一种水产养殖用二元复合菌剂的制作方法

本发明涉及一种粪产碱菌与解淀粉芽孢杆菌的二元复合菌剂，及其在水产养殖中的应用，具体还涉及一种含有粪产碱菌、解淀粉芽孢杆菌、和芦苇的大黄鱼养殖用饲料。

背景技术：

大黄鱼(Larimichtys crocea)是我国重要的海水名贵鱼类，近年来大黄鱼人工养殖技术取得重要进步，我国年产大黄鱼12.79万吨，是我国养殖产量最高的海水鱼类。大黄鱼养殖规模的扩大造成大黄鱼病害频繁发生。我国大黄鱼先后暴发了弧菌、杀香鱼假单胞菌、刺激隐核虫、虹彩病毒等疾病，其中细菌性疾病不但可以作为原发性病原感染大黄鱼，也可在寄生虫和病毒感染后继发入侵，是其他病原感染后期主要的死亡原因，细菌病原成为阻碍大黄鱼产量提高、产业稳定发展的重要障碍。从大黄鱼水产病害测报数据来看，由细菌引起的大黄鱼发病和损失占全部病害损失的40％以上。近年来对抗生素的使用管理日益规范，迫切需要寻找安全、高效的有益菌株，用于细菌性鱼病的控制。

内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，最早的内生菌主要指内生真菌，与植物的驱虫作用有关。随着研究的深入，内生细菌也日益受到重视。目前植物内生细菌具有产生抗真菌、抗细菌和寄生虫、固氮作用等多种功能，是微生物农药、增产菌或潜在的生防载体菌。芦苇(Phragmites australis)是多年水生或湿生的高大禾草，可生长于沟渠、河堤沼泽地、盐度较高的滨海湿地和沿海滩涂，芦苇抗逆性强、适应性好、繁殖快，在污水净化中有重要的生态作用，是重要的生态恢复植物。芦苇含有丰富的内生菌，除镰孢属、青霉属和链格孢属为优势菌属外，还有20门以上近千种不同类型的内生细菌。

为寻找高效安全的海水鱼病害防控有益微生物制剂，为海水鱼病的防治提供更多选择，本发明对象山大黄鱼养殖海域的芦苇进行了采集和内生菌分离，并采用大黄鱼主要病原菌杀香鱼假单胞菌和溶藻弧菌为指示菌进行了拮抗菌株筛选，鉴定了有抑菌活性菌株，开展了分离菌株的抑菌谱、分离菌株对小鼠和大黄鱼毒性以及对抑制大黄鱼肠道弧菌等方面的作用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题

在水产养殖领域中，亟需有效防治那些降低商品鱼类生产产率的病原体的方法。在鱼类发生疾病的情况下，主要具有预防特性的且能够避免和减轻诱病因素的早期干预可发挥较大作用。为此，寻找可行的替代处理方法非常重要。可用方法应该能够防治广谱病原菌并满足目前的安全准则。本发明满足这些标准并具有其他优点。

本发明溶藻弧菌及杀香鱼假单胞菌为指示菌，对大黄鱼养殖区域附近分离的菌株进行筛选，共获得10株活性菌有较强抑菌活性的菌株，16S rDNA鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)、碱性杆菌(Alcaligenes sp.)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)、弧菌(Vibrio sp.)、异常球菌 (Daenococcus)。通过16SrDNA与gyrB基因同源性比对及系统发育分析，结合形态和生化鉴定，将抑菌活性较强的NBPa-7和NBLm-36鉴定为粪产碱菌 (Alcaligenes faecalis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

测试了NBPa-7、NBLm-36对7种大黄鱼常见病原菌的抑菌谱，NBPa-7对溶藻弧菌和杀香鱼假单胞菌均有良好的抑菌活性，抑菌圈分别为23.2mm和 12mm；NBLm-36大黄鱼源创伤弧菌、哈维弧菌、嗜水气单胞菌以及的大肠杆菌、葡萄球菌均有良好的抑菌效果，有广泛的抑菌性，但对溶藻弧菌和杀香鱼假单胞菌均抑菌作用。分析了pH、温度有机溶剂等；因素对拮抗菌抑菌活性的影响，NBPa-7上清经60℃处理可提高抑菌活性，100℃处理1h可使抑菌活性下降，121℃失活；NBLm-36上清28-80℃处理后不影响抑菌活性，100℃抑菌活性大部丧失，121℃全部失活；甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂均可使上清失活，提示抑菌物质可能是具有蛋白或多肽结构的活性成份。对拮抗菌上清进行饱和硫酸铵分级沉淀表明，40％、60％饱和度可沉淀出具有活性物质成份，初步证实活性物质具有蛋白或多肽类特性。

为保证拮抗菌在生产应用中的安全性，对NBPa-7和NBLm-36菌株进行了小鼠的安全性评估，试验菌株以.0×108cfu/ml腹腔注射5周龄小鼠和口灌5日龄乳鼠，48h未发生死亡，48h期间实验鼠行为、体温均未观察到异常；48h后解剖实验鼠，各内脏未发现明显病变，实验鼠血液、肝、脾均未分离到实验菌株，表明NBPa-7和NBLm-36在小鼠体内不能有效繁殖，引起小鼠发生病理性变化，上述菌株具有良好的安全性。

