本发明涉及一种基于活性氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术：
近三十年以来，民众对膳食营养越来越重视，长链多不饱和脂肪酸逐渐进入人们的视线。omega-6长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸（ara）不仅仅在组成膜磷脂结构成份中起了重要作用，而且在脑部等神经组织中大量积累，可以作为合成信号分子类二十烷酸（包括前列腺素、凝血恶烷和白三烯等）的前体物质，被广泛应用于医药和化妆品。尤其是婴幼儿食品和营养品领域，由于花生四烯酸油脂在婴幼儿体中无法合成，而牛乳中不含花生四烯酸，因此额外添加摄取花生四烯酸油脂对婴幼儿脑部生长发育至关重要。
目前，利用微生物高山被孢霉发酵生产花生四烯酸油脂的工艺已经进入工业生产阶段。多种有效的营养限制发酵策略已被广泛研究。如广泛应用在产油微生物中的氮源限制策略可以改变胞内代谢流至油脂合成途径，快速大量积累脂肪酸组分。又如高山被孢霉所属的接合菌纲菌株会在碳源耗尽后出现花生四烯酸含量大幅上升的现象，已被利用提升油脂品位。然而，大量研究表明营养限制等胁迫条件会造成胞内活性氧聚集，引发氧化应激现象，破坏胞内氧化还原稳态。同时，活性氧会攻击氧化胞内活性成分，造成生物量及脂质的损耗。而90%的活性氧源于线粒体呼吸链的氧分子泄露。电子显微镜图片显示老化期的高山被孢霉形状变得极不规则，可能是活性氧大幅上升的主要原因。另一方面，活性氧对微生物作用有其双面性。有研究表明低浓度活性氧作为一种潜在的胞内信号转导分子，可以刺激丝状真菌细胞快速增殖。亦有研究证明适当浓度活性氧可以促进产油微生物实现细胞生物量与油脂快速同步积累。
因此，鉴于现有的发酵前期生长缓慢，中后期产物与生物量无法同时积累，大量活性氧聚集的弊端，本发明针对高山被孢霉胞内活性氧浓度，分阶段实施调控，提升花生四烯酸产量的同时缩短了发酵时长，增强了生产强度，并缩减了搅拌总能耗，提供了一种简单有效的高山被孢霉花生四烯酸油脂发酵新工艺，可为类似产油微生物所借鉴。
技术实现要素：
鉴于现有技术的上述问题，本发明的目的是提出一种基于活性氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其针对高山被孢霉胞内活性氧的浓度，重新平衡了生物量、油脂及花生四烯酸合成过程中的活性氧需求。发酵共168小时，结束时可使高山被孢霉细胞干重、油脂含量、花生四烯酸占总油脂的百分含量、花生四烯酸的单位产量分别可以达到59.8g/l、60.1%、65.7%、23.6g/l，花生四烯酸生产强度可以达到3.37g/(l*d)。本方法提升花生四烯酸产量的同时缩短了发酵时长，增强了生产强度，此外间歇性低氧策略亦可减少搅拌能耗。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于活性氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，将高山被孢霉菌株经过试管斜面培养基和摇瓶培养基逐级放大培养，制备种子液，然后接种于发酵罐中进行发酵培养，在发酵过程中，以控制高山被孢霉胞内活性氧浓度为目标，对发酵过程进行分阶段调控，将整个发酵过程分为相对高活性氧期和相对低活性氧期2个阶段；在相对高活性氧期，通过添加活性氧源（例如过氧化氢），将胞内活性氧浓度提升至100~125rflu（增幅约40~50%），刺激细胞加速生长；在相对低活性氧期通过间歇性低氧或添加抗氧化剂（例如抗坏血酸钠），降低胞内活性氧浓度至200rflu左右（降幅约30~40%），减少细胞产物损耗。
所述相对高活性氧期为高山被孢霉发酵的指数生长期，即0~60小时。
所述相对高活性氧期添加活性氧源，添加时间为迟缓期结束后，即8~12小时。
所述相对高活性氧期添加活性氧源，添加后培养基中活性氧源浓度为50~100μmol/l。
所述活性氧源可为过氧化氢、纳米二氧化钛粒子、纳米铁粒子等，以过氧化氢为例，添加浓度为50~100μmol/l。
