一种新的A/T到G/C碱基定点转换的基因编辑系统的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种新的a/t到g/c碱基定点转换的基因编辑系统。

背景技术：

自2013年以来，以crispr/cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物学领域的各个实验，正改变着传统的基因操作手段。

目前，基于胞嘧啶脱氨酶与crispr/cas9融合而成的单碱基基因编辑技术(baseeditor,be)在基因组上实现单个碱基c/g到t/a基因组定点编辑,已被报道可用于高效地进行基因组的基因突变或修复，疾病动物模型制作，基因治疗,基因功能筛选等。最近，新报道的基因基于腺苷脱氨酶与crispr/cas9融合而成的新的单碱基基因编辑技术(adeninebaseeditor,abe)(图1)也可在基因组上实现单个碱基a/t到g/c基因组定点编辑，进一步丰富了单碱基基因组编辑技术的工具箱。但目前报导的abe系统是基于spcas9改造而来，仅识别ngg为pam的靶点，因此其靶点在基因组上的覆盖度较低，极大的限制了abe系统应用范围。

因此，本领域迫切需要开发一种可识别其它类型pam，并且具有不引入dsb，indels及脱靶效应极低、更加安全高效的优点的单个碱基a/t到g/c基因组定点编辑编辑系统。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可识别其它类型pam，并且具有不引入dsb，indels及脱靶效应极低、更加安全高效的优点的单个碱基a/t到g/c基因组定点编辑编辑系统。

本发明第一方面提供了一种在细胞内进行基因定点替换的方法，包括步骤：

(i)提供一细胞以及第一载体和第二载体，其中所述第一载体含有第一核酸构建物，所述第二载体含有表达sgrna的表达盒，

其中，所述第一核苷酸具有5’-3’(5’至3’)的式i结构：

p1-x1-l1-x2-x3(i)；

其中，p1为第一启动子序列；

x1为腺嘌呤脱氨酶的编码序列；

l1为无或连接序列；

x2为突变型cas9核酸酶的编码序列，所述的cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；

x3为polya序列；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

所述表达sgrna的表达盒中的sgrna为ngan型sgrna或nnnrrt型sgrna，并且所述sgrna的第7、8和/或9位对应于预定发生高效a→g定点突变的位置(即为a)；

(ii)用所述的第一载体和第二载体感染所述的细胞，从而在所述细胞内进行基因定点替换。

在另一优选例中，所述第一载体和/或第二载体还含有表达筛选标记的表达盒。

在另一优选例中，所述第一载体、第二载体可以相同，可以不同。

在另一优选例中，所述第一载体和第二载体可以为同一载体。

在另一优选例中，所述筛选标记选自下组：绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性。

在另一优选例中，所述的细胞来自以下物种：人、非人哺乳动物、家禽、植物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、牛、猪、羊、马、狗、猫、非人灵长动物(如猴)。

在另一优选例中，所述的细胞选自下组：体细胞、干细胞、生殖细胞、非分裂细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述的细胞选自下组：肾细胞、上皮细胞、内皮细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述sgrna的第8和/或9位对应于预定发生高效地a→g定点突变的位置(即为a)。

在另一优选例中，所述x2元件靶向的pam序列为n1n2n3rrt(n1,n2＝a,t,c或g；n3＝a,t,c或g(优选a,t或c)；r＝a或g)或ngan(n＝a,t,c或g)。

本发明第二方面提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’(5’至3’)的式i结构：

p1-x1-l1-x2-x3(i)；

其中，p1为第一启动子序列；

x1为腺嘌呤脱氨酶的编码序列；

l1为无或连接序列；

x2为突变型cas9核酸酶的编码序列，所述的cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；

x3为polya序列；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

在另一优选例中，所述的第一启动子选自下组：cmv启动子、cag启动子、pgk启动子、或其组合。

在另一优选例中，所述第一启动子序列包括cmv启动子。

在另一优选例中，所述连接序列选自下组：xten、ggs、(ggs)3、(ggs)7、或其组合。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶为串联型腺嘌呤脱氨酶，所述串联型腺嘌呤脱氨酶结构如式ii所示：

z1-l2-z2(ii)

其中，

z1为野生型腺嘌呤脱氨酶tada的氨基酸序列；

l2为任选的连接肽序列；

z2为突变型腺嘌呤脱氨酶tada*的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列长度为1-300nt，较佳地1-100nt。

