一种高效表达制备蔗糖磷酸化酶的方法与流程

本发明涉及一种能高效表达蔗糖磷酸化酶的重组工程菌以及用改进高效表达制备蔗糖磷酸化酶的方法，属于基因工程
技术领域：
。
背景技术：
：蔗糖磷酸化酶(ec2.4.1.7，sucrosephosphorylase，spase)属于糖基水解酶第13家族，是催化转移葡萄糖苷键的特异性酶，能够可逆地催化蔗糖发生磷酸解作用，生成1-磷酸葡萄糖和d-果糖。该酶具有广泛的底物特异性，在食品、化妆品等工业生产中具有重要的应用价值。然而现有技术中，蔗糖磷酸化酶在野生菌中提取时的产率很低，分离精制困难，不适合大批量的制备。有通过大肠杆菌表达蔗糖磷酸化酶的，但在大肠杆菌中是胞内表达，易形成包涵体，同时，酶蛋白的获取需要对细胞进行破碎处理，杂蛋白含量高，分离精制困难，操作繁琐耗时，蛋白表达量也不高。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明的目的之一是采用基因工程技术构建一种高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体及重组工程菌。本发明的目的之二是提供一种产量高，蛋白较纯净，回收纯化容易，无内毒素、生产操作简单的利用重组工程菌生产蔗糖磷酸化酶的方法。本发明采用的技术方案是：一种高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的重组表达载体是将蔗糖磷酸化酶(sp)基因与表达载体连接，构建的重组表达载体；所述的表达载体是枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌用穿梭载体。进一步的，上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的表达载体是pht系列载体、穿梭载体pma5或穿梭载体pwb980等。但不限于这些载体，所有枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌用穿梭载体均可使用。更进一步的，上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的pht系列载体是pht43、pht304或pht01载体。进一步的，上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的表达载体中含有或不含有蛋白纯化标签。更进一步的，上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体，所述的蛋白纯化标签是组氨酸(his-tag)标签。一种高效表达蔗糖磷酸化酶的重组工程菌，是将上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体转化至宿主菌中构建的重组工程菌；所述的宿主菌是枯草芽孢杆菌。进一步的，上述的一种高效表达蔗糖磷酸化酶的重组工程菌，所述的转化为电转化。一种高效表达制备蔗糖磷酸化酶的方法。方法如下：将上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组工程菌以1-10％的接种量接种于液体培养基中，于60-200rpm培养至od600＝0.3-1.0时，加入iptg至终浓度为0.1-1.5mm，然后在20℃-40℃、80-220rpm条件下诱导培养9-36小时，菌液离心，取上清液，回收蛋白。进一步的，所述的液体培养基是含有抗生素的lb液体培养基。本发明的有益效果是：1、本发明，采用的表达菌株是枯草芽孢杆菌，该菌株被认证为gras(generallyrecognizedassafe)，在食品工业中可安全应用。它具有很高的应用价值，其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性及良好的发酵基础和生产技术。本发明中，sp在该表达系统中是细胞外分泌蛋白，且蛋白较纯净，回收纯化容易，生产操作简单且省时。2、本发明，采用基因工程技术，将蔗糖磷酸化酶(sp)基因与表达载体连接，构建重组表达质粒。然后，将其转化至枯草芽孢杆菌的宿主菌中，构建了一种高效表达sp的重组工程菌。该工程菌在液体培养基中培养后，将菌液离心，上清液即为含sp的酶液。其产量和生产效率明显高于同种基因在野生菌种中的表达水平，且操作简易，成本低。3、本发明的方法蔗糖磷酸化酶产量高，蛋白较纯净，回收纯化容易，生产操作简单，为sp的工业化大规模生产提供了便利，提高了产量，省时省力，节约成本。尤其是对该酶在食品工业中的应用提供了安全保障，具有重大意义。附图说明图1是实施例1重组表达载体pht43-sp的构建示意图。图2是实施例1双酶切验证图。图3是构建的重组表达载体pht43-sp的sds-page电泳图；m:marker；1、2、3:粗酶液。