全部过完。e)在Spin Column中加入700微升Buffer WB,室温12000rpm离心30秒，弃滤液。重复一次。f)Spin Column放回Collection Tube，12000rpm离心2分钟，弃废液。g)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，室温静置数分钟，在吸附膜的中央处悬空滴加30微升的灭菌水，室温静置5分钟。h)12000rpm离心2分钟洗脱DNA。i)切胶回收完成后用核酸浓度测定仪检测切胶回收产物浓度，并分别进行琼脂糖凝胶电泳检测。
3、目的片段与pZeroBack/Blunt载体进行连接
a)按照下表的内容在无菌的离心管加入各种成分
轻弹离心管以混匀反应液，短暂离心3-5秒
b)将混合反应液放置室温(22℃)反应5分钟。反应结束后，置于冰上，进行后续转化反应。
4、转化
将10ul的连接产物转化进天根的Top10大肠杆菌感受态细胞，将连接产物加入感受态细胞后，放置冰上冰浴30mins，然后将感受态细胞放置于42℃水浴锅中热激60s，迅速转移至冰上冰浴3mins，接着向感受态细胞中加入800ulLB培养基(不含抗生素)，置于37℃摇床震荡培养45min，以使质粒上相应的抗性标记基因表达，菌体复苏。最后，吸取200ul震荡培养后的感受态细胞，均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基(氨苄青霉素浓度为100ug/ml)上，置于37℃恒温培养箱中培养12-16h。
5、提取质粒
挑取LB培养基上的单菌落，置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基(氨苄青霉素浓度为100ng/ul)中，培养12-16h，用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ法提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒大小。检测切胶回收的目的片段是否正确连载到pZeroBack/Blunt载体上面。
6、PCR鉴定
对于连接在pZeroBack/Blunt载体上面的切胶回收片段需要进一步进行PCR鉴定，以挑取含有正确连接切回片段的质粒。以连接后质粒(电泳显示质粒大小与预期接近)为模版，用零背景载体试剂盒提供的测序引物进行PCR反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析。如果电泳结果显示PCR扩增出目的基因条带与预期大小一致，则说明是切回片段连接在了pZeroBack/Blunt载体上面，可进行后续的测序分析。
7、送测
经过质粒大小鉴定和PCR鉴定后，如果重组质粒连接正确，随机挑取三个送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，然后将测序结果与Primer LI-3'UTR序列(SEQ ID No.24)进行比对分析，获得14个独特的序列。将测序结果与Primer LI-5'UTR序列(SEQ ID No.25)进行比对分析，获得3个独特的序列。
四、第二轮PCR引物的设计
实例1根据14个独特的序列设计14个侧翼特异性引物。引物位于LINE1插入位点的基因组侧翼序列，与Primer L1-3'UTR进行组合。实例2根据3个独特的序列设计3个侧翼特异性引物。引物位于LINE1插入位点的基因组侧翼序列，与Primer L1-5'UTR进行组合。
五、分子标记在不同品种中检测
1、基因组的准备：
(1)实例1选取7个品种(长白猪，大白猪，杜洛克猪，梅山猪，姜曲海猪，巴马香猪，藏猪)，除藏猪一个样外，每个品种若干样。实例2选取8品种(巴马香猪、姜曲海、梅山、沙乌头、野猪、苏姜、大白、长白)，每个个体三个样。采集耳组织，用TIANamp Genomic DNAKit提取各自基因组，主要步骤如下：
a)取2-25mg的耳组织，打碎，加入200微升的缓冲液GA、20微升的Proteinase K和4微升Rnase A(100mg/ml)，56℃水浴至组织完全裂解。b)向裂解液中加入200微升缓冲液GB，充分颠倒混匀后，70℃放置10分钟,简短离心去除管盖内壁的水滴。c)加200微升无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心除去管盖内壁的水滴。d)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，弃滤液。e)向吸附柱CP3中加入500微升缓冲液GD，12000rpm离心30秒，弃滤液。f)将600微升的漂洗液PW加入至CP3中，12000rpm离心30秒，弃滤液。g)重复操作步骤f。h)将吸附柱CP3放回收集管上，12000rpm离心2分钟，弃废液。i)将吸附柱CP3安置于新的1.5ml的离心管上，室温静置数分钟，在吸附膜的中央处悬空滴加80微升的灭菌水，室温静置5分钟。j)12000rpm离心2分钟洗脱DNA。
(2)调整各个基因组浓度成为40ng/μl，以此作为模板进行PCR扩增，分装后-20℃保存。
2、第二轮PCR扩增
设计以下PCR反应体系：
(1)在灭菌PCR管中配制20μl反应体系
(2)将PCR管置于PCR仪中，进行如下反应程序
注：1：南京诺唯赞生物科技有限公司
3、琼脂糖凝胶检测
(1)制作1.5％的琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖放入三角烧瓶中，加入100ml 1×TAE溶液，放于微波炉中加热使之完全溶解，取出冷却至约60℃时，将琼脂糖胶倒入插有胶梳的模具中，并检查有无气泡存在。室温放置30min待凝胶完全凝固后，小心拔出胶梳，浸没于加有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中。
(2)PCR产物电泳：用移液器吸取6μl PCR扩增产物依次加入到凝胶孔中，同时点4μl DNA Maker作为参照，120V恒压电泳，待指示剂到达胶块的2/3处停止电泳，然后将凝胶放到溴化乙锭溶液中，染色10分钟，将凝胶拿出放到紫外灯下观察并拍照记录。
六、结果分析