在另一优选例中，所述的l1和l2的序列长度各自独立地为30-120nt，较佳地，48-96nt，并且优选为3的倍数。

在另一优选例中，所述cas9核酸酶的来源选自下组：酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)、葡萄球菌(staphylococcusaureus)、酿脓链球菌突变体(streptococcuspyogenes)、金黄色葡萄球菌突变体(staphylococcusaureus)、或其组合。

在另一优选例中，所述cas9核酸酶包括cas9n。

在另一优选例中，所述cas9核酸酶为sacas9n。

在另一优选例中，所述cas9核酸酶选自下组：sacas9n(h840a)、sacas9n(d10a,h840a)、sacas9n(d10a,e782k,n968k,r1015h)、spcas9(d10a,d1135v,r1335q,t1337r)或其组合。

在另一优选例中，所述x2元件中，突变位点在sacas9核酸酶((登录号(geneid):2828033)的d10a位、e782k、n968k、和/或r1015h位。

在另一优选例中，所述x2元件中，突变位点在sacas9核酸酶((登录号(geneid):2828033)的h840a。

在另一优选例中，所述x2元件中，突变位点在sacas9核酸酶((登录号(geneid):2828033)的d10a、和/或h840a。

在另一优选例中，所述x2元件中，突变位点在sacas9核酸酶((登录号(geneid):2828033)的d10a、d1135v、r1335q、和/或t1337r。

在另一优选例中，所述的“无切割活性或单链切割活性”指cas9核酸酶对于靶位点a所在的单链无切割活性。

在另一优选例中，本发明的上述核苷酸元件是按阅读框(in-frame)连接的，从而表达氨基酸序列正确的融合蛋白。

在另一优选例中，所述polya序列选自下组：bgh的polya、sv40的polya、或其组合。

本发明第三方面提供了一种载体组合，包括第一载体和任选的第二载体，所述第一载体含有本发明第一方面所述的核酸构建物，所述第二载体含有表达sgrna的表达盒，所述表达sgrna的表达盒中的sgrna为ngan型sgrna或nnnrrt型sgrna，并且所述sgrna的第7、8和/或9位对应于预定发生高效a→g定点突变的位置(即为a)。

在另一优选例中，所述第一载体和/或第二载体还整合有筛选标记。

在另一优选例中，所述第一载体和第二载体可以相同，可以不同。

在另一优选例中，所述第一载体和第二载体可以为同一载体。

在另一优选例中，所述筛选标记选自下组：绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述第一载体和第二载体各自独立地选自下组：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述sgrna的第8和/或9位对应于预定发生a→g定点突变的位置(即为a)。

本发明第四方面提供了一种基因工程细胞，所述细胞被本发明第三方面所述的载体组合所转化或转染。

在另一优选例中，所述基因工程细胞为原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述原核细胞包括：大肠杆菌。

在另一优选例中，所述真核细胞选自下组：酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞(如hek293t细胞)、人细胞、或其组合。

本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：

(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的第一载体，所述第一载体含有本发明第二方面所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括(a2)第二容器，以及位于所述第二容器中的第二载体，所述第二载体含有表达sgrna的表达盒，所述表达sgrna的表达盒中的sgrna为ngan型sgrna或nnnrrt型sgrna，并且所述sgrna的第7、8和/或9位对应于预定发生高效a→g定点突变的位置(即为a)。

在另一优选例中，所述sgrna的第8和/或9位对应于预定发生a→g定点突变的位置(即为a)。

在另一优选例中，所述第一载体和/或第二载体还含有表达筛选标记的表达盒。

在另一优选例中，所述第一容器和第二容器可以是相同的容器，可以是不同的容器。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有说明书，所述说明书中记载了如下说明：将第一载体和第二载体感染细胞，从而在所述细胞内进行基因定点替换的方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了abekkh示意图，其中，cmv:启动子；u6：人源u6启动子；tada:腺苷脱氨酶；tada﹡为突变的腺苷脱氨酶；sacas9n(kkh):除了d10a突变外，还带3个共它氨基酸突变(e782k/n968k/r1015h)的sacas9；bgh:polya序列.星号：为突变位点。

图2显示了u6-sasgrna-ef1α-gfp示意图，其中，u6：人源u6启动子；sa:代表可插入的sacas9的靶点及sacffold序列；ef1α：启动子：egfp:增强绿色荧光蛋白；pa:polya序列。

图3显示了abekkh突变窗口及a到g的编辑活性。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，意外的发现一种新的将a突变为g的基因编辑系统。