解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)是目前生防应用的重要拮抗细菌，属芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，枯草芽抱杆菌高度接近。该菌具有人体无毒害、不造成环境污染等特点，可分泌多种抑菌有效成分，可用于假单胞菌、弧菌和芽孢杆菌等海洋污损细菌的抑菌。芽孢杆菌因其具有耐热、耐旱、耐紫外芽孢，生存能力强，以此制备的益生菌制剂保存期长、使用安全，在抑制病原菌方面的良好的应用。本发明分离到的解淀粉芽孢杆菌NBLm-36对多种大黄鱼源病原菌均有良好抑菌活性；芦苇来源的粪产碱菌(A.faecalis)是环境中广泛分布的菌，具有降解苯酚、间甲酚、农药等多种作用，从粪产碱菌获得的新型微生物多糖安全无毒，可广泛应用于食品、医药和化工等领域，还可用于水质处理。本发明从芦苇中分离到的粪产碱菌NBPa-7，具有对溶藻弧菌、杀香鱼假单胞菌均有良好的抑菌活性。上述两个菌株对小鼠均无致病性，有较好的安全性，是有良好潜力的大黄鱼病原拮抗菌株。

解决上述技术问题的手段

根据基础实验结果，本发明人为了将上述发现应用于水产养殖的防病领域中，经过大量试验及锐意钻研的精神，惊奇地发现了一种水产养殖中防病方法，从而完成了本发明。

(1)、一种水产养殖用二元复合菌剂，其特征在于，含有粪产碱菌与解淀粉芽孢杆菌。

(2)、根据(1)所述的复合菌剂，其中还含有芦苇。

(3)、一种水产养殖用饲料，其特征在于，包括粪产碱菌与解淀粉芽孢杆菌。

(4)、根据(3)所述的饲料，其中还含有芦苇。

(5)、根据(3)或(4)所述的饲料，其中粪产碱菌与解淀粉芽孢杆菌的含量分别为3.0×10⁷cfu/g饲料～5.0×10⁹cfu/g饲料。

(6)、根据(4)所述的饲料，相对于饲料总重量，所述芦苇含量为0.5～5.0重量％。

(7)、根据(4)所述的饲料，相对于饲料总重量，所述芦苇含量为2.0重量％。

(8)、一种抗菌组合物在制造大黄鱼用饲料中的用途，所述抗菌组合物含有粪产碱菌与解淀粉芽孢杆菌。

(9)、根据(8)所述的用途，所述抗菌组合物还含有芦苇。

(10)、根据(8)或(9)所述的用途，所述抗菌组合物能够控制溶藻弧菌、副溶血弧菌和杀香鱼假单胞菌大黄鱼病原细菌，提高大黄鱼抗病力，减少大黄鱼发病。

附图说明

图1活性菌株初筛结果；

图2NBPa-7、NBLm-36分子鉴定和系统发育树分析，A、B：NBPa-7、 NBLm-36 16S rDNA基因；C：NBLm-36gyrB基因；D、E：16S rDNA、gyrB 电泳图；

图3菌落和菌体形态，A、B：NBPa-7菌落/菌体(×100)；C、D：NBLm-36 菌落/菌体(×100)；

图4纸片法抑菌结果，A：NBPa-7对溶藻弧菌的抑菌圈；B：NBLm-36对哈维弧菌抑菌圈；

图5NBPa-7、NBLm-36上清对不同pH的稳定性；

图6不同温度对NBPa-7、NBLm-36上清抑菌活性的影响；

图7小鼠解剖和内脏检查，A、B：成年鼠adult mice；C、D：新生鼠newborn rat；

图8新生鼠血细胞镜检图(×100)，A：NBPa-7；B：NBLm-36。

图9不同复合菌组投喂大黄鱼后肠道异养细菌和弧菌量

具体实施方式

将粪产碱菌和解淀粉芽孢杆菌混合到通常用作鱼类养殖用饲料的饲料中，鱼类用饲料的成分只要是通常使用的成分，就没有特别限制，例如为大豆粉、鱼粉、肉粉、小麦全粒粉、菜籽等蛋白源，玉米、燕麦、大麦、高梁、小麦、黑小麦、黑麦、稻米等碳水化合物源，其它有维生素、矿物质、油脂等的添加物等。

关于添加量，粪产碱菌向饲料中的添加量约为5.0×10²cfu/g饲料或其以上，例如约(1.0～4.0)×10³cfu/g饲料或其以上，优选为约3.0×10³cfu/g饲料或其以上、或约4.0×10³cfu/g饲料或其以上，上限没有特别限制，但是优选约1.0×10⁷cfu/g 饲料～约1.0×10⁹cfu/g饲料左右。由于添加过量菌剂会影响大黄鱼的生长曲线 (试验数据未显示)，因此本发明最优选3.0×10⁷cfu/g饲料～5.0×10⁹cfu/g饲料。

