本发明涉及马铃薯检测领域，具体为马铃薯植株叶斑类病害链格孢属(链格孢(Alternaria alternata))病原菌的分子检测引物及其检测方法。
背景技术：
当前中国马铃薯的总面积和总产量跃居世界首位，但单产却处于较低水平，各种病害频发是造成马铃薯减产的主要原因之一。马铃薯病害中，以真菌病害种类最多，且具有传播性，防控难，有的真菌还可发生变异，对马铃薯生产造成严重威胁。Alternaria是造成马铃薯植株和叶片病斑的一类重要真菌病原。据Zheng等(2015)报道，侵染中国马铃薯植株的Alternaria属病原主要有三种：茄链格孢(Alternaria solani)、链格孢(Alternaria alternata)和细极链格孢(Alternaria tenuissima)，这三种病原分别造成了马铃薯早疫病、黑点病和黑斑病，均可导致植株叶片坏死、植株枯萎等症状，严重时也可侵染块茎，从而造成减产。黑龙江省作为全国重要的马铃薯生产基地，Alternaria属病原在马铃薯植株上的种类分布情况还鲜为报道，调查近年来黑龙江省马铃薯Alternaria属病原的种类，对于有针对性地防治Alternaria属病原造成的各类病害具有重要意义。
许多链格孢属的不同小种都已经被分类，并表现出在种内或种间的生理、形态、基因和毒力变化。这可能是由于真菌菌丝体相互连接的桥梁作用可以促进营养、水分和信号分子的相互传输。许多像毒力分析、营养体亲和性和分子生化分析的实验方法都用来检验链格孢属种间和种内的变化，详细调查生长季节内链格孢属种间、种内变化可以让我们更好地了解不同年份间流行病学和管理病原。马铃薯早疫病、黑点病和黑斑病这三种病害在植株上的症状极其相似，在叶片上都可形成病斑，斑点形状和颜色也非常类似，在田间这三种病原通常情况下为混合侵染，因此通过目测其症状很难判定这三种病害，此外，由于许多链格孢属小种在显微镜下形态差异较小，所以传统生物学方法很难在种间区分链格孢属各小种。
技术实现要素：
本发明为了解决目前传统生物学方法针对马铃薯，很难在种间区分链格孢属各种的问题，尤其是区分链格孢(Alternaria alternata)的问题。而提供了马铃薯植株叶斑类病害链格孢病原菌的分子检测引物及其检测方法。
本发明的引物序列如序列表Seq ID No：1所示和Seq ID No：2所示。
本发明的马铃薯植株叶斑类病害链格孢病原菌的分子检测方法，它是按照以下步骤进行的：
一、以提取待检测的马铃薯基因组DNA为模板，采用权利要求1的引物，进行PCR扩增；
二、取PCR产物进行凝胶电泳检测，若能够检测出145bp大小的片段，则可判断出所检测的马铃薯中存在链格孢病原菌。
本发明包含以下有以效果：
本发明利用设计的根据链格孢属核糖体内转录间隔区ITSⅠ基因序列和组蛋白3(Histone3)基因保守序列设计的Alternaria属(尤其是链格孢(Alternaria alternata))引物进行PCR扩增，建立了一套快速、准确的可鉴定Alternaria属病原的PCR鉴定技术，结合传统生物学鉴定方法，调查分析黑龙江省马铃薯叶斑类病害Alternaria属病原的组成和分布情况，以期为生产上有针对性地防治该类病害提供依据。
本发明的方法能够快速，准确的鉴定链格孢(Alternaria alternata)，检测灵敏度为10pg/μL。
附图说明
图1为利用引物AT-H3F/AT-H3R进行PCR检测感病马铃薯叶片的电泳图；其中，M:标准分子量DL600；1-10:马铃薯叶斑类病害DNA；11:阴性对照(无菌水)；12:链格孢(Alternaria alternata)阳性菌株DNA；
图2为引物AT-H3F/AT-H3R特异性验证电泳图；其中，M:标准分子量DL600；1-8:分别为A.solani菌株DNA，A.alternata菌株DNA，A.tenuissima菌株DNA，晚疫病菌株DNA，疮痂病菌株DNA，青枯病菌株DNA，黑胫病菌株DNA，黑痣病菌株DNA；9:A.alternata阳性菌株DNA；10:阴性对照(无菌水)；
图3为引物AT-H3F/AT-H3R灵敏度验证电泳图；其中，M:标准分子量DL600；1:阴性对照(无菌水)；2-7:分别为A.alternata纯菌株DNA分别稀释至100ng/μl，50ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的引物序列如序列表Seq ID No：1所示和Seq ID No：2所示。
具体实施方式二：本实施方式的马铃薯植株叶斑类病害链格孢病原菌的分子检测方法，它是按照以下步骤进行的：
一、以提取待检测的马铃薯基因组DNA为模板，采用权利要求1的引物，进行PCR扩增；
二、取PCR产物进行凝胶电泳检测，若能够检测出145bp大小的片段，则可判断出所检测的马铃薯中存在链格孢病原菌。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的链格孢病原菌为链格孢(Alternaria alternata)。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的PCR反应体系为20μL如下：
PCR扩增条件为：5℃预变性1min，94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃终延伸8min，共29个循环。
其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是：在PCR检测成功后，将PCR产物纯化后，进行测序，进行Blast比对和同源性分析。其它与具体实施方式二相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例
1、供试菌株
2015-2016年分别从黑龙江省农科院民主园区，哈尔滨、呼兰地区、佳木斯、鹤岗、克山等地采集马铃薯Alternaria属叶斑类病害叶片，按照常规组织分离法分离纯化病原菌备用。
2、纯菌株的分离
分离纯化后的早疫病在显微镜下观察，运用单胞分离技术结合鉴定方法，单胞分离技术分离被研究的链格孢(Alternaria alternata)病原菌，获得纯菌株。
3、马铃薯Alternaria属的链格孢(Alternaria alternata)病斑叶片总DNA的提取