具体地，本发明将spcas9替换为带有四个氨基酸突变d10a/e782k/n968k/r1015h的sacas9，使其可以靶向识别pam为nnnrrt(n＝a,t,c或g；r＝a或g)的靶点，并在其远离pam数起4-10均能实现单个碱基a/t到g/c基因组定点编辑，其中以7-9位定点编辑效率最高约为35％-50％，进一步促进其在真核生物中实现单个碱基a﹒t到g﹒c基因组定点编辑的靶向空间及应用范围。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“nnnrrt型sgrna”指sgrna相应靶序列的pam区是nnnrrt，其中，n为a，t，c或g，r＝a或g。在本发明中，优选的pam区为n1n2n3rrt，其中，n1，n2各自独立地为a,t,c或g；n3＝a,t、c或g(更佳地a,t或c)，r＝a或g。

术语“ngan型sgrna”指sgrna相应靶序列的pam区是ngan，其中n为a,t,c或g。

如本文所用，术语“碱基突变”指核苷酸序列的某一位置处发生碱基的替换(substitution)、插入(insertion)和/或缺失(deletion)。

如本文所用，术语“碱基替换”指核苷酸序列的某一位置处的碱基突变为另一不同的碱基，比如a突变为g。

如本文所用，术语“a.t到g.c”指在双链核酸序列(尤其是基因组序列)中，某一位置上的a-t碱基对突变为或替换为g-c碱基对。

如本文所用，“筛选标记基因”指转基因过程中用来筛选转基因细胞或转基因动物的基因，可用于本申请的筛选标记基因没有特别限制，包括转基因领域常用的各种筛选标记基因，代表性例子包括(但并不限于)：荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、或其组合。

如本文所用，术语“cas蛋白”指一种核酸酶。一种优选的cas蛋白是cas9蛋白。典型的cas9蛋白包括(但并不限于)：来源于葡萄球菌(staphylococcusaureus)的cas9。在本发明中，cas9蛋白为突变的cas9蛋白，具体地，是无切割活性或只具有单链切割活性的突变的cas9蛋白。

如本文所用，术语“cas蛋白的编码序列”指编码cas蛋白的核苷酸序列。在插入的多聚核苷酸序列被转录和翻译从而产生功能性cas蛋白的情况下，技术人员会认识到，因为密码子的简并性，有大量多聚核苷酸序列可以编码相同的多肽。另外，技术人员也会认识到不同物种对于密码子具有一定的偏好性，可能会根据在不同物种中表达的需要，会对cas蛋白的密码子进行优化，这些变异体都被术语“cas蛋白的编码序列”所具体涵盖。此外，术语特定地包括了全长的、与cas基因序列基本相同的序列，以及编码出保留cas蛋白功能的蛋白质的序列。

细胞内进行基因定点替换的方法

本发明提供了一种在细胞内进行基因定点替换的方法，包括步骤：

(i)提供一细胞以及第一载体和第二载体，其中所述第一载体含有第一核酸构建物，所述第二载体含有表达sgrna的表达盒，其中，所述第一核苷酸具有5’-3’(5’至3’)的式i结构：

p1-x1-l1-x2-x3(i)；

其中，p1为第一启动子序列；

x1为腺嘌呤脱氨酶的编码序列；

l1为无或连接序列；

x2为突变型cas9核酸酶的编码序列，所述的cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；

x3为polya序列；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

所述表达sgrna的表达盒中的sgrna为ngan型sgrna或nnnrrt型sgrna，并且所述sgrna的第7、8和/或9位(尤其是第8位和/或第9位)对应于预定发生高效a→g定点突变的位置(即为a)；

(ii)用所述的第一载体和第二载体感染所述的细胞，从而在所述细胞内进行基因定点替换。

腺嘌呤脱氨酶

如本文所用，术语“腺嘌呤脱氨酶”指tada腺嘌呤脱氨酶，来源于大肠杆菌，原本作用于trna，能够对trna中的特定腺嘌呤进行脱氨反应。

在本发明中，适用的tada既包含野生型的形式也包含其特定的突变形式tada*。tada*能够以dna作为底物进行脱氨反应。

在本发明中，所述腺嘌呤脱氨酶为串联型腺嘌呤脱氨酶，所述串联型腺嘌呤脱氨酶结构如式ii所示：

z1-l2-z2(ii)

