BTV-2型、3型、4型、7型、12型基因型分型鉴别的多重RT-PCR试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于分子生物学检测方法及检测试剂领域，pcr技术领域。具体而言，具体涉及蓝舌病病毒(btv)2型、3型、4型、7型、12型多重rt-pcr检测用试剂盒及方法。

背景技术：

蓝舌病(bluetongue，bt)是由呼肠孤病毒科环状病毒属成员蓝舌病病毒(bluetonguevirus，btv)引起的，以昆虫为传播媒介的反刍动物的一种非接触性传染病，分布广泛，除南极洲外的各个大洲都发生蓝舌病的报道。btv能感染大多数反刍动物，以绵羊最易感，且表现典型的临床症状，牛及山羊多为隐性感染,没有明显症状，但可长期带毒，野生动物及骆驼也可感染该病。由于病羊发病死亡，或即使不死，但其生产性能严重下降(如产肉产奶量下降，胎儿畸形、羊毛破坏、羔羊发育不良等)，造成巨大的经济损失，且严重影响国际贸易，oie将其列为法定通报疫病，我国将其列为一类动物传染病。btv血清型众多，已经被证实的有27个，分别以btv1-27命名，各血清型之间交叉保护性低，混合感染的情况也时常出现，故对病毒分型亦很有必要。目前适用的检测方法主要有病毒分离培养、琼脂糖免疫扩散试验、血清中和试验(vnt)、elisa、抗原捕获elisa、rt-pcr、qrt-pcr及基因芯片技术。除vnt外均不能对病毒分型，而vnt虽能分型，但耗时长，成本过高，且对用于检测的血清质量要求高，不适合常规检测。国内外学者对病毒的分型做了相关研究，但只能单管对一型病毒分型，单管高通量对多型病毒分型的方法还未见报道。亚洲、非洲、美国、澳大利亚均已发现有btv-2/3/4/7/12五种血清型的存在且btv-2型/4型/7型发生较频繁，欧洲及中东已存在btv-2/4/12型，且都曾发生流行。这五种血清型在我国也已全部被发现，其中btv-2/3/4/12型在1997年前就已被发现，且btv-4型、12型在所检测的毒株中不在少数，btv-7也于2014年被分离到我国与世界各国有牛羊及其产品贸易，对蓝舌病的检测非常重要，以预防病毒传入或传出。多重pcr是一种利用多条特异性引物在同一pcr反应体系中同时扩增出多个核酸片段的方法，具有操作简单、快速、特异性好和敏感性高等有点。传统多重pcr常常会存在引物之间相互竞争大而限制其通量和灵敏度的问题，gexp-pcr用通用引物及上下游5’端分别带有通用引物上下游的特异性嵌合引物来进行pcr扩增，在扩增时，通用引物结合在特异性嵌合引物的两端，前几轮由低浓度的特异性嵌合引物主导扩增，后面由高浓度的通用引物主导扩增，可以减小各特异引物间的竞争，增加单管pcr的检测通量和检测灵敏度。借鉴gexp-pcr通用引物原理，但不像其在通用引物上添加荧光染料，使pcr产物不需要在专门的gexp-pcr中才能分析，能在其它低成本仪器上分析，这样的多重pcr既能增加单管检测通量及灵敏度，又能减少成本。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的多重rt-pcr试剂盒和检测方法方法用于同时鉴别检测蓝舌病病毒(btv)2型、3型、4型、7型、12型。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：btv-2型、3型、4型、7型、12型在同一rt-pcr反应体系中进行特异性扩增。

btv-2型、3型、4型、7型、12型基因型分型的多重rt-pcr试剂盒，包括各型反转录引物管、mixpcr反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管。