采用天根生化科技(北京)有限公司的TIANGEN植物基因组提取试剂盒进行DNA的提取，根据试剂盒的如下操作步骤提取：
(1)取菌丝或病叶组织100mg，加入液氮充分研磨。加入400μL缓冲液LP1和6ul RNaseA(10mg/ml)，涡旋振荡1min，室温放置10min。
(2)加入130μL缓冲液LP2，充分混匀，涡旋振荡1min。
(3)12000rpm离心5min,将上清液移至新的离心管中。
(4)加入1.5倍体积的缓冲液LP3(例如500μL的上清加入750μL的缓冲液LP3)，立即充分振荡混匀15sec。
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管。
(6)向吸附柱中加入600μL漂白液PW，12000rpm离心30sec,倒掉废液，吸附柱放回收集管中。
(7)重复步骤6。
(8)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。吸附柱置于室温放置数分钟晾干。
(9)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空加入50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。
4、DNA质量与浓度的检测
(1)琼脂糖凝胶电泳检测：以DL2000作为DNA Ladder，取2μL的基因组DNA与5μL的Loading buffer混匀点入1.0％的琼脂糖凝胶胶孔中，在5V/cm的稳压直流电下电泳30min后，凝胶成像系统成像检测DNA的质量。
(2)紫外分光光度法：用紫外分光光度计检测DNA浓度。
5、引物
表1引物序列
6、PCR反应及产物纯化测序
利用上述引物，以ddH2O为阴性对照，阳性对照分别为中国农业大学植物病理系吴学宏教授实验室提供的阳性链格孢(Alternaria alternata)，对马铃薯植株Alternaria属病原菌的总DNA进行PCR反应，反应体系和反应程序如下：
表2 20μL PCR反应体系
引物AT-H3F/AT-H3R的PCR反应条件：95℃预变性1min，94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃终延伸8min，共29个循环。
PCR产物凝胶成像系统成像后观察是否有条带，PCR产物纯化后，送往上海生工有限公司进行测序，获得测序结果后，通过BLAST搜索核酸数据库(blastn)，进行比对和同源性分析。
结果表明：
采集含有以上链格孢(Alternaria alternata)侵染的样品，提取叶片总DNA，应用本发明引物AT-H3F/AT-H3R，以ddH2O为阴性对照，阳性对照为中国农业大学植物病理系吴学宏教授实验室提供的阳性链格孢A.alternata，进行PCR扩增。扩增出链格孢(A.alternata)145bp(图1)，判定为阳性样品。后对相应目的条带切胶、回收、纯化后测序，测序结果显示：A.alternata 145bp处目的条带序列与A.alternata Histone基因(Accession KP701301.1)进行BLAST序列比对，结果显示同源性均为100％，据此判断为相应的阳性样品。
7、引物的特异性的验证
提取马铃薯链格孢(Alternaria alternata)纯菌株DNA后，阳性对照为中国农业大学植物病理系吴学宏教授实验室提供的阳性链格孢A.alternata菌株，阴性对照为ddH2O，按照上述PCR反应体系及反应程序进行反应，1.5％的琼脂糖凝胶电泳成像且拍照后，比较引物的特异性。
8、引物灵敏度的验证
确定引物AT-H3F/AT-H3R对应的三个阳性样品，分别将阳性样品DNA浓度稀释至100ng/μl，50ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，100fg/μl，得到7组稀释样品。分别检测其核苷酸含量，确定浓度后进行上述引物的常规PCR，经过2.5％琼脂糖凝胶电泳并且拍照，找到引物对检测样品的最大稀释度。
通过特异性和灵敏度验证，结果表明：
以ddH2O为阴性对照，阳性对照为中国农业大学植物病理系吴学宏教授实验室提供的阳性链格孢(Alternaria alternata)菌株。应用引物AT-H3F/AT-H3R进行PCR反应扩增马铃薯植株叶片病斑组织总DNA。凝胶电泳成像结果表明：在145bp处仅阳性链格孢(Alternaria alternata)有条带(图2)。且引物的最小检测浓度均为10pg(图3)。
9、黑龙江省各地区马铃薯Alternaria属病原菌(主要为链格孢(Alternaria alternata))的分布与组成
2015-2016年，采集黑龙江省不同马铃薯主产区的Alternaria属叶斑类病害的叶片发病组织共150份，分别提取其总DNA，对应的叶片病斑部位分离纯化培养，得到相对应的菌株。运用上述PCR技术体系鉴定黑龙江省马铃薯Alternaria属病原菌的组成，估算各地区Alternaria属病原菌分布比例。扩增产物采用Universal DNA Purification Kit(TIANGEN生化科技有限公司)试剂盒进行纯化后，采用TA克隆方法将扩增片段与PUC-T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5α，经过含有X-Gal，Amp和IPTG的LB平板筛选后，挑选白色的单克隆菌落，提取质粒进行PCR验证，同时送去上海生工有限公司测序。测序结果通过BLAST搜索核酸数据库(blastn)，进行比对和同源性分析，序列结果运用DNAMAN软件进行多重序列比对分析，最后用MEGA5.05软件进行分析。
序列表
<110> 黑龙江省农科院植物脱毒苗木研究所
<120>马铃薯植株叶斑类病害链格孢属病原菌的分子检测引物及其检测方法
<160>2
<210> 1
<211>16
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> AT-H3F引物。
<400> 1
GCCCGCAGGTCCACTG 16
<210>2
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> AT-H3R引物。
<400> 2
ACCGGTAGACGGCGCACT 18