一种快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法与流程

本发明涉及菌株分离方法，尤其涉及一种快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法。

背景技术：

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)的致病菌的体外培养非常困难，尽管在1944年就发现，但是一直到1980年Davis才成功分离培养。我国有关RSD病原菌分离培养的报道较少，2008年陈健文等利用改良的SC培养基,从甘蔗蔗汁中分离培养到一种杆状细菌,根据菌落的形态特征,并结合血清学和PCR检测方法,确认所分离到的菌是甘蔗宿根矮化病的致病菌Lxx；2015年张小秋等利用改良的MSC培养基成功分离Lxx，同年王丽也成功分离了RSD病原菌。

目前仍然还有很多实验室没有办法重复分离Lxx，主要原因是该菌本身生长特别缓慢，往往需要4周左右的时间才能在培养皿上观察到菌落，由于培养时候长，一旦有杂菌产生，分离就失败，所以控制污染是Lxx菌分离培养的关键环节，相对于其它细菌来说这种分离培养的可重复性较差。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不需要昂贵的仪器设备、污染率低的快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，包括如下步骤：

纳米磁珠的制备：取FeSO4和FeCl3混合倒入三口烧瓶置于恒温加热磁力搅拌器上，在充氮气的条件下搅拌到溶解，调pH值至为8-10，溶液立即变为黑色，继续反应，制得磁性纳米颗粒；置于磁场中弃上清液后，用去离子水洗涤后干燥；

纳米磁珠的氨基化：取上述所得磁性纳米颗粒，溶解在无水乙醇中，超声波处理至完全分散，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，调节pH值为10-12，在水浴中搅拌反应过夜；结束后用去离子水反覆洗涤后冷冻干燥，得到氨基化的Fe3O4纳米粒子；

氨基化纳米磁珠活化：取上述所得氨基化的Fe3O4纳米粒子溶于PBS，超声得到分散性好的磁珠溶液，加入戊二醛，于室温下搅拌反应；再PBS洗涤后用磁石收集，定容，得到活化后的氨基化纳米磁珠；

Lxx免疫磁珠的制备：将Lxx多克隆抗体加入到上述所得活化后的氨基化纳米磁珠中后搅拌，再用PBS洗涤后用磁石收集得到Lxx免疫磁珠；

Lxx的分离：将过滤后的蔗汁加入到所得Lxx免疫磁珠中混匀后孵育，低速离心弃上清，用PBS缓冲液清洗后获得Lxx的分离物。

进一步，所述纳米磁珠的制备步骤中，FeSO4和FeCl3的摩尔比为2：(2-6)；优选的，FeSO4和FeCl3的摩尔比为2:3。

任选的，调节pH值时的温度为70-80℃；优选的，温度为75℃；

任选的，继续反应30min；

任选的，用去离子水洗涤三次后干燥。

进一步，所述纳米磁珠的氨基化步骤中，所述磁性纳米颗粒：无水乙醇：3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为(40-60)mg：(80-120)mL：(5-8)mL；优选的，磁性纳米颗粒：无水乙醇：3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为50mg：100mL：6mL；

任选的，用氨水调节pH值为10-12；优选的，用氨水调节pH值为11；

任选的，水浴的温度为50-70℃；优选的，水浴的温度为60℃。

进一步，所述氨基化纳米磁珠活化步骤中，所述氨基化的Fe3O4纳米粒子：PBS：25％戊二醛的用量比为(8-15)mg：(8-15)mL：(2-3)mL；优选的，氨基化的Fe3O4纳米粒子：PBS：25％戊二醛的用量比为10mg：10mL：2.5mL；其中PBS的浓度为0.01M，pH值为7.4；

任选的，搅拌反应的时间为6h；

任选的，洗涤的次数为3次。

进一步，所述Lxx免疫磁珠的制备步骤中，所述Lxx多克隆抗体的制备方法为：

Lxx抗原制备：将过滤后的蔗汁涂布于含有萘啶酸的新鲜MSC培养基，暗培养，30-50天后观察并挑取菌落；

Lxx抗体制备：利用上述挑取的菌落加入0.4％的甲醛灭活，加入弗氏佐剂，直接注射兔子，两周打一次，共免疫4次，二个月后抽取血清采用Protein A-Sepharose 4B作亲和层析介质纯化得到抗体；