实例1经过第一轮PCR，筛选出两个扩增条带清晰且重复性好的组合，分别是Primer CT与Primer L1-3'UTR和Primer TC与Primer L1-3'UTR，并对其出现的条带清晰、易于分辨、具有品种差异性的条带进行克隆测序，通过序列分析和设计了14条旁侧特异性引物后，进行了第二轮PCR。通过第二轮PCR对待验证分子标记引物的筛选，最终获得8个有效的标记，在7个品种内和品种间能清晰扩出条带且有多态性。实例2经过第一轮PCR，筛选出两个扩增条带清晰且重复性好的组合，分别是Primer CT与Primer L1-5'UTR和Primer TC与Primer L1-5'UTR，并对其出现的条带清晰、易于分辨、具有品种差异性的条带进行克隆测序，通过序列分析和设计了3条旁侧特异性引物后，进行了第二轮PCR。通过第二轮PCR对待验证分子标记引物的筛选，最终获得2个有效的标记，在8个品种内和品种间能清晰扩出条带且有多态性。部分检测结果如图1，图2，图3，图4所示。图1所示LINE1特异性引物Primer L1-3'UTR与微卫星引物Primer TC组合在7个不同品种的不同个体中的扩增结果。图2所示8个有效标记在7个不同品种的不同个体的扩增结果。图3所示LINE1特异性引物Primer L1-5'UTR与微卫星引物Primer TC组合在8个不同品种的不同个体中的扩增结果。图4所示2个有效标记在8个不同品种的不同个体的扩增结果。
七、结论
经过两轮实验验证，共获得10个基于LINE1插入多态性的分子标记，能够在品种内或品种间产生清晰且具有多态的检测结果，可以为品种鉴定提供鉴定方法，可以作为个体鉴定，分子辅助育种的良好标记。本专利所述方法具有检测成本低，重复性好，结果清晰等优点；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 一种基于LINE1转座子与微卫星引物相结合的猪基因组分子标记的挖掘方法
<130>
<160> 51
<170> PatentIn version 3.3
<210>1
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>1
gagaggacaa gatggcggag gagtaggggg acacgctcgc cctctcccac aaacacaaca 60
aaaaaagcac atctacagaa gaaatgactc gcacagaaca acaaccaatc gctggcagag 120
gaacctaaac tccaataacg gcaagaagtt cgtgacatta ttgggcagaa cgggagaaaa 180
gaggagagtg agagaaggtg aatccgagcg ggacgggcgc tcccgaaagg gaactgcgga 240
ggagaaaggg atcccgcacc ctggaaagtc tcctaccggg ggaaagatca aacgaaccgg 300
aggaatctcc agatgcagag aagagtgtag cagtaagtcg gagtacggaa aaacgatcaa 360
gaacccaacg gaccatctga actacgggca cagtcaccaa aaattgagac gcctgggtgg 420
gggctgggca ccgaatcctc ggctccagag gttagtcccc gggaaagggc cgggggacgc 480
ctgggtgggg gctgggcacc 500
<210>2
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>2
ggagggatta agatggcgga atagaaggac tggagctcaa cttctctcct aaaaacaaca 60
aaattcacaa ctaaagactg agcactcttc acccaaatgg accggaaacc ttaaaaaaga 120
taccctactc cagaagaaaa agaggaggcc acatcaagag gtaggagggg cgatttcaga 180
tataaacaac cccatacctc ctgggtggga agctccacag actggaaact aactggttca 240
cagagactca cctacaggag tgagagttct gagccccaca tcaaactctc acgtgtgggg 300
atctggcacg ggagaaagag ccccggagca tctggcattg aaggccagtg gggcttgtgc 360
gcaggagctc cacgggactg ggggaaacgg agaccccatt cttaaaaggc gcacacagac 420
tttcacgtgc actgggtccc agggcaaagc aaagtctcca tgggaatctg ggtcaaacct 480
gactgcagtt cttggaggac 500
<210>3
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>3
ggaaggatca agatggcaga ggagtaagag tgtgctcacc ttctcccaca aacacatcaa 60
aaaaaaaatc tacatgtaga agattcacac agaacatcta ctgaatgctg gcagaagaac 120
ttaaacctcc aaaaagggca agaaaccctc cacataactg ggtagaacaa aagaaaaaaa 180
agagagagag aaaaggaatc aggatgggac tagcattcct gagagggagc tgtaagagaa 240
aaggaaccca caccctggga agccacctaa ccgagggaga tcagcagatg gagggacctc 300
aaagtcactg agaaaagcac agcagctgga ctgaggaggg caaagcagag tgagagccac 360
acagatcatc tgcaccactg cccggacacc acagcctgag atgctcgggg gggctgggca 420
ctgagactca ggctccgagg tcagttctgg gagaggacta ggttggctgt gtggagacag 480
cctgaggggc tagggagcag 500
<210>4
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>4
gggaggcgga gcaagatggc agaggagtaa gaggtcgcgc acaccttctc ccacaaacac 60
atcaaaaaaa cacatctaca tgtaaaacta ctccacagaa catcaactga atgctggcag 120
aagaacttaa acctccaaaa agggcaagaa actcttgaca taactgggta gaacaaaaga 180
aaaaaaagag agagaaaagg aatcaggatg ggactagcat tcccgagagg gagctgtgaa 240
