本发明属于生物工程领域，涉及一种基因的检测方法，具体来说是一种针对靶基因序列检测的方法。
背景技术：
：现有技术中，针对靶基因序列检测的方法包括荧光定量pcr法、测序法、质谱法、基因芯片法、酶切法，但是这些检测方法操作复杂，检测时间长，或需要价格昂贵的大型仪器设备。技术实现要素：针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种针对靶基因序列检测的方法，所述的这种针对靶基因序列检测的方法要解决现有技术中针对靶基因序列检测的方法操作复杂、流程长、需要大型且昂贵的仪器设备的技术问题。本发明提供了一种针对靶基因序列检测的方法，包括如下步骤：(1)当检测病原体核酸时，针对待测病原体基因组特定序列设计一对特异引物，利用此对特异引物对抽提后的样本核酸进行扩增，如样本包含病原体核酸，则可扩增出该病原体特定序列的扩增子；(2)当检测人基因组dna特定基因的snp位点时，对该snp位点设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条该基因的通用引物，对抽提的样本核酸进行两次平行扩增，一次使用野生型特异性引物和通用引物对，另一次使用突变型特异性引物和通用引物对，根据snp纯合杂合情况分成三种：a:野生型纯合，则只有用野生型特异性引物和通用引物对扩增可得到包含该snp位点的扩增子；b:突变型纯合，则只有用突变型特异性引物和通用引物对扩增可得到包含该snp位点的扩增子；c:野生型突变型杂合子，则使用野生型特异性引物和通用引物对扩增，及使用突变型特异性引物和通用引物对扩增，均可得到包含该snp位点的扩增子；(3)对步骤(2)产生的扩增产物，加入在扩增子序列原引物的内侧设计一条特异引物，该引物的5’端标记生物素，在pcr条件下进行单引物扩增，如步骤(2)扩增产物含有靶扩增子，则单引物可以相应扩增出相当数量的带有5’端生物素标记的单链靶片段，当步骤(2)扩增产物不含靶扩增子或有非特异扩增片段时，特异单引物无法扩增出相当数量的单链靶片段；(4)针对步骤(3)的单链靶片段，设计与其部分序列互补的寡核苷酸探针并固定于固相载体上，该探针与单链靶序列的互补区域控制在足以捕获单链靶序列但与步骤(3)使用的单向引物无互补区域，将步骤(3)产物通过覆盖有寡核苷酸探针的固相载体上，如产物中含有相当数量的单链靶片段，则标记有生物素的单链靶片段就会被探针捕获，再使用合适缓冲液洗涤固相载体，则残留的单引物也会被洗涤掉；(5)利用包含有结合avidin(抗生物素蛋白)的显色酶的缓冲液与步骤(4)之后的固相载体孵育，则生物素与avidin结合从而将显色酶连接到固相载体上，使用缓冲液洗涤固相载体后，加入含有显色底物的液相体系，当确实有相当数量的显色酶连接到固相载体时，可通过颜色的变化直接判读是否有靶序列得到扩增；(6)判读时，如检测病原体核酸，显色则表明样本中有病原体核酸；如检测人基因组dna特定基因的snp位点，根据snp纯合杂合情况分成三种：a:野生型纯合，则只有用野生型特异性引物和通用引物对扩增最终可显色；b:突变型纯合，则只有用突变型特异性引物和通用引物对扩增最终可显色；c:野生型突变型杂合子，则使用野生型特异性引物和通用引物对扩增，及使用突变型特异性引物和通用引物对扩增，均可显色。进一步的，所述的显色酶为辣根过氧化酶。进一步的，所述的显色底物为与辣根过氧化酶配套的tmb底物。本发明提供了一种针对靶基因序列检测的方法，该方法可用于检测靶基因的有无或者靶基因的分型。本发明的方法的主要内容包括：(1)基于常规pcr(检测基因有无)或者arms-pcr(检测基因分型)的扩增对靶基因进行放大；(2)利用带生物素标记的内侧单引物对扩增序列进行一轮单引物延伸；(3)利用与第(2)步产物互补的固定于固相表面的探针捕获第(2)步产物；(4)利用avidin结合的显色酶与第(3)步捕获的片段上的生物素结合并在显色反应条件下显色评判靶基因的有无或靶基因的分型。本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明提供了一种针对靶核酸序列的一种方便快速成本低但又能保持灵敏度和特异性的检测方法。本发明无需对目的片段进行扩增后的纯化分离，也无需昂贵荧光装置对靶基因的扩增与否进行检测，而且第一轮pcr与第二轮单引物延伸相结合，再加上探针捕获，可在保持灵敏度的同时提高对靶序列检测的特异性。本发明是一种快速低成本的基因检测方式，简便，应用面广，灵敏度高，当扩增反应完成后，不需要任何昂贵的检测仪器和复杂操作过程。本发明可用于传统感染性疾病病原体核酸的检测或者人基因snp位点的分型检测。附图说明图1是本发明针对靶基因序列检测的方法的原理示意图。图2是采用本发明的方法检测人血浆中乙型肝炎病毒的结果视图。