优选的，所述过滤后的蔗汁为切取甘蔗茎基部，进行表面清洗灭菌后放入超净台中晾干；将蔗茎切成适合大小用镊子挤汁，4000r/min，离心10min后收集蔗汁，用普通滤纸进行初步过滤后再用0.45μm细菌过滤器进行过滤。

进一步，所述Lxx免疫磁珠的制备步骤中，所述萘啶酸的浓度为5-15μg/ml；优选的，所述萘啶酸的浓度为10μg/ml；

任选的，暗培养的温度为26-30℃，培养的时间为35-45天。

进一步，所述Lxx免疫磁珠的制备步骤中，所述Lxx多克隆抗体与活化后的氨基化纳米磁珠的用量为(5-15)ml；优选的，Lxx多克隆抗体与活化后的氨基化纳米磁珠的用量为5μmol：10ml；

任选的，所述搅拌的条件为37℃下搅拌3h；

任选的，所述洗涤的次数为3次。

进一步，所述Lxx的分离步骤中，所述蔗汁为将蔗茎切成适合大小用镊子挤汁，4000r/min，离心10min后收集得到；

任选的，所述过滤采用普通滤纸进行初步过滤后再用0.45μm细菌过滤器进行过滤；

任选的，所述过滤后的蔗汁：Lxx免疫磁珠用量为1：(30-50)；优选的，过滤后的蔗汁：Lxx免疫磁珠用量为1：40；

任选的，所述孵育的条件为37℃孵育1h；

任选的，所述低速离心的转速为2000-5000rpm；

任选的，所述PBS洗涤的次数为2-3次。

免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic separation,IMS)是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学检测和分离技术。它是以抗体包被的磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原——抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生了定向移动，从而达到分离抗原的目的。

本发明中制备Lxx免疫磁珠在甘蔗宿根矮化病菌分离上，与传统的分离培养方法相比具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不需要昂贵的仪器设备、污染率低等优点，更重要的是可在不改变细菌状态下快速将Lxx病原菌从甘蔗中分离出来，用于研究在当下状态下细菌的转录组和代谢组，解决了细菌与病原菌互作过程中无法快速获得大量病原菌的问题。

附图说明

图1是TEM观察Fe304磁性粒子结构图。

图2是Lxx免疫磁珠电镜观察结果图。

图3是Lxx分离物电镜观察结果图。

图4是Lxx分离物电镜观察结果图。

图5是Lxx分离物PCR结果电泳图。

图6是RSD感病甘蔗植株分离菌的菌落和菌体形态图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一种快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，包括如下步骤：

纳米磁珠的制备：取FeSO4和FeCl3混合倒入三口烧瓶置于恒温加热磁力搅拌器上，在充氮气的条件下搅拌到溶解，调pH值至为8-10，溶液立即变为黑色，继续反应，制得磁性纳米颗粒；置于磁场中弃上清液后，用去离子水洗涤后干燥；

纳米磁珠的氨基化：取上述所得磁性纳米颗粒，溶解在无水乙醇中，超声波处理至完全分散，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，调节pH值为10-12，在水浴中搅拌反应过夜；结束后用去离子水反覆洗涤后冷冻干燥，得到氨基化的Fe3O4纳米粒子；

氨基化纳米磁珠活化：取上述所得氨基化的Fe3O4纳米粒子溶于PBS，超声得到分散性好的磁珠溶液，加入戊二醛，于室温下搅拌反应；再PBS洗涤后用磁石收集，定容，得到活化后的氨基化纳米磁珠；

Lxx免疫磁珠的制备：将Lxx多克隆抗体加入到上述所得活化后的氨基化纳米磁珠中后搅拌，再用PBS洗涤后用磁石收集得到Lxx免疫磁珠；

Lxx的分离：将过滤后的蔗汁加入到所得Lxx免疫磁珠中混匀后孵育，低速离心弃上清，用PBS缓冲液清洗后获得Lxx的分离物。

进一步，所述纳米磁珠的制备步骤中，FeSO4和FeCl3的摩尔比为2：(2-6)；优选的，FeSO4和FeCl3的摩尔比为2:3。

任选的，调节pH值时的温度为70-80℃；优选的，温度为75℃；

任选的，继续反应30min；

任选的，用去离子水洗涤三次后干燥。

进一步，所述纳米磁珠的氨基化步骤中，所述磁性纳米颗粒：无水乙醇：3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为(40-60)mg：(80-120)mL：(5-8)mL；优选的，磁性纳米颗粒：无水乙醇：3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为50mg：100mL：6mL；