所述相对低活性氧期为高山被孢霉发酵的61~168小时。
所述相对低活性氧期的间歇性低氧是通过控制通气和转速实现的，即以12~18小时为一个周期，每周期降低搅拌速率及通气，使环境溶氧降低50~80%，造成15~120min间歇性低氧环境。
所述相对低活性氧期的添加抗氧化剂，添加时间点分别为60小时和120小时。
所述相对低活性氧期的添加抗氧化剂包括抗坏血酸钠、芝麻酚、胡萝卜素等，以抗坏血酸钠为例，单次添加量为5~10g/l。
本发明中所采用的高山被孢霉菌株为高山被孢霉菌株r807（cctccm2012118），实践中亦可采用类似的产油微生物。
本发明调控原理如下：将发酵步骤分为两个阶段（相对高活性氧期和相对低活性氧期），并且针对不同的阶段采用不同的调控工艺。在相对高活性氧期，种子液刚刚接进发酵罐，菌体活力较低，有一段约8~12小时的生长停滞期，之后添加适量活性氧源（例如过氧化氢），刺激细胞快速增殖，有利于高山被孢霉生物量的积累并缩短发酵周期。当达到生长指数后期，生物量达到一定程度，胞内花生四烯酸油脂合成加快，需要应对活性氧聚集造成的产物损伤。一者可以通过适量添加抗氧化剂（如抗坏血酸钠）减少活性氧所造成的氧化损伤；另者，通过间歇性调低搅拌速率及通风，从源头减少由呼吸链产生的活性氧，降低胞内活性氧浓度。两者单独使用或耦合使用均可。
本发明的有益效果：
（1）针对发酵前期生长缓慢的问题，适当增加胞内活性氧浓度，刺激细胞快速增殖，有利于高山被孢霉生物量积累的同时缩短发酵周期。
（2）针对发酵中后期生物量、油脂及花生四烯酸积累速率不一，无法在发酵终点同时达到积累峰值，大量活性氧聚集损耗产物等问题，通过添加抗氧化剂或实施间歇性低氧调控，重新平衡了生物量、油脂及花生四烯酸合成过程中的活性氧需求，使得花生四烯酸的产量和生产强度分别达到23.6g/l和3.37g/(l*d)。相较于“一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法”（cn104278107a），发酵周期缩短22%，花生四烯酸产量提升14%，生产强度提升47.2%，生产效率大幅提升。
（3）本发明涉及的工艺操作简便，同时相较“一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法”（cn104278107a）减少约15%搅拌总能耗，更有利于工业化生产。目前已经在25m³发酵罐水平完成试运行，得到了很好的收益。
附图说明
图1：基于活性氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法流程。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，详细描述本发明。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下实施例中所采用的培养基如下：
试管斜面培养基（pda斜面培养基）：新鲜去皮马铃薯200g，煮沸后计时30min，4层纱布过滤除去固形物，加葡萄糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1l，ph自然，115℃灭菌30min。
种子培养基：葡萄糖30g/l，酵母膏6g/l，kh2po43g/l，ph自然，115℃灭菌30min。
发酵培养基：葡萄糖80g/l，酵母膏11g/l，kh2po43.8g/l，nano33.4g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，ph自然，115℃灭菌30min。
实施例中所用的菌株为：高山被孢霉菌株r807（cctccm2012118），也可以使用其他类似产油微生物菌株。
实施例1.基于活性氧调控7.5l罐高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂
