本发明属于肿瘤分子生物学领域,涉及乳腺癌新的诊断标志及药物靶标,具体涉及iqub基因或蛋白在制备乳腺癌诊断及治疗药剂中的应用。
背景技术:
乳腺癌已成为世界上女性中发病率最高的肿瘤,严重影响女性的生命健康。尽管筛查方案和辅助疗法的发展取得了成功,但相当大比例的乳腺癌患者死于癌症转移。乳腺癌诊治的关键在于早发现、早诊断和早治疗。癌基因的激活,或者抑癌基因的失活在肿瘤发生发展过程中起着关键作用。随着大规模、高通量测序技术的推广应用,发现新的癌基因和抑癌基因不仅为肿瘤的诊断和预后提供了颇具价值的标准,同时也为寻找新的肿瘤生物治疗靶点奠定基础。
iqub基因(iqmotifandubiquitindomaincontaining)位于染色体7q31.32,其编码蛋白含有791个氨基酸。目前,关于iqub基因或蛋白在乳腺癌中的作用机制尚不清楚,其功能和表达变化的临床意义尚未有报道。因此,分析iqub基因与乳腺癌发生发展的关系,探索针对iqub途径的肿瘤治疗和预警策略至关重要。
技术实现要素:
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足,提供一种iqub基因或蛋白在制备乳腺癌诊断及治疗药剂中的应用,可方便快捷的在基因水平上实现肿瘤的检测,同时,以iqub基因为靶点的药物有望成为肿瘤靶向治疗的一种新手段。
为实现上述目的,本发明采用下述技术方案:
第一方面,本发明提供一种乳腺癌诊断试剂,含有可检测人iqub的蛋白表达水平或其基因的mrna含量的试剂。
优选地,所述检测人iqub的蛋白表达水平的试剂包括人iqub的多克隆抗体或单克隆抗体。
优选地,所述检测人iqub基因的mrna含量的试剂包括能特异扩增人iqub基因mrna的pcr引物,该pcr为rt-pcr或实时定量pcr。
进一步地,所述的能特异扩增人iqub基因mrna的pcr引物包括如下引物对:
上游引物序列为:5’-tttccgctttctgagccctt-3’,seqidno:1,
下游引物序列为:5’-ttagacattttccttcacacatacc-3’,seqidno:2。
第二方面,提供检测iqub基因mrna的含量的方法在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。
第三方面,提供检测iqub蛋白表达水平的方法在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。
第四方面,提供iqub基因在制备预防或治疗乳腺癌药物中的应用。
优选地,所述药物选自以下组:抑制乳腺癌细胞增殖的药物、抑制乳腺癌细胞迁移的药物。
优选地,所述乳腺癌预防或治疗药物以iqub基因为靶点,抑制iqub蛋白的表达或其基因mrna的含量。
优选地,所述药物包括通过干扰rna抑制iqub基因表达的双链核糖核酸,或基于iqub抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制iqub蛋白活性的蛋白质。
优选地,所述干扰rna抑制iqub基因表达的双链核糖核酸序列为:
sirna1:
sense:5'-gccucaagagucagaucaaac-3',seqidno:3,
anti-sense:5'-guuugaucugacucuugaggc-3',seqidno:4,
sirna2:
sense:5'-gcagaauaccaugcucaaaga-3',seqidno:5,
anti-sense:5'-ucuuugagcaugguauucugc-3',seqidno:6,
sirna3:
sense:5'-gcauauaccggugucguaacu-3',seqidno:7,
anti-sense:5'-aguuacgacaccgguauaugc-3',seqidno:8,
转染细胞时,将sirna1,sirna2和sirna3联合使用。
本发明提供了一种iqub基因的新用途,即在制备乳腺癌诊断及治疗药剂中的应用,以iqub基因为基础的诊断药物可方便快捷的在基因水平上实现肿瘤的检测,同时,以iqub基因为靶点的药物有望成为肿瘤治疗的一种新手段。
附图说明
图1为iqub在20例乳腺癌和邻近癌旁组织中的表达情况;
