本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种分离玻璃酸钠与杂合硫酸软骨素的方法。
背景技术：
玻璃酸钠是一种高分子多糖，用于外科关节病、组织修复、眼科手术、辅助诊断等方面。其生产工艺主要分为两大类，以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。在鸡冠提取法(动物组织)生产玻璃酸钠的工艺研究过程中，通过对玻璃酸钠纯度的测定，可调控最佳的工艺条件，为工艺改进提供更准确的数据支持，从而保证下游成品的品质。
cn102516411a公开了一种玻璃酸钠发酵液的前处理方法，硅藻土吸附后，通过物理方法的过滤和微滤来达到玻璃酸钠发酵液的除菌目的，其成本低、安全、有效；利用本方法处理的玻璃酸钠发酵液，可基本去除发酵液中菌体，有效减少了核酸和蛋白等杂质的含量，特别适合医药级玻璃酸钠的工业化生产，并且由该方法处理过的玻璃酸钠发酵液的透光率比较高，但是该方法没有提到分离出玻璃酸钠中的杂合硫酸软骨素，而且也得不到纯度较高的杂合硫酸软骨素。
cn206392032u公开了一种交联透明质酸钠凝胶的纯化装置，在釜体中设置离子交换柱处理结构，其中包括强酸型阳离子交换柱和强碱型阴离子交换柱，主要是利用离子交换柱去除蛋白这种两性杂质，蛋白质变性，无法得到可以再利用的杂合硫酸软骨素。
现有技术中注射液和眼角膜保存液中大多同时含有玻璃酸钠和杂合硫酸软骨素这两种组分。一般认为玻璃酸钠中含有的杂合硫酸软骨素有益处，例如硫酸软骨素对角膜胶原纤维具有保护作用，能促进基质中纤维的增长，增强通透性，改善血液循环，加速新陈代谢，促进渗透液的吸收及炎症的消除，但是其在某些临床应用领域产生的不良反应，有些病人有发痒、红肿等过敏现象，这些不良反应被忽略了。普通的技术人员没有动机去除该杂质。且杂合硫酸软骨素非单一组分构成，现有技术上没有报道过通过一个步骤去除多个杂质并与玻璃酸钠有效分离的方法。
技术实现要素：
鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种分离玻璃酸钠中杂质的方法，从玻璃酸钠原料中高效分离出高纯度的杂合硫酸软骨素和高纯度的玻璃酸钠。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种分离玻璃酸钠与杂合硫酸软骨素的方法，包括如下步骤：
(1)上样：将玻璃酸钠原料溶解于水，得到样品溶液；将样品溶液上样至q-sepharosefastflow阴离子交换柱中；
(2)梯度洗脱：依次用0.4m、0.6m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱，收集0.4mnacl水溶液的洗脱液，为含有玻璃酸钠的溶液；收集1.0mnacl水溶液的洗脱液，为含有杂合硫酸软骨素的溶液。
本发明所述的“包括”，意指其除所述步骤外，还可以包括其他步骤，这些其他步骤赋予所述方法不同的作用。除此之外，本发明所述的“包括”，还可以替换为封闭式的“为”。
杂合硫酸软骨素非单一组分构成，现有技术上尚没有报道过一次性去除多个杂合硫酸软骨素杂质并与玻璃酸钠有效分离的方法。本发明所述方法采用q-sepharosefastflow阴离子交换柱配合nacl水溶液的梯度洗脱，实现了一次性去除多个杂合硫酸软骨素杂质并与玻璃酸钠有效分离的目的，所分离出的杂合硫酸软骨素纯度达99.5wt％以上，同时玻璃酸钠得到高效纯化，纯度达99.5wt％以上。
优选地，步骤(1)所述玻璃酸钠原料包括生物提取法生产的玻璃酸钠原料，例如从鸡冠中用生物提取法生产的玻璃酸钠原料等。
优选地，步骤(1)所述样品溶液中玻璃酸钠原料的浓度为0.3～0.8g/l，例如0.3g/l、0.35g/l、0.4g/l、0.45g/l、0.5g/l、0.55g/l、0.6g/l、0.65g/l、0.7g/l、0.75g/l或0.8g/l等，优选0.4～0.6g/l。
优选地，步骤(1)所述q-sepharosefastflow阴离子交换柱的高径比为(10～20):1，例如10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1等，优选(10～15):1。
优选地，步骤(1)所述上样时的流速为5.0～10.0ml/min，例如5.0ml/min、5.5ml/min、6.0ml/min、6.5ml/min、7.0ml/min、7.5ml/min、7.8ml/min、8.0ml/min、8.2ml/min、8.5ml/min、9ml/min、9.5ml/min或10.0ml/min等，优选7.5～8.5ml/min；
