本发明涉及一种芡实种仁多糖及其分离提取方法和用途，属于天然产物提取和生物活性领域。
背景技术：
ⅱ型糖尿病(t2dm)是一种以高血糖为特征的糖代谢紊乱的疾病。近年来糖尿病患病率迅猛增长，据统计2010年中国糖尿病患病率已高达9.7％，患者人数达到了9240万，预计到2030年将增至1.29亿。因此，t2dm的防治已经成为影响中国公民健康的重要问题之一。糖尿病的主要发病机制是由于胰岛功能缺失或受损引起，既有遗传因素也有环境因素包括后天饮食、作息习惯、肥胖等影响引起胰岛素分泌不足，常常伴有胰岛素抵抗现象发生。
芡实(eureyaleferoxsalisb)是睡莲科(nymphaeaceae)芡属(euryale)一年生水生草本植物。野生芡实全国各地分布比较广，人工栽培主要以江苏、浙江和安徽等省为主。芡实成熟种仁含有丰富的基本营养成分，有碳水化合物、蛋白质、矿物质和维生素等，功效成分主要有黄酮类、环肽类、酚类、多糖、甾醇类和脑苷脂等成分。传统中医学上，芡实的成熟种仁具有益肾固精，有健脾利湿作用，常用于治疗遗精遗尿，脾虚久泄，白浊带下。文献调研发现，芡实粗提取物主要有抗氧化、抗心肌缺血、抗衰老、降血糖、降血压及抑菌、保护胃粘膜等作用。然而关于芡实多糖的研究还比较少，只有抗氧化活性方面的报道，目前尚未有芡实种仁多糖结构鉴定及降糖方面的活性报道。
技术实现要素：
本发明提供了一种芡实种仁多糖及其分离提取方法和用途。本发明芡实种仁多糖可以促进胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取量，天然无毒，具有研发降血糖保健食品和药物的应用前景。
本发明芡实种仁多糖，分子量为8.75ⅹ103da，单糖组成及摩尔比为葡萄糖醛酸：甘露糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.55：0.6：52.7：1：4.3。本发明芡实种仁多糖的分离提取方法，包括如下步骤：
步骤1：分离提取
将成熟的芡实种仁粉碎成粉末，加入3-5倍体积的蒸馏水超声提取5min，然后于60℃水浴2h，四层纱布过滤，收集上清液，向滤渣中加入蒸馏水重复上述提取过程再次提取，合并上清液；将所得上清液旋蒸浓缩，然后加入四倍体积的无水乙醇4℃下静置沉淀，离心收集沉淀，加水溶解沉淀即得粗多糖水溶液；加水量使沉淀刚好完全溶解即可。
步骤2：sevag法脱蛋白
将步骤1获得的粗多糖水溶液、三氯甲烷和正丁醇按照体积比5：4：1的比例混合，磁力搅拌2-3h，离心后收集上清液；重复上述处理步骤直至蛋白质完全去除，获得脱蛋白芡实种仁多糖溶液；
步骤3：透析除杂
将步骤2获得的脱蛋白芡实种仁多糖溶液旋蒸浓缩除去有机试剂，使用3500kda的透析袋，流水透析48h，蒸馏水透析24h，再次旋蒸浓缩至浓稠状液体，真空冷冻干燥，即得芡实种仁粗多糖；
步骤4：纯化
将步骤3获得的芡实种仁粗多糖通过superdextm75葡聚糖凝胶柱洗脱分离，以蒸馏水为洗脱液，使用高效液相色谱跟踪检测分离效果，收集保留时间相同的多糖，浓缩冻干后即得芡实种仁纯多糖。
本发明获得的芡实种仁纯多糖的分子量为8.75ⅹ103da(图1和图2)，是一种中性多糖，单糖组成(图3和图4)，其单糖组成及摩尔比为葡萄糖醛酸：甘露糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.55：0.6：52.7：1：4.3。红外光谱图显示芡实种仁多糖含有β构型，存在吡喃环，有多糖的五个典型特征峰，如图5。
本发明芡实种仁多糖的的用途，是在制备降血糖保健品或药品中的应用。
本发明以胰岛素抵抗细胞模型为研究对象，研究无毒副作用的芡实种仁多糖的降血糖降血脂效果。
芡实种仁多糖对胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取的影响实验：