图2为iqub在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的免疫组化染色结果;
图3为iqub在高分化乳腺癌和低分化乳腺癌中免疫组化染色结果;
图4为通过平板克隆实验观察iqub干扰后对mda-mb-231细胞增殖的影响(sir-nc为negativecontrol组,sir-iqub为iqub干扰组);
图5为通过平板克隆实验观察iqub过表达后对mcf-7细胞增殖的影响(flag-nc为negativecontrol组,flag-iqub为iqub过表达组);
图6为通过cck-8实验观察iqub干扰后对mda-mb-231细胞增殖的影响(sir-nc为negativecontrol组,sir-iqub为iqub干扰组);
图7为通过cck-8实验观察iqub过表达后对mcf-7细胞增殖的影响(flag-nc为negativecontrol组,flag-iqub为iqub过表达组);
图8为通过划痕实验观察iqub干扰后对mda-mb-231细胞迁移的影响(sir-nc为negativecontrol组,sir-iqub为iqub干扰组);
图9为通过划痕实验观察iqub过表达后对mcf-7细胞迁移的影响(flag-nc为negativecontrol组,flag-iqub为iqub过表达组);
图10为通过transwell实验观察iqub干扰后对mda-mb-231细胞迁移的影响(sir-nc为negativecontrol组,sir-iqub为iqub干扰组);
图11为通过transwell实验观察iqub过表达后对mcf-7细胞迁移的影响(flag-nc为negativecontrol组,flag-iqub为iqub过表达组)
图12为iqub干扰后对mda-mb-231细胞周期的影响(sir-nc为negativecontrol组,sir-iqub为iqub干扰组;
图13为iqub过表达后对mcf-7细胞周期的影响(flag-nc为negativecontrol组,flag-iqub为iqub过表达组);
图14为phage-flag载体的图谱;
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件。
【实施例1】iqub在乳腺癌组织标本中的差异性表达
1、人乳腺癌组织标本收集
从武汉大学中南医院,收集2016年11月至2017年11月间的共20例乳腺癌组织标本及其临近的正常乳腺组织标本,储存于液氮中,提取rna用来做实时荧光定量pcr。所有病人均书面告知,标本收集均经武汉大学基础医学院伦理审查委员会同意。
2、rna提取
按照操作手册步骤用trizol试剂(invitrogen,carlsbad,ca)提取冰冻的乳腺癌及其邻近正常组织的rna。
逆转录和实时荧光定量pcr
用revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(thermoscientific,usa)按操作手册对mrna进行逆转录,用实时荧光定量pcr(appliedbiosysteminc.)来对mrna进行定量分析。针对iqub的编码序列(nm_001321293.1)设计实时荧光定量pcr的上游引物为5’-tttccgctttctgagccctt-3’下游引物为5’-ttagacattttccttcacacatacc-3’;内参gapdh的实时荧光定量pcr的上游引物为5’-ggtgaaggtcggagtcaacg-3’,下游引物为5’-ccatgtagttgaggtcaatgaag-3’。
如图1所示,iqub在20例乳腺癌组织和邻近正常组织中的mrna表达水平,其中16例乳腺癌组织中iqub的mrna表达水平增高。
3、免疫组化染色
在包含100例乳腺癌组织和10例正常乳腺组织的组织芯片中,通过免疫组化染色检测iqub的蛋白表达水平,及其与乳腺癌患者临床病理信息之间的相关性。
(1)制作切片。取组织蜡块,切下一片置于载玻片上,后置于60℃烤箱中烤片60min。
(2)脱蜡。烤箱中取出切片,分别置于二甲苯i、ii中各15min——100%乙醇i、ii各10min——95%乙醇i、ii各10min——80%乙醇10min——70%乙醇10min.