解淀粉芽孢杆菌向饲料中的添加量约为5.0×10²cfu/g饲料或其以上，例如约(1.0～4.0)×10³cfu/g饲料或其以上，优选为约3.0×10³cfu/g饲料或其以上、或约4.0×10³cfu/g饲料或其以上，上限没有特别限制，但是优选约1.0×10⁷cfu/g饲料～约1.0×10⁹cfu/g饲料左右。由于添加过量菌剂会影响大黄鱼的生长曲线(试验数据未显示)，因此本发明最优选3.0×10⁷cfu/g饲料～5.0×10⁹cfu/g饲料。

只要在上述两种菌的比例并没有特别限定，只要各自在上述优选范围内即可。但是从制备工艺的便利角度出发，优选一比一进行混合。

粪产碱菌和解淀粉芽孢杆菌的培养可以按照文献等中记载的条件下进行。例示的培养方法如下所述。

粪产碱菌可以使用含有碳源、氮源、无机物等的液体培养基或固体培养基等。作为碳源，可列举可同化的碳源，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、糖蜜等。另外，作为氮源，可以列举例如有蛋白胨、肉类提取物、酪蛋白水解物、硫酸铵等。也可以进一步根据需要添加作为无机成分的磷酸盐、镁、钾、钠、钙、铁、锰等盐类、维生素、氨基酸、消泡剂、表面活性剂等。优选在有氧条件下进行培养，培养基的初始pH为5～9，优选pH6～8，培养温度设为20～ 50℃、优选35～40℃，培养时间例如为12小时～7天。培养后，可以通过利用离心分离等分离法回收菌体而得到。回收的菌体可以是培养物、浓缩物、干燥物、液状、粒状、粉末状、小丸状、棒状、球状等任意形态。

解淀粉芽孢杆菌可以通过如下方法得到：在含有碳源、氮源、无机物等的液体培养基(pH7.2～7.4)中，在有氧条件下在37～38℃下一边缓慢地搅拌，一边培养约12小时～约3天或其以上的时间，然后通过离心分离回收菌体(例如参照HK Wang et al.,Food Technol.Biotechnol.51(1):78-83(2013))。作为碳源，可列举可同化的碳源，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、糖蜜等。另外，作为氮源，可以列举例如有蛋白胨、肉类提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、硫酸铵等。也可以进一步根据需要添加作为无机成分的磷酸盐、镁、钾、钠、钙、铁、锰等盐类、维生素、氨基酸、消泡剂、表面活性剂等。回收的菌体可以是培养物、浓缩物、干燥物、液状、粒状、粉末状、小丸状、棒状、球状等任意形态。

关于粪产碱菌和解淀粉芽孢杆菌，只要发挥本发明的效果、即通过在添加到鱼饲料中，增强鱼的抗病性，则可包含任一种菌株。这种菌株并不限定于实施例中发明人分离到的菌株，还可以是其衍生株或变异株。

上述的衍生株或变异株可以通过将亲株在亚硝基胍、亚硝基脲、甲基磺酸乙酯、它们的衍生物等化学诱变剂的存在下进行培养，或者对培养亲株照射紫外线、X射线等高能量射线等方法而得到。

本发明进一步在另一实施方式中，包括将上述粪产碱菌和解淀粉芽孢杆菌与其它活菌剂一起饲喂鱼。

在其它活菌剂中，优选含有乳杆菌属细菌、和其它芽孢杆菌属细菌等活菌剂。更优选其它芽孢杆菌属细菌。如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等，优选为枯草芽孢杆菌。

乳杆菌属(Lactobacillus)细菌可选择保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrück)、布氏乳杆菌(Lactobacillus bufner)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)等。

上述的衍生株或变异株可以按照上述的制作方法同样地得到。

本发明的饲料添加组合物可以是固体状或液体状的任一种形态。在固体状的形态中包括例如粉末、颗粒、小丸等。另外，在液体状的形态中包括例如悬浮液等。为了加工成这种形态，可以通过适当含有包括批准可作为鱼类用的物质：载体、赋形剂、助剂等，由此可作为上述的组合物形态。

本发明的饲料添加组合物的使用是为了添加到饲料中并被养殖鱼类摄取。优选的添加量相对于饲料为0.001重量％～1重量％的范围，但并不限定于该范围。

实施例1

1.1材料与方法

1.1.1实验仪器

生化培养箱SPX-150B-Z购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；酶标仪 SPECTRAmax i3x购自美谷分子仪器(上海)有限公司；高速冷冻离心机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Nano-100微量分光光度计、生物样品均质仪Bioprep-24均为杭州奥胜仪器有限公司生产。

活性测定采用6mm滤纸片为通用电气生物科技双圈定性滤纸产品；滤纸打孔采用得力手握式打孔机。

1.1.2实验试剂和菌株

营养肉汤、营养琼脂、细菌琼脂粉、TCBS培养基购自北京路(陆)桥技术有限责任公司；1Kb DNA Ladder，100bp DNA Ladder购自北京全式金生物技术有限公司；16S rRNA扩增通用引物27F/1492R、gyrB引物up-1s/up-2Sr等购自华大基因。用于抑菌测定的指示菌为本发明室分离保存的弧菌Lc-1601和杀香鱼假单胞菌Lc-1609，其他菌株详见表1。