所述各型反转录引物管：

btv-2反转录引物管：dna序列为seqidno.2的btv-2下游引物0.5od；

btv-3反转录引物管：dna序列为seqidno.4的btv-3下游引物0.5od；

btv-4反转录引物管：dna序列为seqidno.6的btv-4下游引物0.5od；

btv-7反转录引物管：dna序列为seqidno.8的btv-7下游引物0.5od；

btv-12反转录引物管：dna序列为seqidno.10的btv-12下游引物0.5od；

所述mixpcr反应液管由以下反应液组成：

dna序列为seqidno.11的100μmol/l的通用上游引物0.75μl；

dna序列为seqidno.12的100μmol/l的通用下游引物0.75μl；

dna序列为seqidno.13的10μmol/l的btv-2特异性嵌合上游引物0.4μl；

dna序列为seqidno.14的10μmol/l的btv-2特异性嵌合下游引物0.4μl；

dna序列为seqidno.15的10μmol/l的btv-3特异性嵌合上游引物0.5μl；

dna序列为seqidno.16的10μmol/l的btv-3特异性嵌合下游引物0.5μl；

dna序列为seqidno.17的10μmol/l的btv-4特异性嵌合上游引物0.35μl；

dna序列为seqidno.18的10μmol/l的btv-4特异性嵌合下游引物0.35μl；

dna序列为seqidno.19的10μmol/l的btv-7特异性嵌合上游引物0.35μl；

dna序列为seqidno.20的10μmol/l的btv-7特异性嵌合下游引物0.35μl；

dna序列为seqidno.21的10μmol/l的btv-12特异性嵌合上游引物0.35μl；

dna序列为seqidno.22的10μmol/l的btv-12特异性嵌合下游引物0.35μl；

2xpremixtaq缓冲液12.5μl；

灭菌去离子水2.1μl；

合计20μl，为单次反应的用量。

所述阳性对照管：管内为btv-2、btv-3、btv-4、btv-7、btv-12阳性重组质粒混合物。阳性重组质粒由如下步骤获得：分别以如下dna序列引物组：seqidno.1和seqidno.2，seqidno.3和seqidno.4，seqidno.5和seqidno.6，seqidno.7和seqidno.8，seqidno.9和seqidno.10，按常规rt-pcr扩增，分别将pcr目的产物与pmd19-t载体进行连接，转化到dh5α后扩大培养提取质粒，并pcr鉴定、测序和ncbi-blast比对获得。

所述阴性对照管：管内为无btv-2、btv-3、btv-4、btv-7、btv-12的牛肉肌肉组织dna样品。

所述灭菌去离子水管：1000μl。

用所述试剂盒进行btv-2型、3型、4型、7型、12型多重rt-pcr检测方法,步骤如下：

(1)待测样品cdna模板制备：按照商品化病毒rna提取试剂盒提取待测样品全基因组,分别用各型反转录引物及商品化反转录试剂盒使用说明书，制备待测样品各型cdna，取等量混匀后置于-20℃备用。

(2)pcr扩增体系：20μl上述mixpcr反应液,5μl待测样品cdna模板或阳性对照或阴性对照，反应总体积为25μl。

(3)pcr扩增反应条件：95℃5min；95℃30s，57℃退火30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，50℃30s，72℃30s，25个循环；72℃5min，4℃保存。

(4)结果判定：在qesp100进行毛细管电泳后，阳性对照出现5个吸收峰分别为在150-161bp(btv-7)间，在208-222bp(btv-4)之间，在242-258bp(btv-12)之间，)在281-301bp(btv-2)之间，在408-435bp(btv-3)之间；阴性对照无吸收峰；样品在阳性对照位置相同的位置出现吸收峰则判定为该基因型阳性，无吸收峰出现则判定为该基因型阴性；阳性质控未出现目的条带或阴性对照出现条带，则结果无效。