图3是采用本发明的方法检测人ffpe组织中egfr基因l858r位点突变的结果视图。具体实施方式实施例1如图1所示的原理图，检测人血浆中乙型肝炎病毒(hbv)。引物设计:根据genbank:lc279276.1的序列,利用primerexpress3.0软件设计引物)：在hbvdna序列保守区设计一对扩增引物hbv1f(正向)和hbv1r(反向)，同时在上述引物扩增区设计带biotin的检测引物hbv2r。引物名称序列(5’-3’)hbv1fgccagtagcacctcctcctgchbv1rttccactgcatggcctgaggatghbv2rtgtctcttagaggtggagag-biotin上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。样本：hbv浓度为100iu/ml重复3孔，hbv浓度为10iu/ml重复5孔，hbv阴性血浆重复6孔，超纯水重复2孔。提取试剂：基因组dna快速抽提试剂盒(货号：b518205，生工生物)扩增试剂：2×hotstartpcrmastermix(货号：b639288，生工生物)操作：1.核酸提取：用基因组dna快速抽提试剂盒提取核酸。2.pcr扩增：3.扩增程序：4.扩增产物纯化：取扩增产物5μl，加入虾碱酶6单位，外切酶i12个单位，37度孵育15分钟，即可除去多余的引物以及dntps，然后80度，15分钟就可以使虾碱酶失活。5.单引物延伸：6.杂交延伸产物与固定在硝酸纤维素滤膜(孔径0.45μm)上的核酸片段杂交，洗去其余游离物质。7.与biotin结合加入avidin-hrp工作液，使得biotin与avidin结合，37℃孵育30分钟，弃去孔内液体，甩干。8.显色加入底物溶液(tmb)，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右(根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟)。结果:图2表明，hbv浓度为100iu/ml重复3孔和10iu/ml重复5孔均有显色，表明为阳性；hbv阴性血浆重复6孔和超纯水重复2孔均没有显色，表明为阴性，以上结果均符合预期。实施例2如图1所示的原理图，检测人ffpe组织中egfr基因l858r位点突变。引物设计:根据genbank:ng.007726.3的序列，利用primerexpress3.0软件设计引物)：在egfr21外显子序列保守区设计一对扩增引物e211f(正向)和e211r(反向)，该扩增区域包含l858r突变位点，同时在上述引物扩增区设计带biotin的针对l858r突变位点的arms-pcr引物e212r。引物名称序列(5’-3’)e211fcagcatgtcaagatcacagattttgge211rtckgtgtaaaattgattccaatgcce212rcacccagcagtttggccc-biotin样本：l858r突变频率为10％重复3孔，l858r突变频率为10％重复5孔，egfr野生型重复6孔，超纯水重复2孔。提取试剂：allprepdna/rnaffpekit(货号：k80234，qiagen)扩增试剂：2×taqpcrmastermix(货号：b639288，生工生物)操作：实验具体操作参见实施例1。结果：图3表明，l858r突变频率为10％重复3孔和突变频率为5％重复5孔均有显色，表明为阳性；egfr野生型重复6孔和超纯水重复2孔均没有显色，表明为阴性，以上结果均符合预期。序列表<110>上海卡敏生物科技有限公司<120>一种针对靶基因序列检测的方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gccagtagcacctcctcctgc21<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttccactgcatggcctgaggatg23<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgtctcttagaggtggagag20<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cagcatgtcaagatcacagattttgg26<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tckgtgtaaaattgattccaatgcc25<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cacccagcagtttggccc18当前第1页12