表1实验所用菌株来源、宿主及地区

Table 1 Bacteria strains，host spices and region

1.1.3拮抗菌株的分离

采集宁波市海洋与渔业研究院横马基地大黄鱼池大黄鱼及养殖池周边海水、土壤、藻类、芦苇，用于细菌分离。

鱼类菌株为无菌解剖海水鱼，取肠道于1.5％NaCl营养琼脂(NA)划线分离；海水样品直接划线分离细菌；池底土壤用1.5％无菌盐水稀释10倍后划线；海水藻类、芦苇无菌剪至0.2-0.3cm大小，置于1.5mL灭菌EP管用均质仪研磨 2-3min，同上划线。上述分离物于28℃培养24h，用灭菌牙签挑取代表性单菌落，接种于预涂布杀香鱼假单胞菌Lc-1609及弧菌Lc-1601为指示菌的NA，28℃培养24h，观察并挑取有明显抑菌圈的菌株，半固体营养琼脂管穿刺培养后暂存，用于后续分析。

1.1.4拮抗菌株的鉴定

挑取拮抗活性菌落，制成菌涂片，革兰氏染色，风干后封片镜检。

取抑菌圈明显的拮抗菌，用16S rDNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，模板采用水煮沸法，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；gyrB引物up-1s/up-2Sr 对NBLm-36进行扩增，反应条件：95℃5min；94℃1min,63℃1min，72℃2min, 30个循环；72℃10min，电泳确认目的片段大小，PCR产物由华大基因测序，所获序列与NCBI进行同源性比对，获测试菌株分子鉴定结果。

1.1.5拮抗活性菌抑菌谱测定

挑取抑菌效果明显的NBPa-7、NBLm-36测定抑菌谱。

纸片抑菌法(K-B法)：取28℃振荡培养18h的指示菌200μL，加至20ml 50℃1.5％NA中，制备含菌平板备用。拮抗菌28℃振荡培养18h，12000r/min 30min离心，取上清液30μL加至灭菌滤纸片，将晾干滤纸片贴至含指示菌平板， 28℃倒置培养24h，记录抑菌结果。

最低抑菌浓度(MIC)测定：96孔板培养法各孔加入营养肉汤(NB)100μL，首孔加入拮抗菌上清100μL，两倍稀释法稀释至1/32，加入指示菌液20μL (2.0×10⁹CFU/mL)，28℃培养24h，以抑制指示菌生长的最小稀释度为其最低抑菌浓度(MIC)。

表2缓冲体系的配置

Table 2 The Configuration of Buffer System

1.1.6抗菌活性物质的稳定性测定

1.1.6.1抗菌活性物质的pH稳定性

拮抗菌NBPa-7、NBLm-36上清(1.5)以pH3.8-8.6范围内不同pH缓冲液 28℃孵育处理24h，缓冲液调回中性，以各pH处理组缓冲液为对照(表2)；按1.5测定不同pH缓冲液处理后拮抗物对指标菌MIC。测定孔细菌生长按OD600值测定，抑菌率按下式计算：

抑菌率＝(A-A1)/A×100％

式中，A为对照组OD600值，A1为实验组OD600值。

1.1.6.2抗菌活性物质的耐热性

NBPa-7、NBLm-36上清100μL，40℃、60℃、80℃、100℃水浴处理1h，另取NBPa-7、NBLm-36上清100μL 121℃高压灭菌20min，处理后上清按1.5 微孔板法测定不同温度处理后的拮抗物对指标菌MIC。

1.1.6.3抗菌活性物质的有机溶剂稳定性

NBPa-7、NBLm-36上清液中分别加入等体积甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿，剧烈振荡处理3min，室温孵育1h，按1.5测定有机溶剂处理后的抑菌活性。

1.1.7拮抗菌的动物毒性

NBPa-7、NBLm-3628℃培养18h，麦氏比浊管测定菌浓度，生理盐水稀释至2.0×10⁹cfu/ml；腹腔注射成年鼠0.05ml、0.025ml；上述菌液用灭菌牛奶稀释至2.0×10⁹cfu/ml，以0.05ml、0.025ml/只剂量口灌5日龄新生鼠，实验鼠均每日测量体温、观察反应。

1.1.8活性物质提取

取NBPa-7、NBLm-36培养上清50mL，加入20％体积乙酸乙酯，剧烈振荡，反复萃取2次，合并萃取有机相，旋转蒸馏至1-2mL，用纸片法测定提取物的抑菌活性。

取预冷至4℃NBPa-7、NBLm-36培养上清，电磁搅拌下缓慢加入(NH4)2SO4固体，离心，12000r/min离心，分别获取20％、40％、60％、80％、100％饱和度沉淀；1mL生理盐水溶解沉淀，Nano-100测量蛋白浓度；纸片法测定各级饱和度盐析提取物，以饱和(NH4)2SO4溶液为对照，纸片法测定各提取物的抑菌活性。

