一种简单快速的植物基因组DNA的提取方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种简单快速的植物基因组dna的提取方法。

背景技术：

随着分子生物学研究快速的发展，尤其是近年来植物分子生物学研究的突飞猛进，植物基因组dna提取作为一项基本的技术在植物分子生物学的研究中使用越来越频繁。植物突变体的筛选，植物遗传转化后转基因的鉴定，植物基因组编辑的检测都需要高通量、快速、便捷的植物基因组dna提取手段。目前高通量植物基因组提取多依赖于特定的仪器或者试剂盒，这些对一些经费不是很充足的实验室显然是不可能实现的。传统的依赖于研钵研磨样品需要消耗大量的液氮同时需要大量的人力和时间，很难达到高通量快速的效果。由于需要多次样品的转移，很容易造成样品的污染。

技术实现要素：

本发明克服了现有植物基因组dna提取方法的弊端，基于当前植物基因组dna提取的需求，提供了一种简单快速的植物基因组dna的提取方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种简单快速的植物基因组dna的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：在2mlep管中放入一粒5mm钢珠或两粒3mm钢珠；将ctab溶液放置于65℃烘箱中预热；

步骤2：将新鲜幼嫩的植物叶片一端放入含有钢珠的ep管中，扣盖时利用ep管盖将管内外的植物组织切断，完成取样；

步骤3：接着将ep管放置于ep管板的一端，取另一ep管板夹住ep管，然后将夹有ep管的ep管板在液氮中放置2min后取出；

步骤4：上下剧烈晃动ep管板，直至植物组织破碎；

步骤5：向ep管中加入500～800微升预热的ctab溶液，上下轻柔颠倒至均匀，然后放置于65℃烘箱中20～60min，期间每隔10min取出ep管上下轻柔颠倒混匀；

步骤6：然后在通风橱中向ep管中加入与步骤5中ctab溶液等体积的抽提液，上下颠倒混匀，室温静置5min至分层；

步骤7：12000rpm离心5min；

步骤8：取上清至一新的1.5mlep管中，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20min；

步骤9：12000rpm离心10～15min；

步骤10：弃上清，用1ml体积分数70%或75%乙醇洗沉淀1～2次，弃上清，离心，用移液器吸去多余液体；

步骤11：在超净工作台上打开ep管盖，吹风5～10min，然后加100微升含有rnasea的蒸馏水溶解dna。

进一步地，所述ctab溶液的配方为：2.6%（m/v）的ctab，13%（v/v）的ph8.0的1mtris-hcl，5.265%（m/v）的nacl，2.6%（v/v）的0.5medta，加无菌水配制完成后进行过滤除菌或高温灭菌，使用前加2%（v/v）的β-巯基乙醇；m表示质量，v表示ctab溶液体积。

优选地，步骤6中所述抽提液为氯仿或体积比为24:1的氯仿：异戊醇混合液。

优选地，步骤7中所述离心的温度为4℃或室温。

优选地，步骤9中所述离心的温度为4℃或室温。

本发明中所述ep管为eppendorf离心管。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明方法可以方便快捷高通量地对植物基因组dna进行提取，不需要研磨仪等仪器，液氮消耗极少，不需要酚等危险性较高的试剂，节约了成本，提高了实验的安全性。

2、本发明优化了ctab提取液配方，适当提高了ctab浓度，从而提高了多糖多酚植物的基因组dna提取质量。

3、本发明直接用离心管取样的方法，避免取样时造成的样品间污染。

4、本发明改变了样品磨碎方法，用装有钢珠的ep管在液氮中冷冻后打碎样品，大大节省液氮的消耗，同时极大限度避免样品间的污染。

5、本发明在ep管中粉碎样品，减少粉碎后植物组织粉末的转移步骤，极大限度的减少样品浪费。

6、本发明优化了操作步骤，避免了酚等毒性较大试剂的使用。

7、本发明适用于多种植物基因组dna的提取。

附图说明

图1为植物组织dna提取示意图；a为ep管取样；b为利用ep管板固定含有样品和钢珠的ep管，液氮速冻后，上下颠倒以打碎植物组织。

图2为棉花基因组dna电泳图，m为15kmarker，泳道1～3均为棉花基因组dna。

图3为拟南芥基因组dna电泳图，m为15kmarker，泳道1～3均为拟南芥基因组dna。

图4为大豆基因组dna电泳图，m为15kmarker，泳道1～3均为大豆基因组dna。

图5为水稻基因组dna电泳图，m为15kmarker，泳道1～3均为水稻基因组dna。

图6为小麦基因组dna电泳图，m为15kmarker，泳道1～3均为小麦基因组dna。

图7为玉米基因组dna电泳图，m为15kmarker，泳道1～3均为玉米基因组dna。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

所有实施例中的电泳检测使用的琼脂糖凝胶购自北京全式金生物技术有限公司，电泳使用的15kmarker购自北京全式金生物技术有限公司，从上到下依次为15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、1500bp、1000bp、500bp。