ggagaaaagg aacccacctc ctgggaagcc acctaactga cgaaagatcg ctgagtcggg 300
ggacctcaaa gtccgagaaa agcgcagcag ctggactgag aacagcaaag cagagtgaga 360
gccgcacaga tcatctgaac cacggccgga caccacagcc tgagatgctc gggcgggggc 420
tgggcctgag actcaggctc cggaggtcag tcccggggag agaactgggg atggcatgag 480
gggctaagga gcagtgccca 500
<210>5
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>5
gggtcaagat ggcagaggag taagagtggc actcaccttc tcccacaaaa caaaaaaaaa 60
accatctaca tgtagaacaa ttcacagaac atctactgaa cactggcaga agaccttaaa 120
cctccaaaaa gggcaagaaa ccctccacat aactgggtag aacaaaagga aaaaaagaga 180
gagagaaaag aaaaaaaaga atcaggatgg accagcactc ctgagaggga gctgtgaaag 240
aggaaaggaa tctgcacctg ggaggccacc taactgatgg ggagatcagc caggatagag 300
ggggacctca aagcctcgag aaaagcacag cagccagact gaggagggca aagcagagag 360
agagcccaca gaccatcggt accactcccg gacaccacag cctgagacac tcgggggggc 420
tgggcactga gactcaggct tgaggtcagt tccagggaga ggactagggt tggctgtgtg 480
gagacagcct gaggggctag 500
<210>6
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>6
ggacagatgg gaggataaga tcctaccttc tcccacaaac acatcaaaaa aacacatcta 60
catgtaaaaa ctcaacagaa catcactaat gctggcagaa gaacttaaac ctccaaaaag 120
ggcaagaaac tcttgacata actgtagaac aaaagaaaaa aaaagagaaa aagaatcagg 180
atggactagc attcctgaga gggagctgtg aagagaaaag gaacacatcc tgggaagcca 240
cctaactgac gaatcacagg acctcaaagc cagaaaagaa gcagctggac tgagagcaaa 300
gagagtgaga cccacagatc atctgcacca ccgacaccac acctagagct cgggggctgg 360
gctgagactt aggctccgag gtcagtcggg agaggactgg gtggcgtgtg ggaagcctaa 420
gggctagagc agtgtgccat ggtgggatgg ttcaggctgg ggagggaacc agcagaggga 480
accggagaag gtctggcctg 500
<210>7
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>7
gggaggagca agatggcgga agagtagggg gacatgctcg ccctctccca caaacacaac 60
aacaaaaaaa cacatctaca ggttaaatga ctcacacaga acagcaataa tcgctggcag 120
aagaacctaa actccaataa tggcaagaat ctcgtgacat aactgggtaa aacaagagaa 180
aagaggagag tgagagaagg ggaatcgagc tggacggggc tcctgaaagg gaactgtgga 240
ggagaaaggg atcccacacc ctggaaagtc acctactcga ggaaagatca accaatcgga 300
gggatctcca gatgcagaga agagtgcagc agtaagtcga gttctgaaaa gcagagcgag 360
aaccaaacag atcatctgaa ctactggcac agtcaccaaa aattgagacg cttgggtggg 420
ggctgggcac cgagacctcg gctctggagg ttagtccccg ggaacgtggg ggcgggggga 480
gactgcttgg ggggtctagg 500
<210>8
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>8
gagcaagatg gtggaggagt aagagtctgc tcaccttctc ccacaaacac atcaaaaaaa 60
aacaatctac atgtaaaacg actcgcacag aacatcaact gaatgctggc agaagaactt 120
aaacctccaa aaagggcaag aaactcttga cataactggg tagaacaaaa gaaaaaaaga 180
gagagaaaag gaatcaggat gggactagca ttcctgagag ggagctgtga aggagaaaag 240
gaacccacat cctgggaagc cacctaactg acgaaagatc agctgagatg gagggacctc 300
aaagtcacca agaaaagcac agcagctgga ctgaggacgg aaagcagagt gagagcccac 360
agatcatctg aaccacggcc cagacaccac agcctgagat gctcgggcgg ggctggggct 420
gagacttagg ctctggaggt cgcctattcc cactgtgacc acacagaaag cagaaatatc 480
aaccaggggt tcttgcatag 500
<210>9
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>9