1.2实验结果

1.2.1活性菌株的分离与鉴定

从鱼肠道、藻类、芦苇根、土壤等处共选取38个单菌落进行抑菌性测定，共获10株对大黄鱼致病菌株有抑制活性的菌株(图1)。16sDNA鉴定分别为芽孢杆菌(Bacillus sp.)、产碱杆菌(Alcaligenessp.)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)、弧菌(Vibrio sp.)、异常球菌(Daenococcus sp.) 等(表3)。

表3分离拮抗菌的来源和抑菌特性

Table 3 Source and bacteria inhibition of antagonistic strains

注：“+”有抑菌活性；“-”无抑菌活性；

对抑菌活力较强的菌株NBPa-7、NBLm-36进行了NCBI的16SrDNA基因序列比对和系统发育树分析(图2A、2B)。结果表明：NBPa-7与粪产碱菌(A. faecalis)聚为一支，同源性高达99％，结合NBPa-7的菌落形态、菌体形态(图 3A、3B)，将NBPa-7鉴定为是粪产碱菌；NBLm-36SrDNA序列比对归为芽孢杆菌(图2B)，根据该菌的解旋酶(gyrB)基因的序列比对结果和系统发育树分析(图2C、2E)，NBLm-36与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)同源性高达99％，再根据NBLm-36菌落和菌体形态(图3C、3D)，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。

1.2.2最小抑菌活性(MIC)实验

通过纸片法测试了NBPa-7、NBLm-36对7种指示菌的抑菌特性，具体如表4所述，结果表明NBPa-7对溶藻弧菌有良好的抑菌效果，初筛浓度下抑菌圈直径为2.32cm(图4A)；NBLm-36对哈维弧菌有一定效果，初筛浓度下抑菌圈直径为0.8cm(图4B)，抑菌谱如表4。

表4 NBPa-7、NBLm-36抑菌谱

Table4 The Antibacterial spectrum about NBPa-7，NBLm-36

注：“+”抑菌圈＜9mm；“++”抑菌圈9-11mm；“+++”抑菌圈12-14mm；“++++”抑菌圈＞14mm；“-”无抑菌活性；

将NBPa-7、NBLm-36上清液倍半稀释法稀释成以下倍数：1、1/2、1/4、 1/8、1/16、1/32。用指示菌检测抑菌活性，结果见表5、6。

表5 NBPa-7对不同菌株的最小抑菌浓度

Table5 The minimum inhibitory concentration of NBPa-7 to different bacterial strains

注：“+”有抑菌活性；“-”无抑菌活性；

表6 NBLm-36的最小抑菌活性

Table6 The minimum inhibitory activity of NBLm-36

注：“＋”有抑菌活性；“－”无抑菌活性；

1.2.3拮抗物的稳定性测定

1.2.3.1 pH稳定性

NBPa-7、NBLm-36上清作为对照，对照组pH均为7.0；测试不同pH处理后上清的抑菌活性，由图5可见，在pH3.8-8.6范围内，NBLm-36较为稳定；NBPa-7经酸性和碱性pH处理后，抑菌活性有较大提高，pH6.2处理可使NBPa-7 的抑菌活性降低，抑菌率降低28.93％。

1.2.3.2热稳定性

以不同温度处理NBPa-7、NBLm-36上清液，测定处理后的抑菌活性，由图6可见，NBPa-7上清经60℃处理后，抑菌活性明显上升，抑菌率提高15.78％， 80℃处理也有一定的上升，100℃处理1h后活性明显下降，121℃全部失活； NBLm-36上清28-80℃处理后，抑菌活性稳定，100℃大部失活，121℃处理全部失活。

1.2.3.2有机溶剂稳定性

NBPa-7、NBLm-36上清与等体积甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿混合，处理1h后，测定上清抑菌活性，所有处理的抑菌活性全部丧失，表明抑菌物质对有机溶剂敏感。

1.2.4拮抗菌对小鼠的毒性测定

NBPa-7、NBLm-36以1.0×10⁸cfu/只腹腔注射ICR成年鼠，同时以1.0×10⁸cfu/ 只口灌5日龄新生鼠。48h内，小鼠体温、行为均未观察到异常，48h后解剖注射和口灌小鼠，成年鼠(图7A、7B)和新生鼠(图7C、7D)内脏器官未发现明显病变，心、肝细菌分离未出现细菌、血片镜检；检查新生鼠瑞氏-姬姆萨染色血片，与对照鼠比，未出现白细胞升高升高等情况(图8)。

1.2.5活性物质提取

用(NH4)2SO4进行分级沉淀，NBPa-7菌株上清液在80％饱和度的(NH4)2SO4溶液中会沉淀出褐色物质；NBLm-36菌株上清液分别在40％、60％饱和度的 (NH4)2SO4溶液中依次析出白色、褐色物质，初步推测活性物质为蛋白质或者分子量大的多肽类物质。