1、菌种的活化以及种子液的制备：选取高山被孢霉菌株r807（cctccm2012118）为出发菌株，将保藏的菌种接入pda斜面培养基中，于25℃条件下在培养箱中培养10天，转接于装有100ml种子培养基的500ml凹槽瓶中于恒温振荡器中培养，接种量10%（v/v，10ml），培养条件是125rpm，温度25℃，培养时间1-2天。
2、将步骤1得到的种子液接种到7.5l罐（newbrunswickscientific,usa）中，装液量5l，接种量为10%（v/v，500ml），培养温度控制在25℃。发酵的0-60小时期间，为相对高活性氧期。发酵初始，种子液刚接进发酵罐，有一段生长停滞期12小时，之后添加50μmol/l过氧化氢，控制胞内活性氧在110rflu左右。发酵的60-168小时期间为低活性氧阶段，该阶段为花生四烯酸油脂积累阶段。以12小时为一个周期，每周期降低搅拌和通气45min，使溶氧下降50~70%，造成间歇性低氧。并分别在60小时和120小时添加抗坏血酸钠5g/l和8g/l。胞内活性氧控制在180~200rflu，通气控制在2vvm左右，转速控制在150rpm。
当发酵培养至168小时，发酵结束，取样检测。终点的高山被孢霉细胞干重、油脂含量、花生四烯酸含量、花生四烯酸的单位产量分别可以达到59.8g/l、60.1%、65.7%、23.6g/l，花生四烯酸生产强度可以达到3.37g/(l*d)。发酵期间总搅拌能耗下降约15%。
实施例2.基于活性氧调控25m³罐高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂
1、菌种的活化以及种子液的制备：选取高山被孢霉菌株r807（cctccm2012118）为出发菌株，将保藏的菌种接入pda斜面培养基中，于25℃条件下在培养箱中培养10天，转接于装有100ml种子培养基的500ml凹槽瓶中于恒温振荡器中培养，接种量10%（v/v，10ml），培养条件是125rpm，温度25℃，培养时间2天，制备成一级种子液。然后，按照接种量10%（v/v）将一级种子液接入于150l种子罐中，培养条件是175rpm，温度25℃，培养时间1天，制备成二级种子液。接着，将制备好的二级种子液全部接入到5000l种子罐中，培养条件是125rpm，温度25℃，培养时间18小时，制备成三级种子液。
2、将步骤1得到的三级种子液全部接入到25m³发酵罐中，培养温度25℃。发酵的0-60小时期间，为相对高活性氧期。发酵初始，种子液刚接进发酵罐，有一段生长停滞期10小时，之后添加80μmol/l过氧化氢，控制胞内活性氧在125rflu左右。发酵的60-168小时期间为低活性氧阶段，该阶段为花生四烯酸油脂积累阶段。其中在60~120小时期间，以12小时为一个周期，每周期降低搅拌和通气30min；在120~168小时期间，以18小时为一个周期，每周期降低搅拌和通气60min。并分别在60小时和120小时添加抗坏血酸钠5g/l。将胞内活性氧控制在210rflu左右，通气控制在2vvm左右，转速控制在175rpm。
当发酵培养至168小时，发酵结束，取样检测。终点的高山被孢霉细胞干重、油脂含量、花生四烯酸含量、花生四烯酸的单位产量分别可以达到56.3g/l、56.4%、59.1%，18.8g/l，花生四烯酸生产强度2.69g/(l*d)。发酵期间总搅拌能耗下降约17%。
以上实施例中胞内活性氧浓度采用dcfh-da方法测定：
取细胞培养液10ml，10000g，4℃离心10分钟，无菌水洗涤两次。暗室室温环境下，添加浓度10μmol/ldcfh-da的dmso溶液5μl。避光环境孵育30分钟，离心取上清，ph7.4pbs溶液洗涤2次。振荡重悬，使用酶标仪检测，激发波长488nm，发射波长525nm。所得荧光强度除以培养液中生物量，得到相对荧光强度，视为活性氧浓度。ph7.4pbs溶液为阴性对照。
综合以上实施例可以看出，本发明所述的一种基于活性氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，简单可操作性强，增加花生四烯酸油脂产量的同时缩减了发酵周期，大大提升了生产强度，并减少了发酵期间总搅拌能耗。