本发明涉及一种大黄酸的提取富集方法，属于天然药物化学技术领域。
背景技术：
经临床研究发现，大黄主要有效活性成分为蒽醌类成分，在植物体内包含游离态和与糖结合成苷类两种形态，含量约为3％-5％，主要包括大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、土大黄素、大黄酸甲醚等。其中，对于各单体成分的药理研究也很多，经大量的研究已经表明，大黄酸具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌等作用，此外对肝、肾、软骨等具有保护作用，被认为是具有多靶点多功能的药物之一。
从目前文献报道来看，现有大黄酸的合成方法产率较低，一些合成路线成本较高，不适于大量大黄酸的获取，工厂的生产还是以从含量较高的中药大黄中提取分离大黄酸为主，因此，对大黄酸提取富集工艺研究是有必要而且非常重要的。
目前大黄酸的提取富集方法一般采用醇提，由于醇提液在浓缩过程中冷凝出来的溶液并非相应比例的醇溶液，故醇回收液每次使用均需调节醇浓度，存在操作麻烦，成本高，材料耗费量大的问题，另外，在收集醇提液时，在进行滤除药渣的过程中，由于糖类等一系列成分的存在，过滤步骤很难进行，给实际生产带来了困难。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种操作步骤简单易行，大黄酸成品纯度高，收率高，成本低的大黄酸的提取富集方法；进一步地，本发明提供一种重结晶产率高、纯度高的大黄酸的提取富集方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
大黄酸的提取富集方法，包括以下步骤：称取适量大黄粉末，加入相当于药材重量4～10倍量的10～30％h2so4溶液，加热至80～100℃水解0.5～2h，趁热滤过，将药渣水洗至ph为5～7，晾干，药渣再用10倍量的氯仿加热回流提取4～8h，药渣与氯仿的比例为重量体积比，水洗氯仿提取液3～5次，弃去水洗液，然后氯仿层以ph为6.5～8.0的磷酸缓冲液萃取2～5次，合并磷酸缓冲液层，以1～3mol·l-1hcl调节ph至2～4，析出沉淀，离心得沉淀，水洗沉淀3～5次，重复离心，干燥后得大黄酸粗提物，再以乙酸甲醇混合溶液重结晶，得最终产物。
所述氯仿提取液可替换为乙酸乙酯或丙酮。
所述重结晶的步骤为：乙酸加入量为大黄酸粗提物的100倍，大黄酸粗提物与乙酸的比例为重量体积比，加热至60～70℃，逐滴加入甲醇，待大黄酸粗提物完全溶解后，停止加热，冷却至室温，沉淀析出，过滤，干燥，即可得到精制的大黄酸成品。
所述重结晶时的加热方法包括水浴加热。
所述磷酸缓冲液由nah2po4和na2hpo4配制得到。
所述磷酸缓冲液的配制方法为：
磷酸缓冲液配制方法：0.2mol/l的nah2po4的配制：称取31.21gnah2po4·2h2o加水定容至1000ml；0.2mol/l的na2hpo4的配制：称取71.64gna2hpo4·12h2o加水定容至1000ml；取39ml0.2mol/l的nah2po4溶液和61ml0.2mol/l的na2hpo4溶液混合即得ph＝7的磷酸缓冲液；取68.5ml0.2mol/l的nah2po4溶液和31.5ml0.2mol/l的na2hpo4溶液混合既得ph＝6.5的磷酸缓冲液；取5.3ml0.2mol/l的nah2po4溶液和94.7ml0.2mol/l的na2hpo4溶液混合既得ph＝8.0的磷酸缓冲液。
所述大黄酸粗提物的干燥方法包括冷冻干燥。
所述大黄包括掌叶大黄。
