本发明属于药物领域，具体涉及一种吡咯烷类BTK抑制剂，及其在用于预防和治疗BTK介导的疾病中的应用。
背景技术：
布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(Bruton’s tyrosine kinase，BTK)是B细胞受体通路的重要信号分子，在B淋巴细胞的各个发育阶段表达，参与调控B细胞的增殖、分化与凋亡，在恶性B细胞的生存及扩散中起着重要作用。
BTK抑制剂类小分子靶向药物为B细胞类恶性肿瘤及一些B细胞免疫类疾病的治疗提供了新的途径。已上市第一代BTK抑制剂依鲁替尼的单药临床治疗效果令人振奋，然而，依鲁替尼存在口服利用度偏低，血浆蛋白结合率高、长期用药安全性差(出血、骨髓抑制、肾毒性等)等问题。
Acalabrutinib，是一种高度选择性、不可逆的、第二代BTK抑制剂，能更有选择性地阻断BTK通路，同时不破坏其它对血小板和免疫功能重要的分子通路，从而避免或者降低和癌症疗法相关副作用的产生。
在一项用于复发性慢性淋巴细胞患者的I/II期临床研究中，接受Acalabrutinib治疗患者在平均随访14.3个月后总缓解率为95％，剩下的5％的患者病情稳定。伴17p13.1缺失的患者，总缓解率为100％。最常见的不良事件为头痛(43％)，腹泻(39％)以及体重增加(26％)，且大多数不良事件是1级或2级，耐受性好。
专利WO201301086/CN103889987A公开了Acalabrutinib和与其具有相同母核结构的化合物，并给出其制备方法及活性数据。但Acalabrutinib在人体内存在半衰期短、代谢快的问题，在人体中T1/2仅0.9小时左右。这意味着患者需要频繁服用药物或者将其制备为大剂量的缓释药物以保证治疗效果，患者依从性差，且增加了制剂的难度。
技术实现要素：
针对第二代BTK抑制剂Acalabrutinib存在半衰期短、代谢快的问题，本发明的目的在于提供一系列半衰期更长、更适于作为临床药物使用的BTK抑制剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种式I的化合物、立体异构体或其药学上可接受的盐：
其中，所述R为氢、烷基羰基、烷氧基羰基、环烷基羰基、环烷氧基羰基或芳基氧基羰基；R1为羟基、氰基、C1-4烷基、卤素或卤素取代的C1-4烷基；R2为氢、羟基、氰基、C1-4烷基、卤素或卤素取代的C1-4烷基；R3为氢、羟基、氰基、C1-4烷基、卤素或卤素取代的C1-4烷基。
根据本发明的一些具体实施例，式I的结构式可以进一步地由式II表示：
其中，所述R为氢、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基羰基、C3-8环烷基羰基、C3-8环烷氧基羰基、芳基氧基羰基；R2为氢、羟基、氰基、烷基、卤素或卤素取代的C1-4烷基；R3为氢、羟基、氰基、C1-4烷基、卤素或卤素取代的C1-4烷基。
根据一些较佳的实例，式II中R为氢、甲基羰基、乙基羰基、异丙基羰基、正丁基羰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、正丙氧基羰基、异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、异丁基氧基羰基、正戊基氧基羰基、1-甲基丁基氧基羰基；R2为氢、羟基、卤素或卤素取代的C1-4烷基；R3为氢、卤素或卤素取代的C1-4烷基。
本发明所述立体异构体优选为光学异构体。
进一步地，式II中所述卤素为氟，所述卤素取代的C1-4烷基为三氟甲基。
更进一步地，本发明所述的化合物、立体异构体或其药学上可接受的盐，其结构式选自下式之一：
本发明所述的盐包括但不限于乙酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐和硫酸盐等。
本发明还提供了含有式I或式II的化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐的药物组合物，所述组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明还进一步提供了含有式I或式II的化合物、立体异构体或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备预防或治疗布鲁顿酪氨酸激酶介导的疾病的药物中的用途。
所述布鲁顿酪氨酸激酶介导的疾病包括自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、天狼疮和系统性红斑狼疮等；和癌症，如慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、胃癌、巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤和胰腺癌等。
本发明的化合物、立体异构体或其药学上可接受的盐，可以按照包括以下步骤的方法制备：
中间体1制备：
中间体2的制备：
式I化合物的合成：
本发明的化合物在第二代BTK抑制剂的基础上加以改造，在其活性得到保证甚至提高的同时，还有效延长了药物半衰期，克服了Acalabrutinib存在的缺陷和不足，为临床用药提供了更优的选择可能性。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明作进一步的详细描述，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开的内容所作的任何本领域的等同置换，均属于本发明的保护范围。