优选地，所述步骤(1)中上样体积为0.1～0.3倍的柱体积，例如0.1倍、0.15倍、0.2倍、0.25倍或0.3倍等，使得样品与交换柱中的填充介质充分、良好地吸附，提高分离效率。
优选地，所述步骤(1)之前还包括：活化q-sepharosefastflow阴离子交换柱。
优选地，所述活化具体包括：依次用超纯水、nacl水溶液和超纯水，过所述q-sepharosefastflow阴离子交换柱进行洗涤，将交换柱进行平衡，并洗去其中可能会掺入到后期分离中的多余的杂质，进一步保证所得分离相的纯度。
优选地，所述活化时用的nacl水溶液的浓度为0.2～0.6m，例如0.2m、0.3m、0.4m、0.5m或0.6m等。
本发明通过设置样品浓度、洗脱体积、流速，与洗脱液浓度梯度配合，互相协同，进一步提高所得玻璃酸钠和硫酸软骨素的纯度。优选地，所述步骤(2)所述洗脱体积为10～13倍的柱体积，例如10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、12.5倍或13倍等。
优选地，步骤(2)所述梯度洗脱时的流速为5.0～10.0ml/min，例如5.0ml/min、5.5ml/min、6.0ml/min、6.5ml/min、7.0ml/min、7.5ml/min、7.8ml/min、8.0ml/min、8.2ml/min、8.5ml/min、9ml/min、9.5ml/min或10.0ml/min等，优选7.5～8.5ml/min。
优选地，所述步骤(2)中依次用0m、0.4m、0.6m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱。增加0m的nacl水溶液先进行洗脱还起到将未吸附上的化合物先洗脱下来的作用，进一步提高分离相的浓度。
初次分离时0.6m的nacl水溶液使得0.4m过渡到1.0m，保证初次分离的较高分离效率，但是其洗脱液仍是混合物，可以单独收集起来继续分离。优选地，步骤(2)还包括：收集0.6mnacl水溶液的洗脱液，返回步骤(1)进行再次分离。
优选地，所述方法还包括步骤(3)：将步骤(2)所得含有玻璃酸钠的溶液进行纯化，得到玻璃酸钠；和/或，将步骤(2)所得含有杂合硫酸软骨素的溶液进行纯化，得到硫酸软骨素。本发明所述方法分离出的玻璃酸钠具有高纯度，可用于生产制剂，治疗膝骨关节炎、肩周炎等症，同时也可以作为标准品的基础物质。本发明所述方法得到的硫酸软骨素也具有重要的实用价值，例如可以用作治疗神经痛、神经性偏头痛、关节痛、关节炎以及肩胛关节痛，腹腔手术后疼痛等。
作为本发明优选的技术方案，所述的分离玻璃酸钠与杂合硫酸软骨素的方法包括如下步骤：
(1)活化：依次用超纯水、0.2～0.6m的nacl水溶液和超纯水，过所述q-sepharosefastflow阴离子交换柱进行洗涤；
上样：将浓度为0.3～0.8g/l的样品溶液以5.0～10.0ml/min的流速上样至q-sepharosefastflow阴离子交换柱中，上样体积为0.1～0.3倍的柱体积；
(2)梯度洗脱：m、0.4m、0.6m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱，流速为5.0～10.0ml/min，洗脱体积为10～13倍的柱体积，收集0.4mnacl水溶液的洗脱液，为含有玻璃酸钠的溶液；收集1.0mnacl水溶液的洗脱液，为含有杂合硫酸软骨素的溶液；收集0.6mnacl水溶液的洗脱液，返回步骤(1)进行再次分离。
(3)纯化：将步骤(2)所得含有玻璃酸钠的溶液进行纯化，得到玻璃酸钠；和/或，将步骤(2)所得含有杂合硫酸软骨素的溶液进行纯化，得到硫酸软骨素。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
1、本发明对玻璃酸钠中杂质去除有很好效果，为提高玻璃酸钠纯度提供可靠的支持；
2、本发明通过设置样品浓度、洗脱体积、流速，与洗脱液浓度梯度配合，互相协同，进一步提高所得玻璃酸钠和硫酸软骨素的纯度，所分离出的杂合硫酸软骨素纯度达99.5wt％以上，同时玻璃酸钠得到高效纯化，纯度达99.5wt％以上，具有重要的实用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中玻璃酸钠原料的高效凝胶过滤色谱图；