本发明提供的一种大黄酸的提取富集方法，本发明的路线方法简单，操作步骤简单易行，对比例的路线有一些不足之处：首先无法进行醇溶液的索氏提取，因为不同比例的醇溶液在进行索氏提取时，冷凝下来的液体不是相应比例的醇溶液；其次，在进行滤除药渣的过程中，由于糖类等一系列成分存在，抽滤步骤很难进行，最后，从实验成本出发，对比例的路线所需材料等费用更多，成本更高。而且本发明的产率比对比例的产率更高，分析原因可能是对比例在多次反复的操作过程中造成产物的损失。综合各方面，认为本发明的工艺适合大黄酸提取富集，并且纯度高达95％以上，操作步骤简单易行，大黄酸成品纯度高，收率高，成本低。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为本发明的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
1.仪器和试剂
仪器与试剂：圆底烧瓶；烧杯；分液漏斗；恒压滴液漏斗；分析天平(赛多利斯)；冷凝管；旋转蒸发仪(re-52aa，上海亚荣生化仪器厂)；数显恒温水浴锅(hh-4，常州国华电器有限公司)；高效液相色谱仪(岛津)，硅胶gf254薄层预制板(自制)；甲醇；乙醇；三氯甲烷；乙酸；丙酮；乙酸乙酯；石油醚，所用试剂均为分析纯；浓h2so4；碳酸氢钠溶液；磷酸缓冲溶液；浓hcl；大黄粉末；大黄酸标准品(购自中国食品药品检定研究院)。
2.试剂配制方法
20％h2so4配制方法：10ml的浓硫酸溶液于不断搅拌的条件下加入到80ml的水溶液中，搅拌冷却即得20％h2so4溶液；
磷酸缓冲液配制方法：0.2mol/l的nah2po4的配制：称取31.21gnah2po4·2h2o，加水定容至1000ml；0.2mol/l的na2hpo4的配制：称取71.64gna2hpo4·12h2o加水定容至1000ml；取39ml0.2mol/l的nah2po4溶液和61ml0.2mol/l的na2hpo4溶液混合即得ph＝7的磷酸缓冲液；取68.5ml0.2mol/l的nah2po4溶液和31.5ml0.2mol/l的na2hpo4溶液混合既得ph＝6.5的磷酸缓冲液；取5.3ml0.2mol/l的nah2po4溶液和94.7ml0.2mol/l的na2hpo4溶液混合既得ph＝8.0的磷酸缓冲液。
2mol/l盐酸配制方法：量取16ml浓盐酸搅拌条件下加水定容至100ml即得2mol/l盐酸。
3.大黄酸纯度及含量测定
在大黄酸的纯度及含量的测定中，我们采用外标法测定含量，面积归一化法测定纯度，在进行检测之前，我们进行了标准曲线的绘制，保证大黄酸在此方法此浓度范围内呈现良好的线性。
4.色谱条件
色谱柱：shimadzuvp-ods(150*4.6mm，serialno.6062087)；流动相：甲醇∶水∶乙酸＝350∶50∶2.5；流速：1.0ml/min；检测波长：428nm；柱温：25℃；进样量：20μl；
5.大黄酸对照品溶液的配制：精密称取大黄酸对照品17.9mg置于250ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声溶解10min，得大黄酸对照品贮备液；
6.标准曲线的绘制
精密量取80ml大黄酸对照品贮备液置于100ml容量瓶中甲醇定容至刻度得浓度为0.05728mg/ml对照品溶液；精密量取80ml浓度为0.05728mg/ml对照品溶液置于100ml容量瓶中甲醇定容至刻度得浓度为0.045824mg/ml对照品溶液；精密量取80ml浓度为0.045824mg/ml对照品溶液置于100ml容量瓶中甲醇定容至刻度得浓度为0.03666mg/ml对照品溶液；精密量取80ml浓度为0.03666mg/ml对照品溶液置于100ml容量瓶中甲醇定容至刻度得浓度为0.029328mg/ml对照品溶液；精密量取80ml浓度为0.029328mg/ml对照品溶液置于100ml容量瓶中甲醇定容至刻度得浓度为0.02346mg/ml对照品溶液，分别进样20μl，记录色谱图数据，以浓度(mg/ml)为横坐标x，峰面积为纵坐标y，进行线性回归，得回归方程为：a＝5×107c+164120.3806(r2＝0.99464)。
