本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种热稳定性高的碱性蛋白酶bmp突变体及其编码基因和应用。
背景技术：
：蛋白酶能使蛋白质降解生成氨基酸、多肽，因其也能够分解多肽，所以也称为肽酶。由于蛋白酶具有的水解作用，蛋白酶被广泛用于食品、洗涤、饲料等工业领域。蛋白酶根据作用ph环境，可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶。酸性蛋白酶主要来源于曲霉、木霉等丝状真菌，中性和碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌。目前芽孢杆菌属蛋白酶的研究主要集中于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌蛋白酶，其他芽孢杆菌类的蛋白酶研究相对较少。本实验室前期通过克隆表达得到了莫海威芽孢杆菌(bacillusmojavensis)的碱性蛋白酶简称bmp，通过对不同蛋白质原料(包括豆粕、羽毛等)的分解实验，发现bmp具有很好的分解能力，在食品及饲料等工业领域具有很大的应用潜力。但是bmp热稳定性差，在高温(温度大于70℃)下容易分解失活，限制了其产业化应用。因此提高bmp的热稳定性，是bmp产业化应用急需解决的问题。中国专利申请201110220386.3从微生物特别是嗜碱芽孢杆菌分离野生型碱性蛋白酶基因，对其glu110、glu134的氨基酸残基进行突变，经在枯草芽孢杆菌中高效表达，检测其发酵液酶活力达到1985u/ml，在40℃下，该低温碱性蛋白酶(glu110&134ala)比野生型碱性蛋白酶活力提高了28％；在10℃下，比野生型碱性蛋白酶活力提高了62％。中国专利申请201080019156.4提供一种碱性蛋白酶变体，其源自于由seqidno：2表示的氨基酸序列构成的或由与其具有90％或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，该变体具有突变，其中一个或多个选自于所述seqidno：2表示的氨基酸序列的(a)位点6、(b)位点15、(c)位点16、(d)位点65、(e)位点66、(f)位点82、(g)位点83、(h)位点204、(i)位点319和(j)位点337或其对应位点的氨基酸残基被取代。201310243800.1涉及一种耐有机溶剂蛋白酶，具体涉及其突变基因及其编码的蛋白质。从序列表的seqidno：1或seqidno：3可见，本发明所述耐有机溶剂碱性蛋白酶在原核苷酸序列的第385或第436发生了定点突变，即其成熟肽段的第24位突变氨基酸为谷氨酸或者谷氨酰胺；第41位氨基酸为丙氨酸或者赖氨酸。突变后的四种编码后的蛋白质的有机溶剂，特别是亲水性有机溶剂的耐受性明显大大加强。技术实现要素：本发明对来源于莫海威芽孢杆菌(bacillusmojavensis)碱性蛋白酶bmp进行蛋白质分子改造，从而提高bmp在高温环境下的稳定性，为bmp的产业化应用奠定基础。本发明的目的是提供一种热稳定性高的bmp的突变体bmp-mut。本发明的再一目的是提供提高热稳定性bmp突变体bmp-mut的编码基因。一种热稳定性高的碱性蛋白酶bmp突变体，其核苷酸序列如seqidno.2所示，氨基酸序列如seqidno.4所示。原始碱性蛋白酶bmp的核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.3所示。与碱性蛋白酶bmp相比，突变体bmp-mut包含的突变位点为t175i、g210q和g270s。突变体bmp-mut在75℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而碱性蛋白酶bmp在75℃水浴5min后的酶活保留率仅为9％。因此，本发明的获得的碱性蛋白酶突变体bmp-mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。上述所述的热稳定性高的碱性蛋白酶bmp突变体，其最适反应ph为10.0，最适反应温度为75℃。一种获得上述热稳定性高的碱性蛋白酶bmp突变体的突变方法，其包括如下步骤：1)碱性蛋白酶bmp基因合成及克隆：根据已报道莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶基因序列直接合成目的基因，然后以合成基因为模板，进行pcr扩增，将扩增得到的片段克隆到载体phyp43l，得到表达载体phyp43l-bmp；2)理性设计定点饱和突变：以构建好的phyp43l-bmp为模板，以相应的突变引物进行pcr扩增；将扩增好的pcr产物进行琼脂糖电泳并纯化回收pcr产物。用限制性内切酶dpni将原始质粒分解，将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌top10，通过菌液pcr验证重组转化子，提取验证正确转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，通过电转化转入枯草芽孢杆菌wb600。如上所述的获得上述热稳定性高的碱性蛋白酶bmp突变体的突变方法，所述步骤1)中pcr扩增引物为r：5'-atcgggatccgctcaaccggcgaaaaatgtt-3'和f：5'-tctagcggccgcttattgagcggcagcttcgac-3'。本发明还请求保护一种包含seqidno：2核苷酸序列的tdl-mut基因。本发明还请求保护一种包含所述的碱性蛋白酶bmp突变体基因的重组载体。本发明还请求保护一种所述的碱性蛋白酶bmp突变体基因的重组菌株。本发明还请求保护一种所述的碱性蛋白酶bmp突变体在制备去污剂、洗涤剂、化妆品、食品、饲料和药品中的应用。本发明突变体bmp-mut在75℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而碱性蛋白酶bmp在75℃水浴5min后的酶活保留率仅为9％。因此，本发明的获得的碱性蛋白酶突变体bmp-mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。附图说明图1碱性蛋白酶bmp三维结构图。图2碱性蛋白酶bmp和突变体bmp-mut的最适反应ph。图3碱性蛋白酶bmp和突变体bmp-mut的ph稳定性。图4碱性蛋白酶bmp和突变体bmp-mut的最适反应温度。具体实施方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂：1、菌株与载体大肠杆菌菌株topl0、枯草芽孢杆菌wb600、表达载体phyp43l均由本实验室保藏。