本发明的原理是：针对btv-2型、3型、4型、7型、12型vp2基因的保守序列设计特异性强、退火温度相似、彼此无互补或互补性很小的特异性引物，在此基础上再借鉴gexp-pcr相关原理，在特异性引物的上下游分别添加同一对非生物来源的通用引物上下游构成特异性嵌合引物，最终用低浓度的特异性嵌合引物与高浓度的通用引物来进行pcr扩增。在pcr扩增时，通用引物结合在特异性嵌合引物的两端，前几轮低浓度的特异性嵌合引物主导扩增，后面由高浓度的通用引物主导扩增，可以减小各特异引物间的竞争，克服了传统pcr的检测通量低和检测敏感性差的问题。btv的基因组中，vp3、vp7等都高度保守，vp5变异较小，vp2基因在不同型之间变异最大，是型特异性抗原，但在不同地区同一型病毒的vp2也存在高达30％的变异性，故在设计引物时，既对不同型的vp2基因序列进行比对，也对多个地区同型btv的vp2基因序列进行比对,设计多对待选引物一一验证，最终选出合适的引物。

多重pcr是一种利用多条特异性引物在一pcr反应体系中同时扩增出多个核酸片段的方法，具有操作简单、快速、特异性和敏感性高等优点，在动物病原诊断中被广泛应用。避免了传统方法(病理解剖、病原分离、血清学方法等)操作繁琐，费时费力，敏感性低等问题。

本发明的优点是(1)单管通量较高，单管可同时检测5种血清型，省时，省力；(2)快速、高效：检测时间在4h左右；(3)高特异性：对这5型病毒外的btv其它型及痘病毒、口蹄疫病毒无扩增；(4)灵敏度高：最低检测浓度为btv-2、4型的为4.0×10³copies/μl,btv-3、7、12型4.0×10²copies/μl；(5)减小污染：该方法pcr产物通过毛细管电泳分析，可避免琼脂糖凝胶电泳的化学污染问题；(6)与gexp-pcr相比，不需要在通用引物上加荧光染料，减少了引物成本。

附图说明

图1单重rt-pcr构建结果；

图2多重rt-pcr温度优化结果；图中，a～f退火温度分别为：55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃；

图3特异性试验结果；图中，m2.sizemarker20-1000bp；1～6.模板依次为btv-2、3、4、7、12混合模板，btv-2，btv-3，btv-4，btv-7，btv-12；7.btv-1，8.btv-5，9.btv-6，10～13.模板依次为btv8～btv11；14～26.模板依次为btv-13～btv-25；27.prrsv；28.fmdv；29.阴性对照；

图4敏感性试验结果结果；图中，a～g分别为：4.0×10⁸～10²copies/μl质粒模板；

图5重复性试验结果；图中，m.dl2000dna分子质量标准；1～2.4.0×10⁵拷贝/μl模板；3～4.4.0×10⁴拷贝/μl模板；5-6.4.0×10³拷贝/μl模板；7.阴性对照。

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于以下实施例。

实施例1，引物的设计合成

根据genbank网站上公布的btv-2型、3型、4型、7型、12型病毒的vp2基因序列利用primerpremier5.0生物软件设计这5型病毒的特异性引物，分别标记为seqidno.1-seqidno.10；借鉴gexp-pcr通用引物，标记为seqidno.11、seqidno.12；分别在各特异性上下游引物的5’端加上通用引物上下游构成特异性嵌合引物，标记为seqidno.13-seqidno.22，所有引物均送往华大基因合成。具体引物序列如下：

btv-2特异性上游引物seqidno.1：5’-tactgaggttgaagagaatcc-3’

btv-2特异性下游引物seqidno.2：5’-atcaagcgtgcgaatgtt-3’

btv-3特异性上游引物seqidno.3：5’-tatccatcaggctctcgta-3’

btv-3特异性下游引物seqidno.4：5’-aacctctcaatcacttccaa-3’

btv-4特异性上游引物seqidno.5：5’-actacgacatacggttacag-3’

btv-4特异性下游引物seqidno.6：5’-agccatcttacggaaggt-3’

btv-7特异性上游引物seqidno.7：5’-gcagaagcagagtgacat-3’

btv-7特异性上游引物seqidno.8：5’-gcaagcagtcgtaatagga-3’

btv-12特异性上游引物seqidno.9：5’-cctaccagcgtcagattag-3’

btv-12特异性上游引物seqidno.10：5’-ccagcgaaccttgtgtaa-3’