3t3-l1前脂肪细胞诱导分化成熟，使用1μmol/l的地塞米松诱导48h建立胰岛素抵抗模型后，以不同浓度的芡实种仁纯多糖处理24h，使用葡萄糖检测试剂盒检测细胞上清液中的葡萄糖含量。hepg2细胞也使用同样方法处理。实验结果从图6和图7可知，芡实种仁多糖可以促进胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗量，改善胰岛素抵抗，具有研制治疗糖尿病药物和保健食品的应用前景。
附图说明
图1是葡聚糖标准曲线。
图2是芡实种仁多糖高效液相色谱图。
图3是标准单糖高效液相色谱图(*-溶剂峰，1-葡萄糖醛酸，2-甘露糖，3-葡萄糖，4-半乳糖，5-阿拉伯糖)。
图4是芡实种仁多糖单糖组成高效液相色谱图(*-溶剂峰，1-葡萄糖醛酸，2-甘露糖，3-葡萄糖，4-半乳糖，5-阿拉伯糖)。
图5是芡实种仁多糖红外光谱图。
图6是芡实种仁多糖对胰岛素抵抗3t3-l1脂肪细胞葡萄糖消耗率的影响，与模型组比较具有显著性差异(*<0.05,**p<0.01，##<0.01)。
图7是芡实种仁多糖对胰岛素抵抗hepg2细胞葡萄糖消耗率的影响，与模型组比较具有显著性差异(*<0.05,**p<0.01，##<0.01)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例描述本发明的制备，结构表征及降糖降脂活性，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。
实施例1：芡实种仁多糖的提取和分离纯化
1、分离提取
将成熟的芡实种仁清洗，烘干，粉碎并过40目筛。称取500g芡实种仁粉末，加入2l蒸馏水，搅拌均匀后超声提取5分钟，然后置于60℃水浴锅中水浴，每30min搅拌一次，2h后使用四层纱布过滤，收集上清液，向滤渣中加入2l蒸馏水，重复上述提取过程再次提取，合并上清液；将得到的上清液离心(4000rpm/min，10min)，弃沉淀，收集上清液，旋蒸浓缩至150ml，加入4倍体积的无水乙醇在4℃冰箱过夜沉淀，离心(4500rpm/min，10min)，收集沉淀，并用尽量少的蒸馏水溶解，再次离心(4500rpm/min，10min)，除去水不溶性物质，即得到粗多糖水溶液。
2、sevag法脱蛋白
将步骤1获得的粗多糖水溶液、三氯甲烷和正丁醇按照体积比为5：4：1的比例混合，磁力搅拌2-3h，离心(7500rpm/min，10min)，收集上清液；重复上述处理步骤直至蛋白质完全去除，获得脱蛋白芡实种仁多糖溶液。
3、透析除杂
将步骤2获得的脱蛋白芡实种仁多糖溶液旋蒸浓缩除去有机试剂，然后装入截留分子量为3500da的透析袋中，流动自来水中透析48h，然后在蒸馏水中磁力搅拌透析24h，每4小时换一次蒸馏水，透析完成后取出，旋蒸浓缩至最浓体积，真空冷冻干燥48h，即得芡实粗多糖。
4、纯化
superdextm75葡聚糖凝胶装柱体积为800mm*30mm的柱子，防止有气泡，恒流泵流速为1ml/mim。将步骤3获得的芡实粗多糖用蒸馏水配制成3ml、浓度为50mg/ml的溶液，0.22μm的水相滤头过滤，上样，蒸馏水洗脱，流速为0.68ml/min；3h后，开始收集洗脱液，每管4ml。硫酸苯酚法跟踪检测糖含量，一直收集到不能检测到糖为止。收集的洗脱液，每隔5管，用高效液相色谱检测分离效果，收集保留时间相同的多糖，浓缩冻干后即得芡实种仁纯多糖。使用的色谱柱为ultrahydrogeltm250，规格为7.8*300mm。
实施例2：芡实种仁多糖的结构表征
1、分子量测定
分别精确配制1mg/ml的芡实种仁多糖efsp-1、t3、t7、t10、t50的溶液1ml，并用0.22μm的微孔过滤膜过滤制样。利用高效液相色谱法检测其出峰时间，上样量为30μl。根据标准品葡聚糖的出峰时间，得出分子量计算公式，并计算芡实种仁多糖的分子量。
2、单糖组成测定