实施例2

2.1材料与方法

2.1.1实验仪器

生化培养箱SPX-150B-Z购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；酶标仪 SPECTRAmax i3x购自美谷分子仪器(上海)有限公司；高速冷冻离心机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Nano-100微量分光光度计、生物样品均质仪Bioprep-24均为杭州奥胜仪器有限公司生产。

活性测定采用6mm滤纸片为通用电气生物科技双圈定性滤纸产品；滤纸打孔采用得力手握式打孔机。

2.1.2实验试剂和菌株

营养肉汤、营养琼脂、细菌琼脂粉、TCBS培养基购自北京路(陆)桥技术有限责任公司；1Kb DNA Ladder，100bp DNA Ladder购自北京全式金生物技术有限公司；16S rRNA扩增通用引物27F/1492R、gyrB引物up-1s/up-2Sr等购自华大基因。用于抑菌测定的指示菌为本实验室分离保存的弧菌Lc-1601和杀香鱼假单胞菌Lc-1609，其他菌株详见表7。

表7实验所用菌株来源、宿主及地区

2.1.3复合菌群的配伍设计

采用分离自宁波市海洋与渔业研究院横马基地滩涂芦苇和土壤的粪产碱菌 NBPa-7和解淀粉芽孢杆菌NBLm-36于营养肉汤中培养20h，用麦氏比浊管测定菌浓度，调节菌浓度至10×10⁸CFU/mL，在250mL三角瓶中，按表8体积加入2个菌株，加入NB至100ml,培养菌按比例混合培养。

表8.复合菌群NBPa-7和NBLm-36的配伍比例

2.1.4复合菌群抗弧菌效果的测定

按表8接种挑取粪产碱菌NBPa-7和解淀粉芽孢杆菌NBLm-36，28℃振荡培养24h，取培养上清，4℃10,000rpm离心30min后，取30ul加至6mm滤纸片中；取表7中大黄鱼病原菌，28℃振荡培养24h后，取菌悬液制备菌平板，按KB法测定不同混合培养液上清的抑菌效果，记录抑菌圈大小。

根据复合菌培养物对不同病原菌的抑菌圈，计算有效抑菌率(EI)和综合抑菌指数(CII)，计算公式如下：

EI＝EIn/TIn×100

上式中：EI—有效抑菌率；EIn—有效抑菌病原菌数；TIn—测试病原菌数

上式中：CII—综合抑菌指数；——测定菌抑菌直径；n—测定菌数

2.1.5复合菌群投喂大黄鱼的安全性评价

同1.4振荡培养5组不同配伍的复合菌，取28℃培养24h复合菌液，用麦氏比浊管测定浓度，用生理盐水稀释至2.0×10⁹cfu/ml。腹腔注射或口灌当年大黄鱼(50±5g)0.15mL，使大黄鱼注射和口灌剂量为3.0×10⁸cfu/尾，对照组注射或口灌等体积生理盐水；每组25尾，试验鱼养殖于50L水簇箱中，实验水温为25℃，试验期间用气泵充气，按体重1％每日投喂大黄鱼颗粒饲料，每2d 按水体30％换过滤海水。共饲养观察3周，观察记录异常和死亡。

2.1.6复合菌群的防病效果

取28℃培养的24h不同配伍复合菌群组，麦氏比浊管测定浓度后，用生理盐水稀释至5.0×10⁹cfu/ml；取复合喷洒大黄鱼饲料，每10克饲料喷洒复合菌液 4mL，风扇吹干后备用。各试验组按体重5％每日投喂复合菌群混合的饲料，每组150尾；试验进行4周，试验第四周，随机取鱼3尾，取大黄鱼肠内容物，加入10倍体积生理盐水，加磁珠10和旋涡振荡器振荡5分钟，用灭菌生理盐水迅速稀释至10^-2-10^-4，取100μl涂布1％NaCl营养琼脂和TCBS平板，25℃培养48h，计数24和48h肠道弧菌量和异养菌数量。

2.1.7复合菌群投喂后大黄鱼主要免疫指标的测定

不同组合复合菌群投喂的大黄鱼试验组，试验结束后，随机取大黄鱼3尾，丁香酚麻醉，尾静脉(用Alsever氏抗凝)抽取尾静脉血，1500r/min离心，吸取血球沉淀表层富含淋巴细胞层，用磷酸缓冲液(PBS)重悬，洗涤2次后，用血球计数板计数，调整浓度至3×10⁵个/mL左右；吞噬试验采用1％福尔马林灭活、生理盐水洗涤垢金黄葡萄球菌(3×10⁵个/mL)，按10：1(菌体：淋巴细胞)加入混合，30℃水浴孵育30min，每隔5min轻轻振荡1次；吞噬结束后，将吞噬管1500r/min离心，取淋巴细胞沉淀，加入少量PBS重悬，于洁净玻片上进行血涂片，晾干后，用甲醇固定，瑞氏-姬姆萨染液染色，观察吞噬情况，计算吞噬率和吞噬指数。

同上抽取大黄鱼静脉血，制备血清，进行血清免疫指标测定。溶菌酶、超氧化物歧化酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶采用南京建成生物工程研究所试剂盒及操作说明书检测酶活力^[13]。