2、酶与试剂盒q5高保真taq酶mix购自neb公司，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。3、培养基大肠杆菌培养基为lb(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl，ph7.0)。枯草芽孢培养基为lbk，即lb培养基加卡那霉素。实施例1、莫海威芽孢杆菌(bacillusmojavensis)碱性蛋白酶bmp基因的克隆根据已报道莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶基因序列(genebank:ay665611.1)直接合成目的基因。根据合成的目的基因设计两条引物(r：5'-atcgggatccgctcaaccggcgaaaaatgtt-3'和f：5'-tctagcggccgcttattgagcggcagcttcgac-3')用于扩增莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶bmp基因。将扩增的pcr产物纯化回收，连接到表达载体phyp43l，得到表达载体phyp43l-bmp。实施例2、理性设计定点饱和突变通过同源建模软件对碱性蛋白酶bmp进行建模，得到bmp三维空间构象图(如图1所示)。通过生物信息学软件对构建后的bmp模型进行蛋白最小能量化计算，找到关键氨基酸位点第175位、第210位和第270位。通过饱和突变研究第175位、第210位和第270位对碱性蛋白酶bmp热稳定性的影响。定点饱和突变的过程如下：以构建好的phyp43l-bmp为模板，以相应的突变引物进行pcr扩增；将扩增好的pcr产物进行琼脂糖电泳并纯化回收pcr产物。用限制性内切酶dpni将原始质粒分解，将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌top10，通过菌液pcr验证重组转化子，提取验证正确转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，通过电转化转入枯草芽孢杆菌wb600。重组转化子的筛选如下：首先将在卡那霉素抗性板上生长的重组菌接入lbk培养基中，37℃，200rpm培养24小时；将培养后的菌液离心取上清，进行酶活测定，酶活测定方法参照国标gbt/28715-2012进行；在75℃，水浴处理5分钟条件下测定突变体的热稳定性。实验结果如表1所示，由表1可知：175位饱和突变后只有2个突变氨基酸可提高热稳定性，其中t175i保留率为30％，t175q保留率为14％；210位饱和突变后只有3个突变氨基酸可提高热稳定性，其中g210q保留率为36％，g210m保留率为12％，g210w保留率为18％；270位饱和突变后只有3个突变氨基酸可提高热稳定性，其中g270s保留率为48％，g270t保留率为13％，g270i保留率为15％。表1原始碱性蛋白酶bmp和突变体热稳定性编号保留率(％)原始碱性蛋白酶bmp8t175i30t175q14g210q36g210m12g210w18g270s48g270t13g270i15实施例3、组合突变及突变体热稳定性分析通过组合单点突变最终得到一个突变体命名为bmp-mut，其包含的突变位点为t175i、g210q和g270s。为了精确比较原始碱性蛋白酶bmp和突变体bmp-mut的热稳定性，首先对相应的蛋白酶进行纯化，纯化方法为镍柱纯化。将纯化好的碱性蛋白酶bmp和突变体bmp-mut，在75℃，水浴处理5分钟条件下测定热稳定性。通过实验最终确定突变体bmp-mut在该条件下的保留率为70％。表2原始碱性蛋白酶bmp和组合突变体热稳定性编号保留率(％)原始碱性蛋白酶bmp9bmp-mut70实施例5、碱性蛋白酶bmp及突变体bmp-mut的最适反应ph及ph稳定性参照国标方法测定碱性蛋白酶bmp及突变体bmp-mut的最适反应ph。碱性蛋白酶bmp及突变体bmp-mut的最适反应ph如图2所示。由图2可知，突变体bmp-mut的最适ph几乎和原始碱性蛋白酶bmp一样，均为10.0。将碱性蛋白酶bmp及突变体bmp-mut分别在ph6-11条件下室温处理2小时，然后参照国标的方法测定酶活，结果如图3所示。由图3可知突变体bmp-mut在酸性条件下的稳定性要好于原始碱性蛋白酶bmp。实施例6、碱性蛋白酶bmp及突变体bmp-mut的最适反应温度参照国标方法测定碱性蛋白酶bmp及突变体bmp-mut的最适反应温度，结果如图4所示。由图4可知，碱性蛋白酶bmp的最适反应温度为65℃，而突变体bmp-mut的最适反应温度为75℃。序列表<110>横琴仲泰生物医药有限公司<120>一种热稳定性高的碱性蛋白酶bmp突变体及其编码基因<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1140<212>dna<213>bacillusmojavensis<400>1atgatgaggaaaaagagtttttggcttgggatgctgacggccttcatgctcgtgttcacg60atggcattcggcgattccgcttctgctgctcaaccggcgaaaaatgttgaaaaggattat120attgtcggatttaagtcaggagtgaaaaccgcatctgtcaaaaaggacatcatcaaagag180agcggcggaaaagtggacaagcagtttagaatcatcaacgcggcaaaagcgaagctagac240aaagaagcgcttaaggaagtcaaaaatgatccggatgtcgcttatgtggaagaggatcat300gtggcccatgccttggcgcaaaccgttccttacggcattcctctcattaaagcggacaaa360gtgcaggctcaaggctttaagggagcgaatgtaaaagtagccgtcctggatacaggaatc420caagcttctcatccggacttgaacgtagtcggcggagcaagctttgtggctggcgaagct480tataacaccgacggcaacggacacggcacgcatgttgccggtacagtagctgcgcttgac540aatacaacgggtgtattaggcgttgcgccaagcgtatccttgtacgc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