图4是构建的重组表达载体pht43-sp纯化后的sds-page电泳图；m:marker；1、:酶液。具体实施方式酶活的测定方法：将稀释的酶液和蔗糖溶液充分混匀，置于水浴中反应30min，煮沸10min。待混合液冷却至室温后，加入反应液(2.5u/mlpgm、2u/mlg6pdh、20μmol/lglc1,6-bp、2mmol/lnadp+、10mmol/lmgcl2、50mmol/lmops缓冲液(ph7.0))，置于30℃水浴中反应30min，340nm处测定吸光度。用标准曲线法计算酶的活性。单位时间产生1umolglc1p的量定义为一个酶活单位(u)。实施例1(一)重组表达载体pht43-sp的构建蔗糖磷酸化酶(sp)基因(序列如seqidno:1所示)来源于bifidobacteriumlongumjcm1217，经pcr扩增、纯化后与克隆载体pmd19连接，构建重组质粒pmd19-sp。将重组质粒pmd19-sp和表达载体pht43，分别以xbai和bamhi为酶切位点进行双酶切，并于16℃连接过夜，获得重组表达载体pht43-sp。将重组表达载体pht43-sp转化枯草芽孢杆菌wb800n，涂布含有氯霉素(5ug/ml)抗性的lb平板，37℃培养，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证。如图2所示，酶切后有两条片段，大小分别为8000bp左右(表达载体pht43)和1819bp(蔗糖酸化酶)，表示连接成功。(二)重组工程菌将构建的重组表达载体pht43-sp采用电击转化的方法，取枯草芽孢杆菌wb800n感受态细胞与重组表达载体pht43-sp质粒混合，加入电击杯中冰浴(1-10min)后进行电击，电击条件：22kv/cm，获得含有重组表达载体pht43-sp的重组工程菌。取含有重组表达载体pht43-sp的重组工程菌，加入1ml电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于氯霉素固体基础培养基lb平板上，12-24h可见阳性菌落。(三)sp的制备与条件优化方法：将含有重组表达载体pht43-sp的重组工程菌以1％的接种量接种于含有氯霉素的lb液体培养基中，于180rpm培养至初始菌密度od600＝0.8时，加入iptg至终浓度为0.1-1.5mm，在20℃-40℃、120rpm件下诱导培养9-36小时，菌液离心，上清液即为含sp的酶液。如表1和表2进行正交优化试验。表1水平a(诱导时间h)b(诱导温度℃)c(iptg浓度mm)19300.5218351327401.5表2根据表1、表2的结果，因素主次顺序为a、b、c，最佳工艺方案是a2b2c2。进一步对a2b2c2进行验证的结果表明，sp的活性达到132u/ml。由此可见，最佳的工艺条件为加入iptg至终浓度为1mm，诱导温度为35℃、诱导培养时间为18小时。(四)对比例方法同(一)-(三)，不同点在于，将步骤(二)中的宿主菌枯草芽孢杆菌wb800n变更为大肠杆菌，步骤(三)，在最佳工艺条件：iptg至终浓度为1mm，诱导温度为35℃、诱导培养18小时下发酵产酶。结果如表3。表3总蛋白大肠枯草sp27mg56mg由表3可见，采用大肠杆菌为宿主菌，sp的产量只有27mg，而采用枯草芽孢杆菌，sp的产量高达56mg。可见采用本发明的方法可以高表达蔗糖磷酸化酶。实施例2(一)重组表达载体pht43-sp的构建将实施例1制备的重组质粒pmd19-sp和表达载体pht43，分别以xbai和bamhi为酶切位点进行双酶切，并于16℃连接过夜，获得重组表达载体pht43-sp。将重组表达载体pht43-sp转化枯草芽孢杆菌wb800，涂布含有氯霉素(5ug/ml)抗性的lb平板，37℃培养，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证。如图2所示，酶切后有两条片段，大小分别为8000bp左右(表达载体pht43)和1819bp(蔗糖酸化酶)，表示连接成功。(二)重组工程菌将构建的重组表达载体pht43-sp采用电击转化的方法，取60ul枯草芽孢杆菌wb800电转化感受态细胞与1ul(50ng/ul)重组表达载体pht43-sp质粒混合，加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22kv/cm，获得含有重组表达载体pht43-sp的重组工程菌。取含有重组表达载体pht43-sp的重组工程菌，加入1ml电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于氯霉素固体基础培养基lb平板上，12-24h可见阳性菌落。(三)sp的制备方法：将含有重组表达载体pht43-sp的重组工程菌以5％的接种量接种于含有氯霉素的lb液体培养基中，于180rpm培养至初始菌密度od600＝0.8时，加入iptg至终浓度为1mm，在35℃、120rpm条件下诱导培养18小时，菌液离心，上清液即为含sp的酶液，酶活性为131u/ml。