2.2实验结果

2.2.1复合菌群抗弧菌效果的测定

测定了混合培养A—E组上清对常见大黄鱼致病菌的抑菌效果，由表9可见：采用粪产碱菌NBPa-7和解淀粉芽孢杆菌NBLm-36以不同比例混合培养的上清，对不同病原有不同的抑菌能力。总体而言，粪产碱菌NBPa-7和解淀粉芽孢杆菌NBLm-36单独培养上清的抑菌率分别为40％和60％，而混合培养物的抑菌率可达100％，表明混合培养物达到了2个有益菌株抑菌效果的互补，提高了有效抑菌谱；计算各混合组的综合抑菌指数，以混合组C即2个菌以1：1 比例最好，综合抑菌指数达到0.716，其次为混合组B，混合组D虽然有效抑菌率达到100％，但总体来说，综合抑菌指数较低，混合组E抑菌谱达60％，但抑菌效价较低。

表9.不同配伍复合菌群培养物的抑菌效果和抑菌谱

2.2.2复合菌群投喂大黄鱼的安全性评价

5组不同配伍的复合菌，以0.15mL注射和口灌大黄鱼(3.0×10⁸cfu/尾)，记录3周的死亡率，同时对死亡鱼进行细菌分离，确定有无注射的复合菌体。由表10可见，复合菌A注射和口灌大黄鱼，3周死亡率分别为24％和20％；复合菌B、复合菌C、复合菌D和复合菌E的3周死亡率分别为20％和16％、16％和12％、16％和12％以及20％和12％，培养液对照组为20％和16％。由此可见，复合菌C和复合菌D的注射和口灌死亡率最低。

解剖注射和口灌3周后存活鱼，肝、脾、肾无明显病变；用1.5％NaCl营养琼脂分离脏器，未分离到粪产碱杆菌NBPa-7和解淀粉芽孢杆菌，表明不能在血液和内脏中定植。初步表明NBPa-7不会在大黄鱼体内增殖，引起病变和死亡。

表10.不同组复合菌注射和口灌大黄鱼的死亡情况

2.2.3复合菌群的防病效果

用不同配伍复合菌群组喷洒饲料投喂大黄鱼，取试验4周大黄鱼3尾，取肠内容物接种1％NaCl营养琼脂和TCBS平板，25℃培养48h。按48h计数异养细菌和弧菌总数。结果见图9。由图9可见，投喂不同组合复合菌的大黄鱼肠道异养细菌和弧菌数量比对照组有所下降。混合组A、混合组B、混合组C、混合组D、混合组E和对照组的异养菌和弧菌分别为1.55×10⁶/g和3.63×10⁵/g、 1.43×10⁶/g和3.27×10⁵/g、1.31×10⁶/g和2.77×10⁵/g、1.67×10⁶/g和4.43×10⁵/g以及1.82×10⁶/g和4.93×10⁵/g，对异养细菌的抑菌率范围为2.94％-27.71％，对弧菌的抑菌率范围为10.14％-43.91％。其中混合组B和混合组C效果抑菌效果最为明显是，对异养细菌和弧菌的抑菌率分别为21.10％和33.77％及27.71％和 43.91％；比较各组成活率，成活率高依次为混合组C(87.33％)、混合组C (86.00％)、混合组D(85.33％)、对照组(84.67％)、混合组E(83.33％)、混合组A(81.33％)。

表11.不同复合菌组投喂大黄鱼后的效果分析

注：1)抑菌率＝试验组细菌量/对照组细菌量×100％；2）每组试验鱼150尾

2.1.7复合菌群投喂大黄鱼主要免疫指标

用金黄葡萄球菌作为吞噬物测定不同组合复合菌群淋巴细胞的吞噬率和吞噬指数，结果表明，不同组合的复合菌，可增强大黄鱼的吞噬率和吞噬指数，其中混合组C和B的增强作用最强，增强率分别为32.97％和41.13％，混合组 E对吞噬表现为轻微的抑制作用。测定不同组合复合菌群对大黄鱼血清主要免疫指标的影响，可见不同复合菌组对大黄鱼溶菌酶、超氧化物歧化酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶均有不同程度的促进作用，其中混合组B和混合组C的促进作用最为明显，对溶菌酶、超氧化物歧化酶的促进率分别达32.97％和10.57％及41.13％和13.86％。

表12.不同复合菌组对大黄鱼吞噬的影响

表13.不同复合菌组对大黄鱼血清主要免疫指标的影响

实施例3

本发明的实施例中所使用大黄鱼饲料的配制

饲料1

将(1)～(5)用混合器混合均匀后，使用孔径为5mm的制粒机，出来的长条状被切成5～15mm长度，制成颗粒状鱼饲料。以上材料均为市贩的水产养殖用饲料原料。为了测量制成后的饲料颗粒中，所添加菌液中菌的含量，上述市贩原料购入后均使用高温灭菌法消毒后使用。