ggaggcaaga tggcggaaga gtagggggac gcgctcgccc tctcccacaa acacaacaaa 60
aaaacacatc tacacgtaaa gactcacaca gaacagcaac tgaatgctgg cagaagaact 120
taaacctcca aaaaggcaag aatctcttga cataactggg taaaacaaga gaaaagagga 180
gagagagaga aggggaatca ggacggactg gcactcctga gagggaactg tgaaggagaa 240
agggaaccca caccctggaa agtcacctaa ccacggaaag atcaactgag ttggagggat 300
ctccagaccg agaaaagtgc agcagcaggt ctgagatctg aaaagcagag tgagagccac 360
acagatcatc tgaaccactg gcacagacac caaaaacgag atgcttgggt gggggctggg 420
caccgagacc taggctccga ggttagtccc tgggagcggg ctggggttgg cggtgtggag 480
acagcctgag ggactaggaa 500
<210>10
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>10
gggggcaaga tggagaagag taagaggagc tcaccctctc ccacaaacac atcaaaaaaa 60
cacatctaca tgtaaaagat tcacacagaa catcaactga atgctggcag aagaacttaa 120
acctccaaaa agggcaagaa actcttgaca taactgggta gaacaaaaga aaaaagagag 180
agagaaaagg aatcaggatg ggactagcac tccctgaggg agctgtgaag gagaaaggga 240
acccacaccc tgggaagcca cctaaccaac ggaaagatca gccgagtcgg agggaactcc 300
aagaagccaa gaaaagcaca gcagcaggtc tgagaaccaa aaagcagagt gagagatgca 360
cagaccatct gaaccactgg cacagacacc acagcctgag atgctcggtg ggggctgggc 420
actgagactt aggctccaga ggtcagtccc agggagcggc tggggttggg tgtggagaca 480
gcctaaggga ctagggagca 500
<210>11
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>11
ggagcaagat gggaagagta gggggagctg ccctctccca caaacacaaa aaaaacacat 60
ctacagtaaa cactcacaga acagcaactg aatgctggca gaagaactta aacctccaaa 120
aaggcaagaa tctcttgaca taactgggta aaacaagaga aaagaggaga ggagagaagg 180
ggaatcagga cggacggcac tccgagaggg aactgtgaag gagaaaggga acccacaccc 240
tggaaagtca cctaaagaaa gatcaacagt cgagggatct ccagacagaa aagccagcag 300
aggtctgaga tctgaaaagc agagtgagag cacagatcat ctgaaccact ggcacagaca 360
ccaaaaacga gatgctgggt gggggctggg caccagacct aggctcgagg ttagtccctg 420
ggagggctgg ggttgggtgt ggagacagcc tgagggatag gaaggtgtgg tggagggagc 480
aatactaagg gctggggagt 500
<210>12
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>12
ggggaggtct aagatggcgg agtagcagga cgtaaggctc atctactccc acaaatacat 60
tgaaaataca actatatgtg gaactattcg cacagaaaat ttgcgaaaaa ctgacaaaag 120
acctcaagat tatgatagaa caagaaaaac attacaaaac cagataggac ataagaaaga 180
agaagaacaa gagaaaaaga agcgaaagga aatgagatgg gacctgctct cccaggaggg 240
agctggaaag aggaatagct cctgcacccc gggaagttcc cccaccagcg acgagatcag 300
ccaaaaacgg aggaggaact ctagacaaat ggtctgaagc agttaagaag gagacagtcc 360
tccacaaacg gtcagtgcta cgggcaacgg gcaaccgtag gcgggtgcca gcaggtgttg 420
ggaactaaaa ctttggcctt agagatcaga cccaaagagg gagctggggc cggctacgtg 480
gggggaaaaa actgggttgg 500
<210>13
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>13
attcttacca gttaagttat tctttttatt atgctatata aaatatttaa tggtatataa 60
ggctttcttc tttataaatt ttagttgcat aatatacaca attttaatat aatgctaatt 120
tttaaagaaa aattgaaatg taatagataa tactaaatag taaagatgaa agccatacaa 180
aatgggataa agcatagaat aaatttccta tttgtctcag catattttcc attccacttc 240
tccagaggga gacacttaat ctgtttctta agatccatga tataataatc tgtctgaatg 300