芡实种仁多糖的单糖组成分析采用酸水解-柱前pmp衍生化方法处理样品，再用高效液相色谱法测定。精确称取芡实种仁多糖(10mg)溶于5ml的2mol/l的三氟乙酸(tfa)中，充氮气封管，在110℃油锅水解6h。再用旋转蒸发仪反复旋干，加适量的去离子水，再旋干，如此反复几次直到溶液ph显示中性为止。加入1ml蒸馏水，备用。
标准单糖和已水解的样品溶液中加入50μl，0.5mpmp甲醇溶液和50μl、0.3mnaoh溶液，在70℃的水浴锅中反应30min进行pmp柱前衍生化，然后用50μl的0.3m的hcl中和至中性。所得产物使用高效液相色谱检测，选用dad检测器。hplc柱温为30℃，色谱柱为zorboxeclipsexdb-c18柱(4.6mmⅹ250mm,5μm)，在波长为254nm条件下检测。检测流动相选用两种，流动相a为乙酸铵缓冲溶液(200mmol/l)，流动相b为乙腈。时间梯度洗脱0-30min，初始设置为流动相a：流动相b＝86％：14％，最终洗脱到比例为流动相a：流动相b＝74％：26％，进样量为10μl。
3、红外光谱分析
芡实种仁多糖的红外光谱结构进行分析采用溴化钾压片法，压成薄片，在4000～400cm-1的频率范围内进行测定。称取1mg的芡实种仁多糖，与100mgkbr(1:100)研磨均匀后检测。实验结果：
芡实种仁多糖分子量为8.75ⅹ103da，共有五种单糖，分别为葡萄糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖,主要以葡萄糖为主，葡萄糖醛酸、甘露糖含量很少。各种单糖摩尔比为葡萄糖醛酸：甘露糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.55：0.6：52.7：1：4.3。
芡实种仁多糖红外光谱具有五个典型吸收峰，分别是3404cm-1、2921cm-1、1642cm-1、1412cm-1和1032cm-1的位置。在3404cm-1处出现的强而宽的峰是因为醇羟基(o-h)伸缩震动引起的，因存在分子间氢键而出现宽锋；在2921cm-1处出现的中尖峰是饱和烷烃震动区域内，是由c-h伸缩震动产生的。在1642cm-1处的中峰是由o-h的弯曲震动引起的，在1412cm-1处的中峰是由-ch2的变形震动引起的吸收峰。红外光谱看到出现三个峰分别为1153cm-1、1080cm-1和1032cm-1，所以认为存在吡喃环。在900cm-1处出现弱的吸收峰认为此多糖为β构型。
实施例3：芡实种仁多糖的降血糖活性测定
1、芡实种仁多糖对胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗量的影响
3t3-l1脂肪细胞和hepg2细胞使用1μmol/l的地塞米松作用48h，建立胰岛素抵抗模型后实验分成四组：对照组、模型组(dex)、阳性对照组(二甲双胍)和芡实多糖efsp-1组。对照组和模型组使用dmem高糖完全培养液培养，二甲双胍组使用含有0.5mmol/l二甲双胍的dmem高糖完全培养液培养，芡实多糖efsp-1组由含有不同浓度的芡实多糖efsp-1(25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml)dmem高糖完全培养液培养。药物配成不同浓度等体积，对照组和模型组的培养液中加入与药物同体积的pbs，确保加入的培养液体积一致。药物作用24h后，使用葡萄糖测定试剂盒，测定细胞上清中的葡萄糖含量。
实验结果：
与模型组比较，芡实种仁多糖能够显著提高胰岛素抵抗hepg2细胞和3t3-l1脂肪细胞的葡萄糖消耗率。在芡实种仁多糖的浓度为25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml时，胰岛素抵抗hepg2细胞和3t3-l1脂肪细胞的葡萄糖消耗率分别为102.3％、104.1％、104.5％、106.6％、126.1％和72.35％、88.54％、93.27％、95.26％、100.4％。