图2为本发明实施例1中0.4mnacl洗脱液的高效凝胶过滤色谱图；
图3为本发明实施例1中0.6mnacl洗脱液的高效凝胶过滤色谱图；
图4为本发明实施例1中1.0mnacl洗脱液的高效凝胶过滤色谱图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。但下述的实施例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
实施例1
一种分离玻璃酸钠与杂合硫酸软骨素的方法，步骤如下：
(1)活化：依次用超纯水、0.2m的nacl水溶液和超纯水，过q-sepharosefastflow阴离子交换柱进行洗涤；
上样：将从鸡冠中生物提取的玻璃酸钠原料50mg溶于100ml水得到样品溶液，将样品溶液以8.0ml/min的流速上样至高径比为15:1的q-sepharosefastflow阴离子交换柱中，上样体积为0.2倍的柱体积；
(2)梯度洗脱：用0m、0.4m、0.6m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱，流速为8.0ml/min，洗脱体积为10倍的柱体积，用硼砂硫酸-咔唑法来对不同浓度nacl的洗脱液进行显色，其中0.4、0.6、1.0mol/l的nacl洗脱液呈现紫红色，表明上述洗脱溶液中含有糖醛酸。然后分别将0.4、0.6、1.0mol/l的nacl洗脱液用0.45μm的滤膜过滤，用高效液相色谱进行检测。检测结果分别为图2、图3和图4所示，从凝胶过滤色谱图中可知0.4mol/l的nacl洗脱液中只含有玻璃酸钠；0.6mol/l的nacl洗脱液中既含有玻璃酸钠，又含有杂质；而1.0mol/l的nacl洗脱液中只含有杂质。所以，收集的0.4mnacl水溶液的洗脱液为含有玻璃酸钠的溶液；收集的1.0mnacl水溶液的洗脱液为含有杂合硫酸软骨素的溶液，虽然损失部分杂质，但可以保证分离出纯度为99.8wt％的杂合硫酸软骨素样品和纯度为99.9wt％的玻璃酸钠，实现高效分离。
其中，为了验证原料中的成分，称取本实施例的1mg玻璃酸钠原料玻璃酸钠原料药溶于1ml流动相中，配置成0.5mg/ml的溶液。将溶液过滤后用高效凝胶过滤色谱法进行分析，结果如图1所示：凝胶过滤色谱图中出现了两个峰，前者为玻璃酸钠，后者为原料药的杂质杂合硫酸软骨素。
显色检测方法：取各浓度下的洗脱液1ml，分别置于具塞试管中，混匀，冰浴中冷却，并在不断振摇下缓缓滴加0.025mol/l硼砂硫酸溶液5.0ml，密塞，沸水浴加热10min(中间振摇一次)，迅速冷却，加0.125％咔唑的无水乙醇溶液0.2ml，摇匀，沸水浴中加热15min(中间振摇一次)，冷却至室温。
纯度检测方法：液相条件：采用agilent1100高效液相色谱仪，色谱柱为shodexohpaksb-806hq凝胶色谱柱，柱温35℃，进样量为20μl，流动相0.2mol/lnacl溶液；检测器：示差折光检测器(rid)，检测器温度40℃。
实施例2
一种分离玻璃酸钠与杂合硫酸软骨素的方法，步骤如下：
(1)上样：将从鸡冠中生物提取的玻璃酸钠原料30mg溶于100ml水得到样品溶液，将样品溶液以5.0ml/min的流速上样至高径比为20:1的q-sepharosefastflow阴离子交换柱中，上样体积为0.1倍的柱体积；
(2)梯度洗脱：用0.4m、0.6m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱，流速为5.0ml/min，洗脱体积为11倍的柱体积，收集0.4mnacl水溶液的洗脱液，为含有玻璃酸钠的溶液；收集1.0mnacl水溶液的洗脱液，为含有杂合硫酸软骨素的溶液，实现分离。
实施例3
一种分离玻璃酸钠与杂合硫酸软骨素的方法，步骤如下：
(1)活化：依次用超纯水、0.2m的nacl水溶液和超纯水，过q-sepharosefastflow阴离子交换柱进行洗涤；
上样：将从鸡冠中生物提取的玻璃酸钠原料80mg溶于100ml水得到样品溶液，将样品溶液以10.0ml/min的流速上样至高径比为18:1的q-sepharosefastflow阴离子交换柱中，上样体积为0.3倍的柱体积；
(2)梯度洗脱：用0.4m、0.6m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱，流速为10.0ml/min，洗脱体积为13倍的柱体积，收集0.4mnacl水溶液的洗脱液，为含有玻璃酸钠的溶液；收集1.0mnacl水溶液的洗脱液，为含有杂合硫酸软骨素的溶液，实现分离。