表1不同浓度的对照品溶液的吸收峰面积
对比例
一定量大黄粉末分别用10倍量50％、80％、95％乙醇，80℃提取两次，每次半小时，抽滤后收集滤液，蒸干，分别以约10倍量20％h2so4溶液水解1h，冷却后用10％naoh调ph＝3，以三氯甲烷为溶剂萃取后，再用ph＝7的磷酸缓冲溶液萃取3次，合并磷酸缓冲液，2mol·l-1hcl调节至ph＝3，析出沉淀，离心，水洗4次，冷冻干燥后得到大黄酸产物。
实施例1
如图1～图2所示，大黄酸的提取富集方法，包括以下步骤：称取10g掌叶大黄粉末，加入20％h2so4溶液100ml直火加热至90℃水解1h，趁热抽滤，将药渣水洗至ph＝6，晾干，10倍量的氯仿加热回流提取5h，药渣与氯仿的比例为重量体积比，水洗氯仿提取液4次，弃去水洗液，然后氯仿层以ph＝7的磷酸缓冲液萃取3次，合并磷酸缓冲液层，以2mol·l-1hcl调节至ph＝3，析出沉淀，离心得沉淀，水洗沉淀4次，重复离心，冷冻干燥后得大黄酸粗提物，再以乙酸甲醇混合溶液重结晶，得最终产物。
所述重结晶的步骤为：称取341mg的大黄酸粗提物置于100ml三颈瓶中，加入100倍量的乙酸，大黄酸粗提物与乙酸的比例为重量体积比，水浴加热至60～70℃，逐滴加入甲醇，待大黄酸粗提物完全溶解后，停止加热，冷却至室温，沉淀析出，过滤，干燥，得到大黄酸沉淀228mg，重结晶产率约为：66.9％。
含量测定：我们采用外标法进行含量的测定，分别精密称取对照品9.4mg、实施例1的大黄酸重结晶供试品12.4mg、实施例1的大黄酸粗提物43.3mg置于250ml容量瓶中，甲醇定容至刻度线，分别进样20μl，记录色谱图数据，由公式c供＝c对×a供/a对得到大黄酸产物纯度。
表2标准品与供试品大黄酸吸收峰面积
由表格中数据可得到c实施例1重结晶供＝0.04845mg/ml，计算出实施例1的重结晶后的供试品大黄酸的含量为：0.04845mg/ml×250ml×100％/12.4mg＝97.7％。
由表格中数据可得到c实施例1大黄酸粗提物供＝0.1423mg/ml，计算出实施例1的大黄酸粗提取供试品中大黄酸的含量为：0.1423mg/ml×250ml×100％/43.3mg＝82.2％。
由于对比例在做醇溶液提取的时候，提取同样质量的大黄药材时，发现最终只能得到痕迹量的大黄酸粗品，故没有进行醇提取供试品的液相分析，从产率的角度上考虑可直接不考虑采用醇提取的方法。
由此可知，实施例1的大黄酸粗提物产率显著高于对比例的产率，故采用实施例1的工艺提取得到的大黄酸纯度高，产率高，便于重结晶。重结晶后大黄酸的纯度高达95％以上，且重结晶得率高，整个工艺操作步骤简单易行，成本低，适于工业化生产。
本发明的实验尝试两种不同的工艺路线，经过实验对比我们发现，实施例1的路线方法简单，操作步骤简单易行，对比例的路线有一些不足之处：首先无法进行醇溶液的索氏提取，因为不同比例的醇溶液在进行索氏提取时，冷凝下来的液体不是相应比例的醇溶液；其次，在进行滤除药渣的过程中，由于糖类等一系列成分存在，抽滤步骤很难进行，最后，从实验成本出发，对比例的路线所需材料等费用更多，成本更高。而且实施例1的产率比对比例的产率更高，分析原因可能是对比例在多次反复的操作过程中造成产物的损失。综合各方面，认为实施例1的工艺适合大黄酸提取富集，并且纯度高达95％以上；