任选的，用氨水调节pH值为10-12；优选的，用氨水调节pH值为11；

任选的，水浴的温度为50-70℃；优选的，水浴的温度为60℃。

进一步，所述氨基化纳米磁珠活化步骤中，所述氨基化的Fe3O4纳米粒子：PBS：25％戊二醛的用量比为(8-15)mg：(8-15)mL：(2-3)mL；优选的，氨基化的Fe3O4纳米粒子：PBS：25％戊二醛的用量比为10mg：10mL：2.5mL；其中PBS的浓度为0.01M，pH值为7.4；

任选的，搅拌反应的时间为6h；

任选的，洗涤的次数为3次。

进一步，所述Lxx免疫磁珠的制备步骤中，所述Lxx多克隆抗体的制备方法为：

Lxx抗原制备：将过滤后的蔗汁涂布于含有萘啶酸的新鲜MSC培养基，暗培养，30-50天后观察并挑取菌落；

Lxx抗体制备：利用上述挑取的菌落加入0.4％的甲醛灭活，加入弗氏佐剂，直接注射兔子，两周打一次，共免疫4次，二个月后抽取血清采用Protein A-Sepharose 4B作亲和层析介质纯化得到抗体；

优选的，所述过滤后的蔗汁为切取甘蔗茎基部，进行表面清洗灭菌后放入超净台中晾干；将蔗茎切成适合大小用镊子挤汁，4000r/min，离心10min后收集蔗汁，用普通滤纸进行初步过滤后再用0.45μm细菌过滤器进行过滤。

进一步，所述Lxx免疫磁珠的制备步骤中，所述萘啶酸的浓度为5-15μg/ml；优选的，所述萘啶酸的浓度为10μg/ml；

任选的，暗培养的温度为26-30℃，培养的时间为35-45天。

进一步，所述Lxx免疫磁珠的制备步骤中，所述Lxx多克隆抗体与活化后的氨基化纳米磁珠的用量为(5-15)ml；优选的，Lxx多克隆抗体与活化后的氨基化纳米磁珠的用量为5μmol：10ml；5μmol：10ml；

任选的，所述搅拌的条件为37℃下搅拌3h；

任选的，所述洗涤的次数为3次。

进一步，所述Lxx的分离步骤中，所述蔗汁为将蔗茎切成适合大小用镊子挤汁，4000r/min，离心10min后收集得到；

任选的，所述过滤采用普通滤纸进行初步过滤后再用0.45μm细菌过滤器进行过滤；

任选的，所述过滤后的蔗汁：Lxx免疫磁珠用量为1：(30-50)；优选的，过滤后的蔗汁：Lxx免疫磁珠用量为1：40；

任选的，所述孵育的条件为37℃孵育1h；

任选的，所述低速离心的转速为2000-5000rpm；

任选的，所述PBS洗涤的次数为2-3次。

实施例1：Lxx的快速分离

纳米磁珠的制备：取10mL 0.25mol/L FeSO4和15ml 0.25mol/L FeCl3混合倒入三口烧瓶置于恒温加热磁力搅拌器上，在充氮所的条件下搅拌到溶解，温度设为75℃，加入NaOH调节pH值至9，溶液立即变为黑色，继续反应30min，制得磁性纳米颗粒。置于磁场中弃上清液后，用去离子水洗涤三次后干燥。

纳米磁珠的氨基化：取50mg纳米颗粒，溶解在100mL无水乙醇中，超声波处理至完全分散，加入6mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，用氨水调节pH值至11，在60水浴中搅拌反应过夜。结束后用去离子水反覆洗涤，取10mL合成的磁性Fe304悬浮液于干燥的表面皿中烘干至恒重，烘干后的质量为0.095g，磁珠的浓度为9.5mg/mL。后冷冻干燥。通过TEM观察Fe304磁性粒子(见附图1)，从图中可以看出，纳米级Fe304磁性微粒的平均粒径在125―268nm之间，球体表面均匀，有较好的形貌，分散性良好。