实施例4
一种分离玻璃酸钠与杂合硫酸软骨素的方法，步骤如下：
(1)活化：依次用超纯水、0.2m的nacl水溶液和超纯水，过q-sepharosefastflow阴离子交换柱进行洗涤；
上样：将从鸡冠中生物提取的玻璃酸钠原料40mg溶于100ml水得到样品溶液，将样品溶液以7.5ml/min的流速上样至高径比为10:1的q-sepharosefastflow阴离子交换柱中，上样体积为0.15倍的柱体积；
(2)梯度洗脱：用0.4m、0.6m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱，流速为7.5ml/min，洗脱体积为12倍的柱体积，收集0.4mnacl水溶液的洗脱液，为含有玻璃酸钠的溶液；收集0.6mnacl水溶液的洗脱液，返回步骤(1)进行再次分离；收集1.0mnacl水溶液的洗脱液，为含有杂合硫酸软骨素的溶液，实现分离。
(3)将步骤(2)所得含有玻璃酸钠的溶液进行纯化，具体为：活性炭吸附后进行过滤，醇沉，干燥，得到得到玻璃酸钠；将所得含有杂合硫酸软骨素的溶液进行纯化，具体为：将含有杂合硫酸软骨素的溶液旋蒸浓缩后，用截留分子量mwco为3500的透析袋透析3天，然后冷冻干燥，即可得到杂质样品，得到硫酸软骨素。
实施例5
一种分离玻璃酸钠与杂合硫酸软骨素的方法，步骤如下：
(1)上样：将从鸡冠中生物提取的玻璃酸钠原料60mg溶于100ml水得到样品溶液，将样品溶液以8.5ml/min的流速上样至高径比为13:1的q-sepharosefastflow阴离子交换柱中，上样体积为0.25倍的柱体积；
(2)梯度洗脱：用0m、0.4m、0.6m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱，流速为8.5ml/min，洗脱体积为10倍的柱体积，收集0.6mnacl水溶液的洗脱液，返回步骤(1)进行再次分离；收集0.4mnacl水溶液的洗脱液，为含有玻璃酸钠的溶液；收集1.0mnacl水溶液的洗脱液，为含有杂合硫酸软骨素的溶液，实现分离。
对比例1
与实施例1的区别仅在于：将q-sepharosefastflow阴离子交换柱替换为deae阴离子交换柱。
对比例2
与实施例1的区别仅在于：将q-sepharosefastflow阴离子交换柱替换为dowex1×2强碱性阴离子交换柱。
对比例3
与实施例1的区别仅在于：步骤(2)用0m、0.4m、0.8m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱。
对比例4
与实施例1的区别仅在于：步骤(2)用0m、0.4m、0.5m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱。
实施例6
与实施例1的区别仅在于：样品溶液的浓度为0.2g/l。
实施例7
与实施例1的区别仅在于：样品溶液的浓度为2.0g/l。
实施例8
与实施例1的区别仅在于：洗脱流速为3.0ml/min。
实施例9
与实施例1的区别仅在于：洗脱流速为13.0ml/min。
各实施例与对比例分离所得玻璃酸钠和硫酸软骨素的纯度整理于表1。
表1
如表1所示，对照实施例5与对比例1～2可知，本发明所用的q-sepharosefastflow阴离子交换柱相较于现有技术其他的离子交换柱，所得的玻璃酸钠的纯度显著提高，且得到的杂合硫酸软骨素纯度在99.5wt％以上，具有高附加值。而其他的离子交换柱只能把玻璃酸钠进行一定程度的提纯，但是对于杂合硫酸软骨素的高效回收几乎没有作用，得到的杂合硫酸软骨素量少，且纯度非常低，不能直接应用。
对照实施例5与对比例3～4可知，本发明通过q-sepharosefastflow阴离子交换柱需要与合适的洗脱液梯度相互配合，本发明依次采用0.4m、0.6m和1.0m的nacl水溶液进行梯度洗脱，相较于其他梯度的设置，分离效率更高，所得产品纯度具有显著进步。
对照实施例5实施例6～9可知，本发明通过q-sepharosefastflow阴离子交换柱需要与合适的洗脱液梯度相互配合的前提下，通过设置样品浓度、洗脱流速，参数间互相协同，进一步提高所得玻璃酸钠和硫酸软骨素的纯度。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。