taattgtgtt taaatatatg tattttattc tgtaaaaaaa aaatattctg tgataatcta 360
tgtgggaaaa gaatgtgaaa gggaatggat gtgtgtacat gtataactga atctctttgt 420
tgtacagcag aaattatcac aaccttgtaa atcaactata cttcaataaa ttttttttaa 480
aaaaaatgaa aaaaaaaaaa 500
<210>14
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>14
gggcatctat ccagagaaaa ccagactcgc aaagacacat gtactccaat gttcattgca 60
gcactattta caatagccaa gacatggaaa caacctaaat gtccatcgac agaggagtgg 120
atcaagaaga tgtggtacat atacacaatg gaatattact cagccattaa aaagaacgaa 180
ataccagcat ttttagcaac atggatggac ctagaaacta tcatgctaag tgaagtcagc 240
catacaatga gacaccaaca tcaaatgctt tcactgacat gtggaatctg aaaaaaggac 300
agactgaact tctttgcaga acagatgctg actcacagac attgaaaaac ttatggtctc 360
cggaggagac agtttggggg gtggggggat gtgcttgggc tgtgggatgg aaatcctgtg 420
aaatcagatt gttatgatca ttatacaact acagatgtga taaattcatt tgagtaataa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500
<210>15
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>15
aagaagatgt ggtatatata cacaatggaa tactactcag ccataaaaaa gaacaaaata 60
atgccatttg cagcaacatg gatggaacta gagactctca tactaagtga agtaagtcag 120
aaagagaaag acaaatacca tatgatatca cttatatctg gaatctaata tatggcacaa 180
atgaaccttt ccacagaaaa gaaactcatg gacttggaga acagacttgt ggttgccaag 240
ggggaggggg agggagtggg atggactggg agtttggggt taatagatgc aaactattgc 300
atttggaatg gataagcaat gagatcctgc tgtatagcac agggaactat atctagtcac 360
ttgtgatgga acatgatgga ggataatgtg agaaaaagaa tgtatatatt atgttactgg 420
gtcactttgc tgtacagtag aaaatgacag aacactgtaa acaactataa tggaaaaaat 480
aaaaatcata aaaaaaaaaa 500
<210>16
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>16
acaacccaaa tgtccatcga cagatgattg gattcggaag agtggtatat atacacaatg 60
gaatactact cagccataaa aaaggatgac ataatgccat ttgcagcaac atggatggaa 120
ctagagaatc tcatcctgag tgaaatgagc cagaaagaca aagacaaata ccatatgata 180
tcacttataa ctggaatcta atatccagca caaatgaaca tctcctcaga aaagaaaatc 240
atggacttgg agaagagact tgtggttgcc tgatgggagg gggagggagt gggagggatc 300
gggagcttgg gcttatcaga cacaactaga atagatttac aaggagatcc tgctgaatag 360
cattgagaac tatgtctaga tactcatgtt gcaacagaag aaatggtggg ggaaaaactg 420
taattgtaat gtatacatgt aaggataacc tgaccccctt gctgtacagt gggaaaataa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500
<210>17
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>17
aattggtgca accactgtgg aaaacagtat ggagattcct cagaaaacta aaaatagaac 60
taccatttga tccagcaatc ccactcctgg gcatctatcc agagaaaacc agactgcaaa 120
gacacatgta ctccaatgtt cattgcagca ctatttgcaa tagccaagac atggaaacaa 180
cctaaatgtc catcgacaga ggagtggatc aagaagatgt ggtacatgga gttcccgtcg 240
tggcgcagtg gttaacgaat ccgactagga accatgaggt tgcgggttcg atccctggcc 300
ttgctcagtg ggttaaggat ctggcattgc cgtgagctgt ggtgtaggtt gcagacgcgg 360
ctcggatccc gcgttgctgt ggctctggcg taggccggtg gctacagctc cgattagacc 420
cctagcctgg gaacctccat atgcccagga gcggcccaag aaaagcaaaa aacaaaaaga 480
caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500
<210>18