其中，

z1为野生型的腺嘌呤脱氨酶tada的氨基酸序列；

l2为任选的连接肽序列；

z2为突变型的腺嘌呤脱氨酶tada*的氨基酸序列。

本发明的构建物

本发明提供了一种核酸构建物，具体地，在本发明的核酸构建物中，通过将spcas9替换为带有四个氨基酸突变d10a/e782k/n968k/r1015h的sacas9，使其可以靶向识别pam为nnnrrt(n＝a,t,c或g；r＝a或g)的靶点，并在其远离pam数起4-10均能实现单个碱基a/t到g/c基因组定点替换，其中以7、8和/或9位定点替换效率最高约为35％-50％，并且以第8和/或9位的定点替换效率最高。

本发明的构建物中所用的各种元件都是本领域中已知的，因此本领域技术人员可以用常规方法，如pcr方法、全人工化学合成法、酶切方法获得相应的元件，然后通过熟知的dna连接技术连接在一起，就形成了本发明的构建物。

将本发明的构建物插入外源载体，就构成了本发明的载体。

载体构建

该载体的主要特征是将腺嘌呤脱氨基酶与crispr/cas系统中的cas蛋白的编码序列连接在一起，从而形成融合蛋白的编码序列。当该编码序列所编码的融合蛋白在细胞质中表达后，所述的融合蛋白可以非常高效地被转移至细胞核内，并由grna引导至基因组中的靶点位置，从而在靶点位置(在cas9远离pam起4-10)进行a.t到g.c的碱基替换，并基本上避免或消除了发生插入/缺失的风险，并且不引入dsb、indel及脱靶效应极低。

由于腺嘌呤脱氨基酶直接将a突变为g，并不需要cas蛋白的dna双链切割活性。因此，在本发明中cas蛋白是无切割活性或只具有单链切割活性的突变的cas蛋白。一般地，为了增加融合蛋白的活性，蛋白间一般通过一些柔性短肽连接，即linker(连接肽序列)。优选的，该linker可以选用xten。

在本发明中，合适的启动子包括组成型和/或诱导型启动子。优选地，为了增加效率，可以选择适合的启动子，代表性的例子包括(但并不限于)：vcag、pgk、ef1α。

靶点设计

在本发明中，当腺嘌呤脱氨基酶通过crispr/cas9系统引导至靶点位置后，脱氨基酶的作用区域就被固定的。

例如，将腺嘌呤脱氨基酶tada或突变型的腺嘌呤脱氨基酶tada*蛋白通过32个氨基酸的xtenlinker连接至spcas9的n端后，通常，在人细胞系里面其脱氨基的作用区域为原间隔序列(protospacer)区的第4-7个碱基区域，本发明得到的实验结果表明，如果用sacas9，碱基编辑窗口为原间隔序列(protospacer)区第4-10(优选7-9，更优选8-9)位。根据这一原则，在设计靶点时，需将待编辑的腺嘌呤处于“脱氨基窗口区”。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，将spcas9替换为带有四个氨基酸突变d10a/e782k/n968k/r1015h的sacas9，使其可以靶向识别pam为nnnrrt(r＝a或g)，优选pam为n1n2n3rrt，其中，n1，n2，n3各自独立地为a,t,c或g的靶点，并在其远离pam数起4-10均能实现单个碱基a/t到g/c基因组定点替换，其中以7-9位定点替换效率最高约为35％-50％，其中，以8-9位的定点替换效率最高，进一步促进其在真核生物中实现单个碱基a﹒t到g﹒c基因组定点替换的靶向空间及应用范围。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料和试剂如无特殊说明均可从市售渠道获得。

通用方法

1.根据人的emx1基因分别设计emx1,runx1靶点序列emx1-kkh-sgrna1,emx1-abe-sgrna1

runx1-abe-sgrna2.(表1)，并根据其靶点设计其sgrnaoligo(表2)。同时设计表达具有sacas9sacffoldsgrna载体u6-sasgrna-ef1α-gfp(图2)。

2.依次构建上述质粒。

3.abekkh对人的内源基因emx1，runx1的a﹒t到g﹒c定点编辑窗口及效率的检测。

即如下组合，进行转染293t,

abekkh:u6-sgrna1-ef1α-gfp＝250ng:250ng,转染后120h后，通过流式分选转染组细胞，提细胞dna,pcr后，连peasy-blunt挑单克隆25个进行测序，检测a﹒t到g﹒c定点编辑窗口及效率。

表1靶点序列

表2靶点序列设计

实施例1abekkh对人内源基因突变窗口及效率检测

1.abekkh,u6-sasgrna-ef1α-gfp质粒载体的设计与构建

1.1设计原理及原则：

1.1.1abekkh,是基于sacas9工作原理，将sacas9通过linker与腺苷脱氨酶通过一定顺序进行组装得到如图1工作系统，即abekkh.u6-sasgrna-ef1α-gfp是将能表达sacas9sgrna质粒克隆了gfp，即成为表达sgrna也同时gfp,便于后续鉴定流式分析与分选。