(3)取出切片,用pbs(ph7.2-7.6)冲洗2次,5min/次。
(4)抗原修复-蒸汽修复法。将切片放于0.01m枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)中,放入蒸锅,使切片在缓冲液中95℃保持20min,取出切片,自然冷却至室温。(切片需仍置于缓冲液中,随缓冲液冷却)。
(5)待冷却至室温后,取出切片,用pbs(ph7.2-7.6)漂洗2次,5min/次。
(6)灭活内源性过氧化物酶。切片置于保湿盒中,滴加约50微升的3%过氧化氢溶液于切片,室温放置5-10min,若室温较低,可延长时间至20-30min。
(7)切片置于pbs(ph7.2-7.6)中漂洗3次,5min/次。
(8)抗原封闭。除去切片上的pbs(ph7.2-7.6),用免疫组化笔在组织周围画一圆圈,滴加山羊血清约50微升于组织上,以浸没组织为益。保湿盒置于37℃恒温箱中15min。
(9)添加一抗anti-iqub。甩去切片上的山羊血清,分别以1:200稀释一抗,每个切片滴加约50微升稀释后的一抗。切片放于保湿盒中置于4℃环境下孵育过夜。
(10)取出切片,用pbs(ph7.2-7.6)冲洗3次,2min/次。
(11)添加二抗,生物素标记的山羊抗兔igg(beyotime,jiangsu)每个切片滴加约50微升。将切片放于保湿盒中置于37℃恒温箱中20min。
(12)pbs(ph7.2-7.6)漂洗3次,2min/次。
(13)添加链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶约50微升于组织上。保湿盒中37℃放置20min。
(14)用pbs(ph7.2-7.6)清洗漂洗4次,5min/次。
(15)dab显色。配制dab底物溶液,滴加至切片上,镜下控制反应时间。
(16)用蒸馏水漂洗3次,5min/次。
(17)苏木素复染(染细胞核)。将切片置于苏木素溶液中约30s,蒸馏水漂洗。
(18)分化(去除多余的及细胞质中的苏木素)。配制盐酸酒精溶液(37%浓盐酸:7%乙醇=1:99),将切片放入盐酸酒精溶液后迅速取出,动作需快。蒸馏水漂洗。
(19)脱水。分别置于70%乙醇10min——80%乙醇10min——95%乙醇ⅰ、ⅱ各10min——100%乙醇ⅰ、ⅱ各10min——二甲苯ⅰ、ⅱ中各15min。
(20)封片。滴加一滴中性树脂,放置盖玻片。
(21)镜下观察。
如图2所示,相对于正常乳腺组织,iqub蛋白在乳腺癌组织中的表达水平显著增高,如表1和图3所示,iqub的蛋白表达水平与乳腺癌的病理分化呈负相关,因此iqub可以用来制备乳腺癌发生发展诊断试剂盒
表1.iqub蛋白表达水平与乳腺癌组织临床病理特征的相关性
【实施例2】iqub促进乳腺癌细胞的增殖和迁移能力
1、细胞培养
人乳腺癌细胞系mda-mb-231用完全rpmi-1640培养基培养,mcf-7用完全dmem培养基培养。所有的培养基包含10%胎牛血清和抗生素(10000u/ml青霉素,10ug/ml链霉素)。细胞培养箱环境为37℃,湿润,5%co2。
2、iqub小干扰rna的合成以及过表达质粒的构建
将iqub的编码序列(nm_001321293.1)克隆至phage-flag载体(载体图谱如图14所示),命名为flag-iqub,其对照空载体为flag-nc。iqub的小干扰rna是由上海吉玛公司合成,序列为
sirna1(sense:5'-gccucaagagucagaucaaac-3',anti-sense:
5'-guuugaucugacucuugaggc-3'),
sirna2(sense:5'-gcagaauaccaugcucaaaga-3',anti-sense:
5'-ucuuugagcaugguauucugc-3'),
sirna3(sense:5'-gcauauaccggugucguaacu-3',anti-sense:
5'-aguuacgacaccgguauaugc-3')。