氨基化纳米磁珠活化：10mg氨基化的Fe3O4纳米粒子溶于10mL 0.01M PH 7.4PBS，超声得到分散性好的磁珠溶液，加入2.5mL 25％戊二醛，于室温下搅拌反应6h。PBS洗涤三次后用磁石收集，定容至10mL。

Lxx免疫磁珠的制备：加入5μmol自制的Lxx多克隆抗体于37℃下搅拌3h，PBS洗涤3次后用磁石收集于4℃保存。Lxx免疫磁珠电镜观察结果(见图2)，从图中可以看出，与磁性Fe304粒子一致，无杂质粘连，也无贴壁现象。

其中Lxx多克隆抗体的制备方法为：

1)Lxx抗原制备：切取甘蔗茎基部，进行表面清洗灭菌后放入超净台中晾干；将蔗茎切成适合大小用镊子挤汁，4000r/min，离心10min后收集蔗汁，用普通滤纸进行初步过滤后再用0.45μm细菌过滤器进行过滤。将过滤后的蔗汁涂布于含有(5-15μg/ml；优选10μg/ml)的萘啶酸的新鲜MSC培养基，26-30℃，培养的时间为暗培养，30-50天后观察并挑取菌落；

2)Lxx抗体制备：利用上述挑取的菌落加入0.4％的甲醛灭活，加入弗氏佐剂，直接注射兔子，两周打一次，共免疫4次，二个月后抽取血清采用Protein A-Sepharose 4B作亲和层析介质纯化得到抗体。

Lxx的分离：将蔗茎切成适合大小用镊子挤汁，4000r/min，离心10min后收集蔗汁，用普通滤纸进行初步过滤后再用0.45μm细菌过滤器进行过滤，按照1μL过滤后的蔗汁加入40μL Lxx免疫磁珠的量加入Lxx免疫磁珠后混均，37℃孵育1h，低速离心后弃上清，用PBS缓冲液清洗2次，获得Lxx的分离物。

Lxx分离物电镜观察：结果见图3和图4，从图3-4可以看出，免疫磁珠吸附在Lxx菌体表面，菌越密集，相应的吸附在菌体表面的免疫磁珠也越多。

Lxx分离物PCR验证。PCR引物用Pan等报道的Lxx 16S～23S r DNA内部转录间隔区(ITS)特异引物，产物439bp。

Lxx1：5’-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3’、SEQ ID NO:1；

Lxx2：5’-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3’，SEQ ID NO:2；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

PCR反应体系：rTaq 0.25μL，dNTP 1μL，10×PCR buffer(Mg2+)2μL，正向引物Lxx1 1μL，反向引物Lxx2 1μL，ddH2O 13.75μL。正、反向引物的浓度均为10uM/L。

PCR扩增程序为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，40个循环；72℃延伸5min。

PCR结果电泳图见图5，从图5可以看出，显示分离物能扩增出与正对照一致的目的条带，确定本实验所获得的分离物为Lxx。其中泳道M:DNA标准参照物；泳道1：免疫磁珠-Lxx混合物；泳道P:阳性对照；泳道N:阴性对照。

实施例2：Lxx的快速分离

纳米磁珠的制备：取10mL 0.25mol/LFeSO4和10ml 0.25mol/L FeCl3混合倒入三口烧瓶置于恒温加热磁力搅拌器上，在充氮所的条件下搅拌到溶解，温度设为70℃，加入NaOH调节pH值至9，溶液立即变为黑色，继续反应30min，制得磁性纳米颗粒。置于磁场中弃上清液后，用去离子水洗涤三次后干燥。

纳米磁珠的氨基化：取40mg纳米颗粒，溶解在80mL无水乙醇中，超声波处理至完全分散，加入5mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，用氨水调节pH值至10，在60水浴中搅拌反应过夜。结束后用去离子水反覆洗涤，取10mL合成的磁性Fe304悬浮液于干燥的表面皿中烘干至恒重，烘干后的质量为0.095g，磁珠的浓度为9.5mg/mL。后冷冻干燥。通过TEM观察Fe304磁性粒子(见附图1)，从图中可以看出，纳米级Fe304磁性微粒的平均粒径在125―268nm之间，球体表面均匀，有较好的形貌，分散性良好。