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>18
acagatgaat ggattaagaa gatgtggtac atatacacaa tggaatacta ctcagccata 60
aaaaagaaca aaataatgcc atttgcagca acatggatgg aactagagat tctcatacta 120
agtgaagtaa gtcagaaaga gaaagacaaa taccatatga tatcacttat atgtggaatc 180
taaaatatgg cacaaatgaa cctatctaca aacagaaaca gactcacaga catggagaac 240
agacttgtgg ttgccaaggg gagggggagg gagtgggatg gactgggagt ttggggttag 300
tagatgcaaa ctattacatt tagaatggat aagcaatgag gtcctgctgt atagcacagg 360
gaactatatc caatcacttg tgatagaaca tgatggaaga taatatgaga aaaaatgtat 420
atatatttat actgggtcac tttgctgtac agcagaaatt gaaaatattt aaaaatataa 480
taaataaaaa attaaaaaaa 500
<210>19
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>19
atgattggat taggaatgtg gtatatatac acaatggaat actactcagc cataaaaaag 60
aacaaaataa tgccatttgc agcaacatgg atggaactag agactctcat actgagtgaa 120
gtaagtcaga aagagaaaga caaataccat atgatatcac ttatatctgg aatctaatat 180
aggcacaaat gaacctttcc acagaaaaga aaatcatgga cttggagaat agacttgtgg 240
ttgccaaggg ggagggggag ggagtggggt ggattgggag cttggggtta atagatgcaa 300
actattgcct ttggaatgga ttagcaatga gatcctgctg tgtagcactg ggaactatgt 360
ctagtcactt atgatggagc atgataatgt gagaaaatag aatgtgtaca tgtatgtgta 420
actgggtcac catgctgtac agtagaaaaa aaaattgtat tggggaaata actattaaaa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500
<210>20
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>20
catggaaaca acccaaatgt ccatacagat gattggatta ggaagatgtg gtatatatac 60
acaatggaat actactcagc cataaaaaag aacaaataat gccatttgca gcaacatgga 120
tggaactaga gactctcata ctgagtgaat aagtcagaaa gagaaagaca aataccatat 180
gatatcacta tatctggaat ctaatataca gacaaatgaa cctttccaca gaaaagaaaa 240
tcatggactt ggagaataga cttgtggttg cctgggggag gggagggagt gggagggatt 300
gggagcttgg ggttaaggat gcaaactatt gctcttggaa tggatttaca atgagatcct 360
gctgtgtagc actgagaact atgtctagat actaaagcag catgacaatg ggagaaaaaa 420
ttatgtatac atgtatgtgt aactggtccc atgctgtaca gtggaaaaaa aaagtgttaa 480
aaataaaaaa aaaataaaaa 500
<210>21
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>21
gcactattca caatagccag acatggaaac aacccaaatg tccatcacag atgattggat 60
tggaagatgt ggtatatata cacaatggaa tactactcag ccataaaaaa atgacataat 120
gccatttgca gcaacatgga tggaactaga gactctcata ctgagtgaaa tgagtcagaa 180
agacaaagac aaataccata tgatatcact tataactgga atctaatatc agcacaaatg 240
aacatttcca cagaaaagaa aatcatggac ttggagaata gacttgtggc tgccggggga 300
gagggaggga gtgggaggga tgggagcttg gggttatgat acaacttgga atggatttac 360
aagagatcct gctgagtagc attgagaact atgtctagat acttatattg caacagaaca 420
aagggtggga aaaaatgtat acatgtaagg taacttggtc cccatgctgt acagtggaaa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500
<210>22
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>22
agacaaaact ttcattcaaa aagatacatg cacctatgtt cattgcagca ctattcacaa 60
tagccaagac atggaaacaa cctaaatgtc catcacagat gaatggatta agaagatgtg 120
gtacatatac acaatggaat actactcagc cataaaaaga acaaaataat gccatttgca 180
gcaacatgga tggaactaga gattctcata ctaagtgaag taagtcagaa agagaaagac 240