对于实施例1的工艺方法的优化：之前我们使用石油醚提取来替换氯仿提取，发现石油醚能提取出大量的大黄素甲醚，tlc板检测发现只有痕迹量的大黄素和芦荟大黄素，其次，我们考虑用混合溶剂(pe/chcl3；pe/etoac)提取，以期望除去大黄药材中比大黄酸极性小的其他蒽醌类成分(大黄素，大黄素甲醚，芦荟大黄素等)之后，再提取大黄酸，但用该装置提取时，冷凝出来的混合溶剂比例已经改变，不是预设比例，无法达到预期效果；
在萃取chcl3提取液之前，我们尝试利用2.5％nahco3溶液萃取，结果经tlc检测发现仍含有较多大黄素，但无芦荟大黄素，也尝试了2.0％nahco3，1.5％nahco3，1.0％nahco3溶液分别萃取，均不能完全去除大黄素，后来尝试使用磷酸缓冲盐溶液萃取，平行实验了ph＝7；ph＝7.5；ph＝8的缓冲溶液，结果发现ph＝7时的萃取产物在tlc板上显示最纯净，因此采用ph＝7的磷酸缓冲盐溶液萃取chcl3层，在萃取次数的选用时，我们发现当萃取到第四次时的萃取液经调酸化已经无沉淀产生，故决定选用萃取次数为3次；
在获得氯仿提取液时，我们首先尝试了直接采用磷酸缓冲液进行萃取，也未经重结晶，获得的大黄酸产品纯度为83.82％，并且发现在大黄酸的保留时间之前仍有大量的杂质吸收，所以，我们先用水萃洗氯仿层3遍后再用磷酸缓冲液萃取，制得的大黄酸纯度为88.38％，仍然没有达到纯度90％以上的要求，故进行了重结晶的操作。
在进行重结晶条件的摸索时，尝试了氯仿/丙酮(使用丙酮而不是甲醇或乙醇，主要是考虑到大黄酸中的羧基若采用醇溶液作为重结晶溶剂，在加热条件下可能会有酯化的杂质产生)，由于其溶解性太差，导致重结晶产率低，最后使用冰醋酸以及逐滴加入甲醇的方法进行重结晶，可以取得质量较好的重结晶产物。
实施例2
如图1～图2所示，大黄酸的提取富集方法，包括以下步骤：称取10g掌叶大黄粉末，加入10％h2so4溶液40ml直火加热至80℃水解0.5h，趁热抽滤，将药渣水洗至ph＝5，晾干，10倍量的氯仿加热回流提取4h，药渣与氯仿的比例为重量体积比，水洗氯仿提取液3次，弃去水洗液，然后氯仿层以ph＝6.5的磷酸缓冲液萃取2次，合并磷酸缓冲液层，以1mol·l-1hcl调节至ph＝2，析出沉淀，离心得沉淀，水洗沉淀3次，重复离心，冷冻干燥后得大黄酸粗提物，再以乙酸甲醇混合溶液重结晶，得最终产物。
所述重结晶的步骤为：称取341mg的大黄酸粗提物置于100ml三颈瓶中，加入100倍量的乙酸，大黄酸粗提物与乙酸的比例为重量体积比，水浴加热至60～70℃，逐滴加入甲醇，待大黄酸粗提物完全溶解后，停止加热，冷却至室温，沉淀析出，过滤，干燥，得到大黄酸沉淀205mg，重结晶产率约为：60.1％，重结晶后的大黄酸纯度为97.83％。
实施例3
如图1～图2所示，大黄酸的提取富集方法，包括以下步骤：称取10g掌叶大黄粉末，加入30％h2so4溶液80ml直火加热至100℃水解2h，趁热抽滤，将药渣水洗至ph＝7，晾干，10倍量的氯仿加热回流提取8h，药渣与氯仿的比例为重量体积比，水洗氯仿提取液5次，弃去水洗液，然后氯仿层以ph＝8.0的磷酸缓冲液萃取4次，合并磷酸缓冲液层，以3mol·l-1hcl调节至ph＝4，析出沉淀，离心得沉淀，水洗沉淀5次，重复离心，冷冻干燥后得大黄酸粗提物，再以乙酸甲醇混合溶液重结晶，得最终产物。
所述重结晶的步骤为：称取341mg的大黄酸粗提物置于100ml三颈瓶中，加入100倍量的乙酸，大黄酸粗提物与乙酸的比例为重量体积比，水浴加热至60～70℃，逐滴加入甲醇，待大黄酸粗提物完全溶解后，停止加热，冷却至室温，沉淀析出，过滤，干燥，得到大黄酸沉淀217mg，重结晶产率约为：63.6％，重结晶后的大黄酸纯度为96.18％。
本发明中的氯仿也可由乙酸乙酯或丙酮来替换，只是产物没有氯仿提取的纯净。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。