阴性对照sirna(sense5'-uucuccgaacgugucacgu-3,anti-sense
5'-acgugacacguucggagaa-3')。转染细胞时,将sirna1,sirna2和sirna3联合使用,作为iqub的小干扰rna,命名为sir-iqub,其阴性对照rna为sir-nc。
3、平板克隆实验
mda-mb-231和mcf-7细胞培养于35mm培养皿中,用iqub小干扰rna和阴性对照rna瞬时转染mda-mb-231细胞,用iqub过表达质粒和阴性对照质粒瞬时转染mcf-7细胞。继续培养24h后用胰酶消化吹散,吸取200个细胞重新接种到35mm培养皿中,继续培养一周。
如图4、5所示,和对照组相比,敲降iqub能够显著抑制mda-mb-231细胞的增殖能力;和对照组相比,iqub过表达能够显著促进mcf-7细胞的增殖能力。
4、cck-8实验
mda-mb-231和mcf-7细胞培养于35mm培养皿中,用iqub小干扰rna和阴性对照rna瞬时转染mda-mb-231细胞,用iqub过表达质粒和阴性对照质粒瞬时转染mcf-7细胞。用胰酶消化吹散,接种到96孔细胞培养板中,细胞悬液浓度约为3×103/ml,每孔100μl。置于细胞培养箱中37℃继续培养,分别在0h、12h、24h、36h、48h时每孔加入10μl的cck-8溶液,充分混匀后继续培养2h,用酶标仪测定每孔在450nm处吸光度。
如图6、7所示,和对照组相比,敲降iqub能够显著抑制mda-mb-231细胞的增殖能力;和对照组相比,iqub过表达能够显著促进mcf-7细胞的增殖能力。
5、划痕实验
mda-mb-231和mcf-7细胞培养于100mm培养皿中,用iqub小干扰rna和阴性对照rna瞬时转染mda-mb-231细胞,用iqub过表达质粒和阴性对照质粒瞬时转染mcf-7细胞。在培养皿底部用200ul枪头做一划痕,继续培养,24、48h时分别观察。
如图8、9所示,和对照组相比,敲降iqub能够显著抑制mda-mb-231细胞的迁移能力;和对照组相比,iqub过表达能够显著促进mcf-7细胞的迁移能力。
6、transwell细胞迁移实验
mda-mb-231和mcf-7细胞培养于35mm培养皿中,用iqub小干扰rna和阴性对照rna瞬时转染mda-mb-231细胞,用iqub过表达质粒和阴性对照质粒瞬时转染mcf-7细胞。用胰酶消化吹散,制成浓度约为1×105/ml的细胞悬液,每个小室的上室加入100μl,上室用含有10%fbs的完全培养基,下室加入500μl含有20%fbs的完全培养基。置于细胞培养箱中37℃继续培养12h。取出小室,4%的多聚甲醛溶液固定后再用0.5%结晶紫溶液染色。用棉签擦去上室内表面没有穿过膜的细胞,然后显微镜下观察拍照。
如图10、11所示,和对照组相比,敲降iqub能够显著抑制mda-mb-231细胞的迁移能力;和对照组相比,iqub过表达能够显著促进mcf-7细胞的迁移能力。
7、细胞周期实验
mda-mb-231和mcf-7细胞培养于35mm培养皿中,用iqub小干扰rna和阴性对照rna瞬时转染mda-mb-231细胞,用iqub过表达质粒和阴性对照质粒瞬时转染mcf-7细胞。48h后用胰酶消化吹散,按照细胞周期检测试剂盒规范化的步骤操作,然后使用流式细胞仪检测细胞。
如图12、13所示,和对照组相比,敲降iqub能够显著促进乳腺癌mda-mb-231细胞周期阻滞于g1期;和对照组相比,iqub过表达能够显著促进乳腺癌mcf-7细胞周期从g1期向s和g2/m期转换。因此,iqub可以作为治疗靶点用来制备抑制乳腺癌肿瘤增长和转移的药物。
序列表
<110>武汉大学
<120>iqub基因或蛋白在制备乳腺癌诊断产品和治疗药物中的应用
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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