取酶液进行pcr验证。酶液的sds-page电泳图如图3所示，经纯化后结果如图4所示，均出现56kda的sp目的条带。实施例3(一)重组表达载体pma5-sp的构建将实施例1制备的重组质粒pmd19-sp和穿梭载体pma5，分别以xbai和bamhi为酶切位点进行双酶切，并于16℃连接过夜，获得重组表达载体pma5-sp。将重组表达载体pma5-sp转化枯草芽孢杆菌168，涂布含有氨苄青霉素(100ug/ml)抗性的lb平板，37℃培养过夜，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，经验证构建成功。(二)重组工程菌将构建的重组表达载体pma5-sp采用电击转化的方法，枯草芽孢杆菌168电转化感受态细胞与重组表达载体pma5-sp质粒混合，加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22kv/cm，获得含有重组表达载体pma5-sp的重组工程菌。取含有重组表达载体pma5-sp的重组工程菌，加入1ml电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于氨苄青霉素固体基础培养基lb平板上，12-24h可见阳性菌落。(三)sp的制备方法：将含有重组表达载体pma5-sp的重组工程菌以3％的接种量接种于含有氨苄青霉素的lb液体培养基中，于180rpm培养至初始菌密度od600＝0.8时，在35℃、120rpm条件下诱导培养18小时，菌液离心，上清液即为含sp的酶液，酶活性为122u/ml。实施例4(一)重组表达载体pht43-sp的构建蔗糖磷酸化酶(sp)基因(序列如seqidno:1所示)来源于bifidobacteriumlongumncc2705，经pcr扩增、纯化后与克隆载体pmd19连接，构建重组质粒pmd19-sp。将重组质粒pmd19-sp和表达载体pht43，分别以xbai和bamhi为酶切位点进行双酶切，并于16℃连接过夜，获得重组表达载体pht43-sp。将重组表达载体pht43-sp转化枯草芽孢杆菌wb600，涂布含有氯霉素(5ug/ml)抗性的lb平板，37℃培养过夜，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，经验证连接成功。(二)重组工程菌将构建的重组表达载体pht43-sp采用电击转化的方法，取60ul枯草芽孢杆菌wb600电转化感受态细胞与1ul(50ng/ul)重组表达载体pht43-sp质粒混合，加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22kv/cm，获得含有重组表达载体pht43-sp的重组工程菌。取含有重组表达载体pht43-sp的重组工程菌，加入1ml电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于氯霉素固体基础培养基lb平板上，12-24h可见阳性菌落。(三)sp的制备方法：将含有重组表达载体pht43-sp的重组工程菌以10％的接种量接种于含有氯霉素的lb液体培养基中，于180rpm培养至初始菌密度od600＝0.8时，加入iptg至终浓度为1mm，在35℃、120rpm条件下诱导培养18小时，菌液离心，上清液即为含sp的酶液，酶活性为129u/ml。实施例5(一)重组表达载体pwb980-sp的构建将实施例1制备的重组质粒pmd19-sp和穿梭载体pwb980，分别以xbai和bamhi为酶切位点进行双酶切，并于16℃连接过夜，获得重组表达载体pwb980-sp。将重组表达载体pwb980-sp转化枯草芽孢杆菌wb600，涂布含有卡那霉素(50ug/ml)抗性的lb平板，37℃培养过夜，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，经验证连接成功。(二)重组工程菌将构建的重组表达载体pwb980-sp采用电击转化的方法，枯草芽孢杆菌wb600电转化感受态细胞与重组表达载体pwb980-sp质粒混合，加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22kv/cm,获得含有重组表达载体pwb980-sp的重组工程菌。取含有重组表达载体pwb980-sp的重组工程菌，加入1ml电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于卡那霉素固体基础培养基lb平板上，12-24h可见阳性菌落。(三)sp的制备方法：将含有重组表达载体pwb980-sp的重组工程菌以3％的接种量接种于含有卡那霉素的lb液体培养基中，于180rpm培养至初始菌密度od600＝0.8时，在35℃、120rpm条件下诱导培养18小时，菌液离心，上清液即为含sp的酶液，酶活性为120u/ml。