1.2.根据crispr/cas9的工作原理设计人的emx1,runx1基因分别设计abekkh靶点序列(表1)。

靶序列sgrnaoligo设计原则：crispr/cas9中sacas9识别pam(nnnrrt)同时需要20个碱基互补配对sgrna为导向靶向结合，sgrna以u6为启动子，需要g作为转录起始位点，同时u6-sasgrna-ef1α-gfp均是以bbsi酶切位点连入靶点，因此,sgrnaoligo-up5.端需要补充cacc,sgrnaoligo-up5.端需要补充aaac,具体设计序列如(表2)

1.3构建1.2中的质粒

合成sgrnaoligo。

1.3.1将oligo用纯水溶解，终浓度为100μm。

1.3.2退火。两条互补oligo各取10μl混合，并放入沸水浴煮5min后自然降温

至室温，约2小时。

1.3.3连接。将u6-sasgrna-ef1α-gfp(bbsi)用bbsi酶切后的载体与分别与annealedoligo按以下反应体系进行连接反应。

以碧云天的快速dna连接试剂盒(d7006)为例。

室温连接60min后，取5μl转化至50μl感受态细菌中，涂卡那霉素抗性板,37℃培养过夜。

1.3.4从过夜培养的培养板中，挑取2个克隆，接种于4-5ml培养液，摇床37℃，220r/min培养过夜。

1.3.5摇菌培养过夜后，提取质粒，并用hu6测序验证，测序正确质粒。

2.1.质粒转染

第1天用293t细胞铺种24孔板

2.1.1消化hek293t细胞，按照2.0×10⁵cell/孔接种24孔板。

注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验。

第2天转染

2.1.2观察各孔细胞状态。

注：要求转染前细胞密度应为80％-95％，且状态正常。

2.1.3为保证数据的准确性和实验的可重复性，用无菌水稀释质粒，将各组质

粒浓度稀释至一致，或保证各组之间的质粒样品体积相同。组别设置如下：

blank:空白对照，仅包括培养的细胞和培养基；

处理组分别为：

abekkh:emx1-kkh-sgrna1-u6-sasgrna-ef1α-gfp＝250ng:250ng；

abekkh:emx1-abekkh-sgrna1-u6-sasgrna-ef1α-gfp＝250ng:250ng；

abekkh:runx1-abekkh-sgrna2-u6-sasgrna-ef1α-gfp＝250ng:250ng,

设置n＝3孔/组。

2.1.4向1.5mlep管中加入dmem(无血清，无抗生素)。

2.1.5将dna质粒加入到第(4)步的ep管中，混匀。

2.1.6将pei加入到上一步的ep管中，混匀，室温静置20分钟。

2.1.7将转染混合液加到24孔板中。轻轻敲击24孔板以混匀。

2.1.837℃，5％co2，培养72h后，通过流式分选gfp阳性细胞。

第4天

2.1.9将上步各24孔中的细胞进行消化后重悬并铺到相应的12孔板里，一孔对应一孔。

第7天

2.1.10120h后，流式分选gfp阳性细胞

2.1.11用天根细胞基因组提取试剂盒(dp304)提取分选的gfp阳性细胞基因组dna

2.1.12对提取的细胞基因组pcr包括有目的靶点约400bp,pcr产物回收后，连接peasy-blunt载体，转化，涂板，挑克隆25个，送测序，abekkh突变窗口及a到g的编辑活性(图3)。

结果

结果如图3所示。结果表明，本发明的新的基因组定点编辑系统aebkkh，可实现在4-10位单个碱基a/t到g/c定点转换，共中以7-9位效率较高，约为35％-50％，并且8-9位效率更高，更具优势。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>华东师范大学

上海邦耀生物科技有限公司

<120>一种新的a/t到g/c碱基定点转换的基因编辑系统

<130>p2018-0167

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cggatgcacggtcagcgcggggtggt26

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

caaccacaaacccacgagggcagagt26

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aaagagagatgtagggctagaggggt26

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caccgggatgcacggtcagcgcgg24

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aaacccgcgctgaccgtgcatccc24

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

caccgcaaccacaaacccacgaggg25

<210>7

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

aaacccctcgtgggtttgtggttgc25

<210>8

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

caccgaaagagagatgtagggctag25

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

aaacctagccctacatctctctttc25