氨基化纳米磁珠活化：8mg氨基化的Fe3O4纳米粒子溶于8mL 0.01M PH 7.4PBS，超声得到分散性好的磁珠溶液，加入2mL 25％戊二醛，于室温下搅拌反应6h。PBS洗涤三次后用磁石收集，定容至10mL。

Lxx免疫磁珠的制备：加入10μmol自制的Lxx多克隆抗体(方法同实施例1)于37℃下搅拌3h，PBS洗涤3次后用磁石收集于4℃保存。Lxx免疫磁珠电镜观察结果(见图2)，从图中可以看出，与磁性Fe304粒子一致，无杂质粘连，也无贴壁现象。

以下步骤同实施例1，结果同实施例1。

实施例3：Lxx的快速分离

纳米磁珠的制备：取10mL 0.25mol/LFeSO4和30ml 0.25mol/L FeCl3混合倒入三口烧瓶置于恒温加热磁力搅拌器上，在充氮所的条件下搅拌到溶解，温度设为80℃，加入NaOH调节pH值至9，溶液立即变为黑色，继续反应30min，制得磁性纳米颗粒。置于磁场中弃上清液后，用去离子水洗涤三次后干燥。

纳米磁珠的氨基化：取60mg纳米颗粒，溶解在120mL无水乙醇中，超声波处理至完全分散，加入8mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，用氨水调节pH值至12，在60水浴中搅拌反应过夜。结束后用去离子水反覆洗涤，取10mL合成的磁性Fe304悬浮液于干燥的表面皿中烘干至恒重，烘干后的质量为0.095g，磁珠的浓度为9.5mg/mL。后冷冻干燥。通过TEM观察Fe304磁性粒子(见附图1)，从图中可以看出，纳米级Fe304磁性微粒的平均粒径在125―268nm之间，球体表面均匀，有较好的形貌，分散性良好。

氨基化纳米磁珠活化：15mg氨基化的Fe3O4纳米粒子溶于15mL 0.01M PH 7.4PBS，超声得到分散性好的磁珠溶液，加入3mL 25％戊二醛，于室温下搅拌反应6h。PBS洗涤三次后用磁石收集，定容至10mL。

Lxx免疫磁珠的制备：加入7.5μmol自制的Lxx多克隆抗体(同实施例1)于37℃下搅拌3h，PBS洗涤3次后用磁石收集于4℃保存。Lxx免疫磁珠电镜观察结果(见图2)，从图中可以看出，与磁性Fe304粒子一致，无杂质粘连，也无贴壁现象。

以下步骤同实施例1，结果同实施例1。

实施例4：Lxx的分离培养

Lxx的分离：将蔗茎切成适合大小用镊子挤汁，4000r/min，离心10min后收集蔗汁，用普通滤纸进行初步过滤后再用0.45μm细菌过滤器进行过滤，加入40μL Lxx免疫磁珠混均，37℃孵育1h，低速离心后弃上清，用PBS缓冲液清洗2次，用φ0.45μm滤膜过滤获得Lxx的分离物。

Lxx的培养：将上述分离物接种到MSC培养基上，等液体完全被吸收后，用封口膜把培养基封口，倒置于28℃的恒温培养箱中进行培养，40天后进行观察。MSC培养基的配方如表1：

表1 MSC培养基的配方表

病原菌Lxx的形态学鉴定：对分离物进行电镜负染检测，吸取10μL菌液滴到带膜的铜网正面，静置1min，用滤纸从边缘将菌液吸走，将铜网在室温晾干，经1％磷钨酸染色2～5min，随后用滤纸从边缘将磷钨酸吸走，室温晾干后置于透射电镜下观察。

结果如下：RSD的病原菌分离、培养比较困难，在28℃恒温培养箱中培养3周后，长出肉眼可见的无色、圆形、点状大小、边缘整齐中间隆起的菌落，直径约为0.2mm(图1和图6的A)。此后再让其继续生长，菌落颜色不再变化，菌落形状由原来的中间凸起变得逐渐扁平。在电镜下，病原菌呈细长棍棒状，有的中部或一端膨大，内有间体，菌体大小约为0.25μm×2μm(图1和图6的B)，与其他研究文献描述的较为一致，据此可进一步推断该菌为甘蔗RSD的病原菌Lxx。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。