<110>沈阳农业大学<120>一种高效表达制备蔗糖磷酸化酶的方法<160>1<170>patentinversion2.1<210>1<211>1819<212>dna<213>蔗糖磷酸化酶基因（ec2.4.1.7，sucrosephosphorylase，spase）ab303838<400>11ggttcgatacatacgtgagtatgcaaatacgtaaacaacaaacaggcagatgcgcacgca61aattgcacccgcgcccatgagccaagggaggtcccatgaaaaacaaagtgcaactcatca121catacgccgatcgtctcggcgatggcactcttagctcgatgaccgacatcctgcgcaccc181gcttcgacggcgtgtatgacggcgtgcatatcctgccgttcttcactccgttcgatggtg241cggatgcaggcttcgacccgatcgaccataccaaagtcgacgaacgtctcggcagctggg301acgacgtcgccgaactctccaagacccacaacatcatggtcgacgccatcgtcaaccaca361tgagttgggaatccaagcagttccaagacgtgcttgaaaaaggtgaggaatccgagtatt421acccgatgttcctgaccatgagctccgtcttcccgaacggcgccaccgaagaagacctgg481ccggcatctaccgcccgcgcccgggcctgccgttcacccactacaagttcgccagcaaga541cgcgcttggtctgggtgagcttcaccccgcagcaggtggacatcgacactgattccgcca601agggttgggaatacctgatgtcgatcttcgatcagatggccgccagccacgtgcgctaca661tccgtctcgacgccgtgggctacggcgccaaggaagccggcaccagctgcttcatgaccc721ccaagacctttaagctcatctcccgtctgcgcgaggagggcgtcaagcgcggccttgaaa781tcctcatcgaggttcacagctactacaagaagcaggtggaaatcgcctccaaggtggacc841gcgtctacgatttcgccctgccgccgctgcttctgcactcgctgttcaccggtcacgtcg901aacccgtggcccactggaccgagatccgcccgaacaacgccgtcaccgtgctcgatacgc961acgatggcatcggcgtgatcgacatcggctccgaccagctcgaccgctccctcaagggcc1021tcgtgcccgacgaggacgtcgacaacctggtcaacaccatccatgccaacacccacggcg1081aatcccaggccgccaccggtgccgccgcgtccaacctcgacctctaccaggtcgactcca1141cgtactactcggccctcggctgcaacgaccagcactacttggccgcccgcgccgtgcagt1201tcttcctgccgggcgtgccgcaggtctactacgtgggcgcgctcgccggccgcaacgaca1261tggaactgctgcgccgcaccaacaacggccgcgacatcaaccgccactactactccaccg1321ccgaaatcgatgaaaacctcgaacgcccggtggtcaaggccctgaacgccctggccaagt1381tccgcaacgaactgcctgcattcgatggcgagttcagctacgaggtcgatggcgacacgt1441ccatcaccttccgctggaccgccgccgacggcacgtccacggccgccctcaccttcgagc1501ccggacgcggcctcggcacagacaacgccaccccggttgccagccttgcctggagcgatg1561ccgccggcgaccacgaaacccgcgatctgctcgccaacccgccgattgccgatatcgact1621aaccgttggcccataaacgccactccgctgtgcgcgctccaagtagtgcgcccggcgtaa1681gctgggttcatggagagcaaaccgcccgcagtgcactgaagccagtgcgcccgggcggtt1741ttgcgtatgcggggttgaaggtcatgctcctgcgggcgcggcccaagcatcccgccggaa1801tcgacgagacgagcagcag当前第1页12