本发明属于农业生物技术领域，具体涉及与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的snp分子标记及其应用。
背景技术：
疫病是黄瓜的重要病害之一，由瓜类疫霉(phytophthorameloniskatsura)引起，在全国各黄瓜产区均有发生，特别是华南地区春、夏季节雨水多、湿度大，易引起疫病的暴发和传播。该病一旦发生，化学药剂难以控制，损失严重，一般年份减产30％，病害流行年份则几乎绝收，对黄瓜生产和育种构成严重威胁。目前，黄瓜资源中抗疫病材料及其匮乏，对黄瓜的抗疫病育种工作带来极大困难。
传统抗病育种，一般采用人工接种的方法鉴定黄瓜抗感性状，但是作为繁殖或者转育的材料，如果接种后将其移植大田，病原菌会很快传播到其他材料，后期防治困难，会给育种及生产工作造成很大损失。随着生物技术的快速发展，分子辅助育种已经开始应用，能够在苗期对植株进行分子检测，选择含有与目标性状连锁的分子标记的植株，从而加速育种进程，提高育种效率。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开一种与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的snp分子标记及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的snp分子标记，其为分子标记cs3419019，其特征在于，所述分子标记定位与黄瓜第5号染色体上，位于抗疫病基因的一侧。
根据权利要求1所述的与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的snp分子标记，其特征在于，所述分子标记cs3419019包含seqidno:1所示的核苷酸序列，所述seqidno:1所示的核苷酸序列自5’端起第174位碱基为snp位点，其碱基为c或者t；当碱基全为t时或者为t/c时，与分子标记连锁的性状表现为抗病；当碱基全为c时，植株性状表现为感病。
用于扩增权利上述snp分子标记的引物对。
优选的，该引物对为caps引物对。
优选的，该引物对的序列是：
cs-caps-f:5’-gattgatgtcggggaagatg-3’(seqidno:2)；
cs-caps-r:5’-tttccttggccgtcatatct-3’(seqidno:3)。
一种黄瓜抗疫病能力的检测试剂盒，试剂盒中含有检测snp分子标记cs3419019的试剂。
一种黄瓜抗疫病辅助育种的方法，包括如下步骤：
1)提取待测黄瓜基因组dna；
2)用特定的引物对进行pcr扩增；
3)用限制性内切酶进行酶切，根据酶切结果，判断植株的抗病性。
本发明的有益效果是：本发明可对黄瓜的育种后代进行苗期抗病性检测，有效地将含有抗疫病性状的植株保留下来。本发明不仅能够加快育种进程，降低育种成本，提高育种效率，还能够推进传统育种向分子育种的转变。本发明技术方法具有快速、准确、操作简单等优点，具有较大的应用前景。
附图说明
图1是f2群体中部分植株的snp检测情况；j为母本jsh，b为父本b80，1-18为抗性单株；19-33为感病单株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
1、遗传群体的构建
供试材料抗病亲本jsh为本单位搜集的地方资源经多年鉴定选育而成的高代自交系。感病材料b80为华北型高代自交系。jsh和b80杂交获得f1代，f1自交获得f2群体，用于抗病性状遗传分析和定位群体。
2、供试材料抗疫病性状的确定及遗传规律分析
以抗病亲本jsh和感病亲本b80构建f1和f2遗传分离群体，以p.melonis疫霉菌接种进行表型鉴定。结果显示：接种24h后50z株感病亲本绝大部分根部开始溢缩。接种72h全部死亡。而50株抗病亲本jsh死亡2株，50株f1群体，死亡2株，260株f2群体中191株表现抗病，69株表现感病，抗感分离比符合3:1(χ2＝0.33，p>0.05)。分析结果表明，jsh抗疫病性状由1个单显性基因控制。
3、基于slaf-seqsuperbsa技术，对黄瓜抗疫病基因的精细定位
本项目利用slaf-seqsuper技术结合集群分离分析方法(bsa)，将黄瓜jsh抗性基因进行定位，在黄瓜第5号染色体上，定位到一个关联区域，命名为cs3419019，关联区域的大小约为200kb，其序列是：
gcttccttgtccaagacatagattctcctagttctgaagacgtggttagtgccagagaatccctttcaagcgaagaaaggtgctccaatgttgaatttttagatgaagccttctgctctttgttggaaggggaggggagttcaagacggatcacagctgatagttcattggtactgaattcggactcctctgactcagactcctcggatgatctggatcttagtcagacctttccctccactgatggaatggaagagccctatctag(seqidno:1)。
4、caps标记的开发、扩增。
在定位区间内获得69个snp位点，下载69个snp位点上下游300bp的核苷酸序列，寻找可酶切的cap标记位点。完成snp到caps标记的转化。
用于扩增cs3419019标记的引物对序列如下：
cs-caps-f:5’-gattgatgtcggggaagatg-3’(seqidno:2)；
cs-caps-r:5’-tttccttggccgtcatatct-3’(seqidno:3)
如果snp碱基位点为c时，会被mspa1ⅰ识别并切割，被切成174bp和131bp两条片段。当出现不被切开或者部分切开的片段时，植株表现为抗病性状，当出现被完整切成两条较短片段时，植株表现为感病性状。
pcr体系(20μl)
dna模板：5ng
引物正向：0.5μl
引物反向：0.5μl
dntp:2.0μl(使用浓度2.0mm)
mg2+:1.2μl(使用浓度2.5mm)
10×pcrbuffer:2.0μl
taq酶：0.2μl
ddh20:补足20μl
pcr扩增程序：
94℃预变性5min后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环后，72℃保持7min，然后置于16℃保存待检测。
酶切体系10μl，内切酶0.3μl，buffer1μl，pcr产物5μl，ddh2o补足10μl。
在亲本间进行pcr扩增，酶切后在浓度为3％琼脂糖凝胶电泳检测，亲本间表现特异性，并在f2代群体中筛选出抗感极端株共33株进行检测(图1)。后代表型与亲本表现差异一致。可以用来鉴定黄瓜的抗疫病性状。
效果检测
随机取f2代分离群体61株，进行人工接种鉴定，确定表型后，提取基因组dna，用实例1的方法进行pcr扩增，并用内切酶进行酶切。结果，在抗病株中，有4株基因型为感病株，感病株中有2株表现为抗病基因型。因此检测效率为90.2％。可以用于分子辅助育种。
sequencelisting
<110>广东省农业科学院蔬菜研究所
<120>与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的snp分子标记及其应用
<130>
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>267
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
gcttccttgtccaagacatagattctcctagttctgaagacgtggttagtgccagagaat60
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tgttggaaggggaggggagttcaagacggatcacagctgatagttcattggtactgaatt180
cggactcctctgactcagactcctcggatgatctggatcttagtcagacctttccctcca240
ctgatggaatggaagagccctatctag267
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