通用引物seqidno.11：5’-aggtgacactatagaata-3’

通用引物seqidno.12：5’-gtacgactcactatagggat-3’

btv-2特异性嵌合上游引物seqidno.13：

5’-aggtgacactatagaatatactgaggttgaagagaatcc-3’

btv-2特异性嵌合下游引物seqidno.14：

5’-gtacgactcactatagggaatcaagcgtgcgaatgtt-3’

btv-3特异性嵌合上游引物seqidno.15：

5’-aggtgacactatagaatatatccatcaggctctcgta-3’

btv-3特异性嵌合下游引物seqidno.16：

5’-gtacgactcactatagggaaacctctcaatcacttccaa-3’

btv-4特异性嵌合上游引物seqidno.17：

5’-aggtgacactatagaataactacgacatacggttacag-3’

btv-4特异性嵌合下游引物seqidno.18：

5’-gtacgactcactatagggaagccatcttacggaaggt-3’

btv-7特异性亲和上游引物seqidno.19：

5’-aggtgacactatagaatagcagaagcagagtgacat-3’

btv-7特异性嵌合下游引物seqidno.20：

5’-gtacgactcactatagggagcaagcagtcgtaatagga-3’

btv-12特异性嵌合上游引物seqidno.21：

5’-aggtgacactatagaatacctaccagcgtcagattag-3’

btv-12特异性嵌合下游引物seqidno.22：

5’-gtacgactcactatagggaccagcgaaccttgtgtaa-3

实施例2，阳性重组质粒构建

按照takaraminibestviralrna/dnaextractionkit试剂盒提取病毒rna。分别用各特异性引物按primescript^tmonesteprt-pcrkit扩增；按照omegageleetractionkit试剂盒说明书回收目的片段，将其连接至pmd19-t载体并转化至dh5a，增菌后按试剂盒axgyenaxyprepplasmidminippepkit提取质粒，并进行pcr鉴定，pcr阳性质粒送往华大基因测序，测序结果在ncbi中比对，比对正确即为阳性质粒。利用分光光度计对阳性重组质粒进行浓度测定，并计算拷贝数。

实施例3单重rt-pcr构建及优化

以上述阳性质粒为模板构建25μl单重pcr检测体系：permixtaq12.5μl，通用f及r(25μmol/l)各1μl，特异性嵌合f及r(10μmol/l)各0.25μl，模板1μl，灭菌水补足25μl。反应程序：94℃5min；94℃30s，设58℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，50℃30s，72℃30s，25个循环；72℃5min，4℃保存。产物进行毛细管电泳分析。在此基础上对特异性嵌合引物退火温度(55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃)进行优化，再对特异性嵌合引物浓度(0.05μmol/l，0.1μmol/l，0.15μmol/l，0.20μmol/l，0.25μmol/l)优化。

参考图1的结果显示，各血清型单重均扩增出与目的产物大小相符的产物。各血清型理论产物大小为btv-2289bp，btv-3418bp，btv-4213bp，btv-7155bp，btv-12248bp。

实施例4多重rt-pcr构建及优化

将各阳性重组质粒均稀释为4.0×10⁸copies/μl，取等量混匀，以该混合物为及各单质粒为模板，用特异性嵌合引物和通用引物构建25μl的多重pcr体系：permixtaq12.5μl，通用f与r(100μmol/l)各0.75μl，5对特异性嵌合引物f与r(10μmol/l)各0.25μl，模板各1μl，灭菌水补足25μl。反应条件：95℃5min；95℃30s，58℃退火30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，50℃30s，72℃30s，25个循环；72℃5min，4℃保存。反应结束后进行毛细管电泳分析。再综合单重pcr结果对特异性引物浓度(0.1～0.25μmol/l)及退火温度(55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃)进行优化。结果进行毛细管电泳分析。筛选好后以5种血清型的cdna混合物为模板验证该方法。