所有实施例中，所用ctab溶液的配制方法为：称取ctab2.6g、nacl5.265g，使用移液器量取ph8.0的1mtris-hcl13ml、0.5medta2.6ml，加无菌水至98ml，过滤除菌，使用前加入2ml的β-巯基乙醇。

实施例1提取棉花叶片基因组dna

步骤1.1：在2mlep管中放入5mm钢珠一粒，将ctab溶液放置于65℃烘箱预热；

步骤1.2：将棉花幼嫩叶片，一端放入含有钢珠的ep管中，扣盖将管内外的棉花组织切断，完成取样；

步骤1.3：将装有棉花叶片的ep管放置于ep管板的一端，取另一ep管板夹住ep管，将夹有ep管的ep管板放于液氮中2min使材料冻透，然后取出；

步骤1.4：上下颠倒ep管板，使棉花叶片粉碎；

步骤1.5：向ep管中加入500微升预热的ctab溶液，上下颠倒至均匀，然后放置于65℃烘箱中20min，期间每隔10min取出上下颠倒混匀；

步骤1.6：然后在通风橱中向ep管中加入500微升体积比为24:1的氯仿：异戊醇混合液，上下颠倒混匀，室温静置5min至分层；

步骤1.7：4℃离心，12000rpm离心5min；

步骤1.8：取上清至一新的1.5mlep管中，上清略微泛紫，然后加入等体积的异丙醇，有些许絮状物出现，-20℃放置20min；

步骤1.9：4℃离心，12000rpm离心10min；

步骤1.10：弃上清，可见白色沉淀在管底，用1ml体积分数75%乙醇洗沉淀2次；弃上清，离心，用移液器吸去多余液体；

步骤1.11：超净工作台打开ep管盖吹5min，加100微升含有rnasea的蒸馏水溶解dna；然后取2微升dna溶液，与1微升dnaloadingbuffer混合后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图2。

实施例2提取拟南芥叶片基因组dna

步骤2.1：在2mlep管中放入3mm钢珠两粒，将ctab溶液放置于65℃烘箱预热；

步骤2.2：将拟南芥叶片幼嫩叶片，一端放入含有钢珠的ep管中，扣盖将管内外的拟南芥组织切断，完成取样；

步骤2.3：将装有拟南芥叶片的ep管放置于ep管板的一端，取另一ep管板夹住ep管，将夹有ep管的ep管板放于液氮中2min使材料冻透，然后取出；

步骤2.4：上下颠倒ep管板，使拟南芥叶片粉碎；

步骤2.5：向ep管中加入600微升预热的ctab溶液，上下颠倒至均匀，然后放置于65℃烘箱中30min，期间每隔10min取出上下颠倒混匀；

步骤2.6：然后在通风橱中向ep管中加入600微升氯仿，上下颠倒混匀，室温静置5min至分层；

步骤2.7：室温离心，12000rpm离心5min；

步骤2.8：取上清至一新的1.5mlep管中，然后加入等体积的异丙醇，有些许絮状物出现，-20℃放置20min；

步骤2.9：室温离心，12000rpm离心11min；

步骤2.10：弃上清，可见白色沉淀在管底，用1ml体积分数70%乙醇洗沉淀1次；弃上清，离心，用移液器吸去多余液体；

步骤2.11：超净工作台打开ep管盖吹6min，加100微升含有rnasea的蒸馏水溶解dna；然后取2微升dna溶液，与1微升dnaloadingbuffer混合后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图3。

实施例3提取大豆叶片基因组dna

步骤3.1：在2mlep管中放入3mm钢珠两粒，将ctab溶液放置于65℃烘箱预热；

步骤3.2：将大豆叶片幼嫩叶片，一端放入含有钢珠的ep管中，扣盖将管内外的大豆组织切断，完成取样；

步骤3.3：将装有大豆叶片的ep管放置于ep管板的一端，取另一ep管板夹住ep管，将夹有ep管的ep管板放于液氮中2min使材料冻透，然后取出；

步骤3.4：上下颠倒ep管板，使大豆叶片粉碎；

步骤3.5：向ep管中加入700微升预热的ctab溶液，上下颠倒至均匀，然后放置于65℃烘箱中40min，期间每隔10min取出上下颠倒混匀；

步骤3.6：然后在通风橱中向ep管中加入700微升氯仿，上下颠倒混匀，室温静置5min至分层；

步骤3.7：4℃离心，12000rpm离心5min；

步骤3.8：取上清至一新的1.5mlep管中，然后加入等体积的异丙醇，有些许絮状物出现，-20℃放置20min；

步骤3.9：室温离心，12000rpm离心12min；

步骤3.10：弃上清，可见白色沉淀在管底，用1ml体积分数75%乙醇洗沉淀1次；弃上清，离心，用移液器吸去多余液体；

步骤3.11：超净工作台打开ep管盖吹7min，加100微升含有rnasea的蒸馏水溶解dna；然后取2微升dna溶液，与1微升dnaloadingbuffer混合后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图4。