同样方法还制成以下饲料2-5。

饲料2

上述饲料制成后，取1g溶解于9ml无菌水中，溶解后进一步用无菌水稀释 100倍，充分混匀后取0.1ml涂布于标准平板培养基上，35℃培养45小时候，计数克隆数，取2个培养皿的平均值作为最终结果，得到饲料2中粪产碱菌 1.9×10⁸cfu/g。作为对比，饲料1中的菌落克隆数接近100cfu/g以下。

饲料3

根据上述方法，得到饲料3中的解淀粉芽孢杆菌含量约为2.5×10⁸cfu/g。

饲料4

饲料5

上述芦苇是通过饲料采收粉碎一体机，将上述试验区域芦苇收割粉碎后，自然晾干并储藏，使用前进行高温灭菌。

实施例4

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种人和海洋动物共患病原菌，在本实施例中，使用溶藻弧菌经口感染大黄鱼，然后饲喂实施例2中制备的饲料，来评价各种不同饲料的抗病效果。大黄鱼投喂添加了不同添加剂饲料的实验在宁波市海洋与渔业研究院横马基地所属的海区进行。实验期间海区水温为12-20℃，盐度为27-29，溶解氧含量在7mg/dm³以上。实验用鱼置于海水养殖网箱中暂养2周后，挑选健康同规格的大黄鱼48±2g，随机分组，置于10个网箱中，上述饲料各对应2个网箱，每个网箱饲喂100尾大黄鱼。每天饱食投喂1次(下午5时)，每天记录投喂量和死亡数，养殖4周。

表14被溶藻弧菌感染后的大黄鱼的死亡尾数

实施例5

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，是大黄鱼的主要病原菌之一。本实施例中，使用杀香鱼假单胞菌经口感染大黄鱼，然后饲喂实施例2中制备的饲料，来评价各种不同饲料的抗病效果。具体方法和试验条件均与实施例3 相同。

表15被杀香鱼假单胞菌感染后的大黄鱼的死亡尾数

实施例6

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，又称为肠炎弧菌，是一种常见的病原菌。副溶血弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，主要栖息地在海水中。本实施例中，使用副溶血弧菌经口感染大黄鱼，然后饲喂实施例2中制备的饲料，来评价各种不同饲料的抗病效果。具体方法和试验条件均与实施例3相同。

表16被副溶血弧菌感染后的大黄鱼的死亡尾数

本发明对宁波市海洋与渔业研究院横马基地养殖池周边滩涂芦苇进行了采集和芦苇内生细菌，以大黄鱼分离的溶藻弧菌及杀香鱼假单胞菌等2个重要病原菌为指示菌，从3个样点的芦苇中获得对溶藻弧菌及杀香鱼假单胞菌有抑菌作用的菌株7株，经纯化和活性测定，获得对溶藻弧菌及杀香鱼假单胞菌均有较高抑菌活性的拮抗菌株NBPa-7。通过NBPa-7菌落和菌体形态、生理生化鉴定及16SrDNF序列测定和系统发育树分析，表明NBPa-7菌株与粪产碱菌(A. faecalis)同源性高达99％，确定NBPa-7株是粪产碱菌(A.faecalis)成员。

用纸片法和最小抑菌浓度测定了NBPa-7对溶藻弧菌等7种大黄鱼来源病原菌的抑菌特性，表明NBPa-7对溶藻弧菌和杀香鱼假单胞菌均有较好抑菌效果，抑菌直径为23.2mm和11.6-12.0mm；NBPa-7对杀香鱼假单胞菌的MIC为 1/32，对溶藻弧菌的MIC为1/4；对创伤弧菌、哈维弧菌和嗜水气单胞菌未表现出相关抑菌活性。NBPa-7菌液口灌大黄鱼后黄鱼肠道弧菌和异养细菌总量比对照组降低6.04％和17.07％，表明NBPa-7在大黄鱼体内有良好的拮抗病原菌能力；NBPa-7以1×10⁸cfu/只注射3周龄小鼠和口灌5日龄乳鼠，72h内未发生异常、发病和死亡，实验小鼠内脏未见异常，实验鼠未出现白细胞升高；NBPa-7 以3×10⁸cfu/尾注射和口灌大黄鱼，2周内未出现发病死亡，大黄鱼内脏未发生病变，白细胞未出现明显高现象。表明NBPa-7小鼠和大黄鱼无致病性，注射和口灌都不引起疾病，有较好的安全性。

随着养殖大黄鱼病害日益增多，通过拮抗菌分离来寻找更好的环境友好性防控方式日益受到研究者们的重视，已经开展了大黄鱼肠道弧菌和哈维弧菌拮抗菌的筛选和肠道功能改善上的应用。本发明首次对大黄鱼养殖区域滩涂芦苇这一多年水生或湿生的高大禾草，从中分离到对大黄鱼致病菌溶藻弧菌和杀香鱼假单胞菌均有较好作用的粪产碱菌，并评价了分离菌株对大黄鱼肠道弧菌的降低作用和对大黄鱼和小鼠的安全性，本发明为今后大黄鱼病原拮抗菌开辟了新的来源，将具有良好的工业价值。