其中化合物的结构是通过质谱(MS)或核磁共振(1HNMR)设备来确定的：
核磁共振(1HNMR)位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出；核磁共振(1HNMR)的测定是用BrukerAVANCE-300核磁仪，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10-6(ppm)作为单位给出。
质谱(MS)的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Therm，型号：Finnigan LCQ advantage MAX)进行。
薄层硅胶使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，柱层析一般使用烟台黄海硅胶200-300目硅胶为载体。
在本发明未给出特殊说明的情况本发明反应中提及的溶液是水溶液，术语“室温”是指10℃-25℃之间。
Acalabrutinib按照CN201280045383.3的方法制备。
实施例1化合物1的制备
中间体1-1硼酸的合成
在冰浴中向化合物1-1-1(12.4mmol)和吡啶-2-胺(24.5mmol)在吡啶(15ml)中的混合物中滴加POCL3(37mmol)。将悬浮液在室温下搅拌20分钟。将反应倒入水(100ml)中并用乙酸乙酯(3×40ml)萃取。有机相用饱和NaCl水溶液(2×50ml)洗涤。将有机项用无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过柱色谱法用乙酸乙酯/石油＝1：9～1：1进行纯化，得到3.28g产物1-1-2，收率：54％。
将化合物1-1-2，(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷(2.75g，10.83mmol)，PdCl2(dppf)(527mg,0.72mmol)和KOAc(235mg,2.4mmol)在甲苯(30ml)中的混合物加热至110℃保持6小时。将反应液蒸发并加入水(100ml)，将其用乙酸乙酯(2×40ml)萃取。分离有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过柱色谱法用乙酸乙酯/石油醚＝1：4～1：1进行纯化，得到2g化合物1-1-3产率：75％。
将化合物1-1-3(6.2mmol)在THF:H2O(24ml:6ml)的混合溶剂中的溶液中加入NaIO4(18.6mmol)，并在室温下搅拌30分钟。加入2N HCl水溶液。将其在室温下搅拌3小时。将混合物用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤。分离并用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过使用MeOH/DCM＝1：10的柱色谱法纯化得到1.2g中间体1-1，产率90％。
中间体1-2的合成
向化合物1-2-1(10.9mmol)和(3-氯吡嗪-2-基)甲胺盐酸盐(10.9mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中加入DIEA(43.6mmol)。将其在该温度下搅拌过夜。倒入水(100ml)中，分离有机相。水相用二氯甲烷(2×30ml)萃取。分离有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发。残余物通过柱色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚＝1：5洗脱得到3.02g化合物1-2-2，产率70％
将化合物1-2-2(2.1mmol)溶于乙腈(65ml)中，加入1，3-二甲基-2-咪唑烷酮(6.3mmol)，将混合物冷却至0℃回流过夜。将反应混合物小心地倒入25％氢氧化铵水溶液(25ml)/碎冰(50ml)中，得到黄色悬浮液，将其搅拌15分钟直至悬浮液中不存在冰。加入乙酸乙酯，分离各层，水层用乙酸乙酯萃取。将有机层合并，用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。使用硅胶色谱法(庚烷/乙酸乙酯)纯化，得到160mg化合物1-2-3，产率20％。
向化合物1-2-3(5.23mmol)的DNF(2ml)溶液中加入NIS(10.46mmol)，加热至60℃2小时。倒入水(40ml)中，用乙酸乙酯(2×20ml)萃取。有机相用饱和NaHCO3水溶液洗涤。分离有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法用乙酸乙酯/石油醚＝1：6洗脱纯化得到810mg化合物1-2-4，产率：31％。
化合物1-2-4(1.18mmol)在IPA(30ml)中的溶液中加入氨水(6ml)并加热至120℃5小时。蒸发溶剂并加入1ml饱和NaHCO3水溶液和20ml水。用乙酸乙酯(2×20ml)萃取。分离有机相并用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将其通过柱色谱法用MeOH/DCM(1：20)纯化，得到350mg中间体1-2，产率：60％。