实施例4提取水稻叶片基因组dna

步骤4.1：在2mlep管中放入5mm钢珠一粒，将ctab溶液放置于65℃烘箱预热；

步骤4.2：将水稻叶片幼嫩叶片，一端放入含有钢珠的ep管中，扣盖将管内外的水稻组织切断，完成取样；

步骤4.3：将装有水稻叶片的ep管放置于ep管板的一端，取另一ep管板夹住ep管，将夹有ep管的ep管板放于液氮中2min使材料冻透，然后取出；

步骤4.4：上下颠倒ep管板，使水稻叶片粉碎；

步骤4.5：向ep管中加入800微升预热的ctab溶液，上下颠倒至均匀，然后放置于65℃烘箱中50min，期间每隔10min取出上下颠倒混匀；

步骤4.6：然后在通风橱中向ep管中加入800微升氯仿，上下颠倒混匀，室温静置5min至分层；

步骤4.7：室温离心，12000rpm离心5min；

步骤4.8：取上清至一新的1.5mlep管中，然后加入等体积的异丙醇，有些许絮状物出现，-20℃放置20min；

步骤4.9：4℃离心，12000rpm离心13min；

步骤4.10：弃上清，可见白色沉淀在管底，用1ml体积分数70%乙醇洗沉淀2次；弃上清，离心，用移液器吸去多余液体；

步骤4.11：超净工作台打开ep管盖吹8min，加100微升含有rnasea的蒸馏水溶解dna；然后取2微升dna溶液，与1微升dnaloadingbuffer混合后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图5。

实施例5提取小麦叶片基因组dna

步骤5.1：在2mlep管中放入3mm钢珠两粒，将ctab溶液放置于65℃烘箱预热；

步骤5.2：将小麦叶片幼嫩叶片，一端放入含有钢珠的ep管中，扣盖将管内外的小麦组织切断，完成取样；

步骤5.3：将装有小麦叶片的ep管放置于ep管板的一端，取另一ep管板夹住ep管，将夹有ep管的ep管板放于液氮中2min使材料冻透，然后取出；

步骤5.4：上下颠倒ep管板，使小麦叶片粉碎；

步骤5.5：向ep管中加入800微升预热的ctab溶液，上下颠倒至均匀，然后放置于65℃烘箱中60min，期间每隔10min取出上下颠倒混匀；

步骤5.6：然后在通风橱中向ep管中加入800微升氯仿，上下颠倒混匀，室温静置5min至分层；

步骤5.7：4℃离心，12000rpm离心5min；

步骤5.8：取上清至一新的1.5mlep管中，然后加入等体积的异丙醇，有些许絮状物出现，-20℃放置20min；

步骤5.9：4℃离心，12000rpm离心14min；

步骤5.10：弃上清，可见白色沉淀在管底，用1ml体积分数75%乙醇洗沉淀2次；弃上清，离心，用移液器吸去多余液体；

步骤5.11：超净工作台打开ep管盖吹9min，加100微升含有rnasea的蒸馏水溶解dna；然后取2微升dna溶液，与1微升dnaloadingbuffer混合后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图6。

实施例6提取玉米叶片基因组dna

步骤6.1：在2mlep管中放入3mm钢珠两粒，将ctab溶液放置于65℃烘箱预热；

步骤6.2：将玉米叶片幼嫩叶片，一端放入含有钢珠的ep管中，扣盖将管内外的玉米组织切断，完成取样；

步骤6.3：将装有玉米叶片的ep管放置于ep管板的一端，取另一ep管板夹住ep管，将夹有ep管的ep管板放于液氮中2min使材料冻透，然后取出；

步骤6.4：上下颠倒ep管板，使玉米叶片粉碎；

步骤6.5：向ep管中加入800微升预热的ctab溶液，上下颠倒至均匀，然后放置于65℃烘箱60min，期间每隔10min取出上下颠倒混匀；

步骤6.6：然后在通风橱中向ep管中加入800微升体积比为24:1的氯仿：异戊醇混合液，上下颠倒混匀，室温静置5min至分层；

步骤6.7：4℃离心，12000rpm离心5min；

步骤6.8：取上清至一新的1.5mlep管中，然后加入等体积的异丙醇，有些许絮状物出现，-20℃放置20min；

步骤6.9：4℃离心，12000rpm离心15min；

步骤6.10：弃上清，可见白色沉淀在管底，用1ml体积分数75%乙醇洗沉淀2次；弃上清，离心，用移液器吸去多余液体；

步骤6.11：超净工作台打开ep管盖吹10min，加100微升含有rnasea的蒸馏水溶解dna；然后取2微升dna溶液，与1微升dnaloadingbuffer混合后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图7。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。