aaataccata tgatatcact tatatgtgga atctaaaata tggcacagat gaacctatct 300
acagaaagaa acaactcacg acatggagaa cagacttgtg gttgccaagg gggggaggag 360
tgggatggac tgggagtttg gggttataga tgcaaactat tacatttaga atggataagc 420
aatgagatcc tgctgtatag cacagggaac tatatccaat cacttgtgat ggaacatgat 480
ggaagataat atgaaaaaaa 500
<210>23
<211>500
<212>DNA
<213>猪 (Sus scrofa )
<400>23
aatggattag gaagatgtgg tacatatata caatggaata ctactcagcc ataaaaaagg 60
acaaaataat gccatttgca gcaacatgga tggaactaga gactctcata ctgagtgaag 120
taagtcagaa agagaaagac agacaccata tgatatcact tatatgtgga gtctaaaata 180
tggcacaaat gatctatcta caaaacagaa aagatcatgg acatgtagga cagactcgtg 240
tttgccaggg gggaggggga gggagtggga tggattggga gtctggggtt agtagatgaa 300
aactcttgca tttggagtgg acgggcaatg agatcctgct gtatagcaca gggaactata 360
tatctaatca cttgtgatgg aacatgatgg aggataatgt gagaaaaaga atgtatatat 420
atgtatgact gggtcacttt gctgtacagc agaaattgac agaacattgt aaatcaatca 480
taaaaaattt aaaaaaaaaa 500
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
agaaatggtg ggggaaaaac tgt 23
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tcctccggtt cgtttgatct 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acacacacac acacacacac g 21
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
agagagagag agagagagag agagc 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ctctctctct ctctctctct ctctg 25
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cacacacaca cacacacaca g 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt c 21
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gagagagaga gagagagaga gagac 25
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg c 21
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tctctctctc tctctctctc tctcg 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
aacaacaaca acaacaacaa caacg 25
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
caacaacaac aacaacaaca acaacaag 28
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cctcctcctc ctcctcctg 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ctcctcctcc tcctcctcg 19
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt g 31
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ccttccctgt tggatgtttg c 21
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cctcggttgg ctctcatgt 19
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
caccttccca gtcacctcg 19
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
atccagctac ttccgagggt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gtgtctggac atctgtatgg gg 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
atgcttctct tgcagttccc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ctgccgttag tcatacactg ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gccccgtaga tatgcatttg agg 23
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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ccccaagatt tccccaaagc 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ggcctgagga aattgatgaa gg 22