将化合物1-2(0.06mmol)，化合物1-1(0.074mmol)，Pd(PPh3)4(0.006mmol)和Cs2CO3(0.074mmol)混合物加热至80℃过夜。将其浓缩并通过柱色谱法纯化，用EA-MeOH/DCM(1：40)洗脱得到23mg化合物1-3，产率：70％。
向化合物1-3(0.036mmol)的DCM(5ml)溶液中加入HBr(33％，在AcOH中)溶液(3滴)。将悬浮液在室温下搅拌2小时。蒸发溶剂得到粗产品1-4的氢溴酸盐，不经纯化直接用于下一步反应。
向氢溴酸盐1-4(0.045mmol)的DMF(1ml)溶液中加入HATU(0.023mmol)和丁-2-炔酸(0.023mmol)在DMF中的混合物，然后加入DIEA(0.225mmol)，将反应在室温下搅拌10分钟。加入水(20ml)，用乙酸乙酯(2×10ml)萃取。有机相用饱和NaCl水溶液(2×10ml)洗涤。分离有机相并干燥。将其蒸发并通过TLC柱纯化，得到5mg化合物1。
MS m/z(ES):511.1[M+1]。
1H NMR(300MHz,d6-DMSO):11.10(m,1H),8.02-8.10(m,2H),7.65-7.85(m,4H),7.35(d,2H),7.14(m,1H),6.64(s,1H),4.60(t,1H),3.60-3.71(m,3H),2.11-2.35(m,2H),1.35(s,3H)。
实施例2～28化合物2～28的制备
采用实施例1的合成方法合成化合物2～28，其结构式、MS和1H NMR数据如下表所示：
实施例29化合物29的制备
取化合物25(0.21mmol)和DMAP(0.21mmol)于二氯甲烷中，加入吡啶(10ml)的二氯甲烷溶液，搅拌溶清，室温条件下，滴加氯甲酸异丙酯，反应2h后，加水20ml水终止反应，二氯甲烷萃取，有机相洗涤，干燥，抽滤，旋干，层析柱分离，得到白色固体化合物29。
MS m/z(ES):638.1[M+1]。
1HNMR(300MHz,d6-DMSO):11.08(m,1H),10.35(m,1H),8.64(s,1H),8.17-8.29(m,1H),8.04(d,1H),7.90(d,1H),7.68-7.81(m,4H),4.78-4.89(m,2H),3.54-3.58(m,2H),1.97-2.25(m,7H),1.15(d,6H)
实施例30～37化合物30～37的制备
采用同于实施例29的方法，以化合物19、25、26和Acalabrutinib为原料进一步制备化合物30～37，其结构式、MS和1HNMR数据如下表所示。
试验例1BTK的体外酶抑制活性测试
1.试验原理：
通过Envision检测Assay plate中的化学发光，以化合物的IC50值为指标，来评价化合物对BTK激酶的抑制作用。
2.试验方法：
将待测化合物以DMSO稀释到1mM备用。在使用前，再用超纯水将待测化合物稀释25倍，室温平衡30min待用。在Assay plate中，每个待测化合物(化合物29、30、31、32、33、34、36先用酰胺酯酶预处理))进行3倍梯度稀释，获得终浓度从1uM到0.017nM的11个浓度梯度；加入BTK激酶混合物到Assay plate中，室温孵育30min，再加入底物ATP混合物启动反应，室温孵育90min，加入终止液终止反应，室温孵育1小时，Envision读板，分析数据，计算化合物的IC50值。
表1实施化合物对BTK激酶的抑制作用
由表1可知，实施化合物对BTK激酶的抑制作用优于对照Acalabrutinib，尤其是实施例25化合物和实施列26化合物，可见苯环上氟的取代可提高对BTK的抑制作用。
试验例2大鼠体内的药代动力学试验
1、试验目的
大鼠静脉给药后测定血浆中各实施例化合物的浓度水平及其基本的药代动力学特点，并比较主要参数Cmax，T1/2，AUClast等的差异。
1、试验方法
雄性SD大鼠，每组8只，静脉给药剂量均为1mg/kg，将大鼠麻醉后于给药前、给药后0.25,0.5,1,2,4,6,8,24h从眼眶静脉丛取血，每个时间点取200μL全血，置于含有EDTA-K2的抗凝管中，4℃低温2000g离心后分离血浆，血浆转移至微量离心管中，保存于-20℃冰箱待用。
3、LC/MS/MS生物样品分析
AB API4000串联质谱仪，Agilent 1100HPLC-CTC autosampler，流动相:溶液A:10％ACN with 0.1％FA；溶液B:100％ACN with 0.1％FA，沉淀蛋白(10μl血浆加入10μl工作液，100μl乙腈沉淀蛋白，取出50μl上清加入100μl纯水)制备标准曲线和质控样品(超出定量上限的样品用空白裸鼠血浆稀释1倍后测定)，进样体积:10μl(注：实施例31，35、37血药浓度测定母体)。
4、统计学方法
采用WinNonlin V 6.2软件，计算Cmax，Tmax，T1/2，AUClast等进行药代参数数据分析。
5、试验结果
表2实施例化合物单次静脉注射后大鼠体内药代动力学试验结果
注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
与对照组Acalabrutinib化合物相比，本发明实施例化合物的T1/2、AUClast均有极显著或显著差异(*P＜0.05，**P＜0.01)，说明实施例化合物的药代动力学参数中半衰期更长，吸收更好。进一步的，说明本发明的化合物表现出更好的药代动力学性质，推测原因是空间位阻的增大，化合物的稳定性增加，从而延长实施例化合物的半衰期。