结果当btv-4、7、12均取0.14μmol/l，btv-2取0.16μmol/l，btv-17取0.2μmol/l时，5种血清型目的片段均扩增良好；温度优化结果显示，当温度为55℃～60℃时，都扩增良好(参考图2)，最终选取59℃为退火温度。

实施例5特异性试验

以5种病毒的cdna及混合cdna及btv其它型型病毒、小反刍兽疫病毒prrsv、口蹄疫病毒fmdv的cdna或dna作模板，用上述实施例4优化建立好的方法进行扩增。

参考图3的结果显示：该方法所建立的五重rt-pcr方法只对btv-2型、3型、4型、7型、12型病毒模板有特异性扩增，而对其它型btv、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒无特异扩增。

实施例6敏感性试验

将浓度4.0×10⁸copies/μl的五种阳性质粒等体积混匀，再进行10倍倍比稀释组成4.0×10⁸～10⁰copies/μl9个浓度梯度，以各浓度梯度为模板按优施例4优化方法进行扩增。

参考图4的结果显示:btv-2、4型的最低检测浓度为4.0×10³copies/μl，btv-3、7、12型最低检测浓度为4.0×10²copies/μl。

实施例7重复性试验

根据敏感性试验结果，选取能检测出的3个低浓度的模板，每个模板进行两次重复，作为组内重复试验；将不同批次提取的质粒按敏感性试验方法进行两次重复作为组间重复试验。

根据敏感性试验结果显示，5种血清型的最低检测浓度均能达到4.0×10³copies/μl，故取4.0×10⁵copies/μl～4.0×10³copies/μl3个浓度的模板，每个模板进行两次重复作为组内重复，结果与灵敏度试验结果一致(结果参考图5)；取不同批次提取质粒进行两次重复为组间重复，结果与灵敏度试验结果一致。

实施例8试剂的制备

各型反转录引物管：btv-2反转录引物管：序列为seqidno.2的btv-2下游引物0.5od；btv-3反转录引物管：序列为seqidno.4的btv-3下游引物0.5od；btv-4反转录引物管：序列为seqidno.6的btv-4下游引物0.5od；btv-7反转录引物管：序列为seqidno.8的btv-7下游引物0.5od；btv-12反转录引物管：序列为seqidno.10的btv-12下游引物0.5od；

mixpcr反应液管：100μmol/l的seqidno.11和seqidno.12各0.75μl；10μmol/l的seqidno.13和seqidno.14各0.375μl；10μmol/l的seqidno.15和seqidno.16各0.625μl；10μmol/l的seqidno.17～seqidno.22的各0.25μl；2xpremixtaq缓冲液12.5μl；灭菌去离子水2.5μl；共20μl为单次反应量，每个试剂盒供足做50个反应的量共1000μl。

阳性对照管：按实施例2的方法制备阳性质粒，把各型病毒的阳性质粒均稀释为10⁸copies/μl,取等体积混匀，每管装260μl。

阴性对照管：用试剂盒提取无btv-2、btv-3、btv-4、btv-7、btv-12的牛肉肌肉组织dna样品，用灭菌去离子水稀释至浓度为15～20ng/μl,每管装260μl。

灭菌去离子水管：每管1000μl。

实施例9试剂盒的组装

如实施例8所配制的各型反转录引物管、mixpcr反应液管、阳性对照管、阴性对照管、灭菌去离子水管各1支，贴上生产日期、有效期及产品标签，低温保存及运输。

sequencelisting

<110>重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>btv-2型、3型、4型、7型、12型基因型分型鉴别的多重rt-pcr试剂盒及其检测方法

<160>22

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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tactgaggttgaagagaatcc21

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