本发明属于有机小分子稳定同位素标记技术应用领域，具体涉及一种咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂及其合成方法与应用。
背景技术：
高效液相色谱-质谱串联技术(简称hplc-ms/ms)由于其高灵敏度和高选择性而被广泛应用于生命分析、环境检测、食品评估等研究领域。采用hplc-ms/ms的选择反应监测(简称srm)或多级反应离子监测(简称mrm)模式可以选择性的监测样品中的靶向分析物以及半靶向分析物。然而，由于样品中基质或者共洗脱物质引起的信号减弱或增强的基质效应的问题使hplc-ms/ms的分析性能大打折扣，其应用受到一定的限制，现有技术却并没有给出行之有效的完整解决方案。
近年来，稳定的同位素编码技术受到了很大的关注，尤其是稳定同位素编码衍生技术，借助轻/重同位素编码衍生试剂，可获得具有相同官能团的同种分析物的同位素衍生物。其通常以重型同位素衍生物作为内标物进行hplc-ms/ms定量分析。然而，迄今已有的化学标记方法都有诸多缺陷，如标记反应速率慢、标记产率低、标记产物信号弱、标记准确性和灵敏性较差等等，并且很多标记试剂的合成复杂，不易获得相应的同位素产物，因此限制了此类技术的广泛使用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种标记反应速率快、标记产物信号高、质谱检测巯基化合物准确性强和灵敏性高且合成简便的咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂；本发明同时提供其具体合成方法与应用。
本发明所提供的咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂是以咔唑为母体环，马来酰亚胺为反应基团与同位素标记基团，其化学名称为：n-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-n-[d0]/[d2]马来酰亚胺，其化学结构式为：
其中：当x＝h时，为n-(4-(咔唑-9-基)-)苯基)-n-[d0]马来酰亚胺，简写为ncpm-[d0]；当x＝d时，为n-(4-(咔唑-9-基)-)苯基)-n-[d2]马来酰亚胺，简写为ncpm-[d2]。在本发明中，h指氢的同位素氕，d指氢的同位素氘。
所提供的咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂的合成方法，包括以下步骤：
1)取代反应：将咔唑和4-溴乙酰苯胺溶解到二甲亚砜中，并与碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾混合，油浴130℃反应12h，反应结束待反应液冷却至室温后抽滤，得抽滤液，然后将抽滤液与(10-30)wt％的nacl混合析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑；
2)水解反应：将中间体ⅰ溶解于溶有氢氧化钾水溶液的二甲亚砜溶液中，于100℃反应2小时，冷却后，将反应液与水混合，回收析出固体并干燥，用乙醇重结晶制得中间体ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑；
3)酰化反应：将[d0]/[d2]马来酸酐溶解到丙酮中，滴加溶有中间体ⅱ的丙酮溶液，于25℃反应1小时，反应结束后将反应液溶剂蒸干，回收固体并干燥；固体干燥后加入乙酸酐溶解，再加入无水乙酸钠，于85℃下反应1小时，待反应液冷却到25℃后慢慢倒入冰水中，回收固体并干燥，用乙腈重结晶至少三次得目标产物n-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-n-[d0]/[d2]马来酰亚胺。
进一步，在步骤1)的所述取代反应中，咔唑与4-溴乙酰苯胺摩尔比为1:1.5，碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾的加入量分别为咔唑质量的25％、22％和50％。
进一步，在步骤2)的所述水解反应中，氢氧化钾的加入量为9-((4-氨基)-苯基)-咔唑质量的30％。
进一步，在步骤3)的所述酰化反应中，9-((4-氨基)-苯基)-咔唑与[d0]/[d2]马来酸酐的摩尔比为1:1.1，乙酸钠的加入量为9-((4-氨基)-苯基)-咔唑质量的10％。
本发明还提供一种上述咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂的应用，用于检测样品中硫醇的浓度，步骤为：
a.配制醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液和硫醇标准品乙腈溶液；配制浓度为1×10-4mol/l的n-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-n-[d0]马来酰亚胺的乙腈溶液作为轻型标记试剂溶液；配制浓度为1×10-4mol/l的n-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-n-[d2]马来酰亚胺的乙腈溶液作为重型标记试剂溶液；
b.依次将体积比1:2:1的醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液、硫醇标准品溶液和轻型标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；依次将体积比1:2:1的醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液、经柱纯化/膜过滤后的样品和重型标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；反应完成后，将上述两个反应液按体积比为1:1进行混合，进样进行高效液相色谱-质谱串联技术分析；
c.轻型标记试剂衍生后所得轻型衍生物的峰面积表示为a1，硫醇的浓度表示为c1；重型标记试剂衍生后所得重型衍生物的峰面积记为a2，样品中硫醇的浓度表示为c2，则根据公式c1/c2＝a1/a2，即可求得样品中硫醇的浓度。
优选的，在步骤a中，醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液的ph＝7.4、浓度为0.01mol/l，硫醇标准品乙腈溶液的浓度为1×10-6mol/l。
优选的，在步骤b中，硫醇标准品溶液为100μl，经柱纯化/膜过滤后的样品为100μl。
本发明所带来的综合有益效果如下：
①本发明得到的稳定同位素氘标记试剂，经分离提纯后，同位素标记位置稳定，化学纯度达99.5％以上，同位素丰度在99.0％以上。本发明轻型标记衍生物与重型同位素衍生物在质谱分析中具有相同的色谱保留行为，样品与标准品之间的基质效应也相同，能有效地校准基质效应的影响。②本发明的同位素标记试剂中的马来酰亚胺标记基团，通过与巯基化合物中所含巯基的迈克尔加成反应，可选择性地标记巯基化合物，具有合成方法简便，易于实现；标记反应速率快、标记产物的信号强、标记产率高、对巯基选择性高的优点，增强质谱检测巯基化合物准确性和灵敏性等优点。③该试剂能选择性地标记各类巯基化合物，广泛适用于生命分析、环境分析和食品分析等研究领域，用于多种实际样品中巯基化合物的分析检测。
具体地，本发明试剂在ph为7.4的醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液中能够迅速标记巯基化合物，对巯基化合物显示了高的灵敏性和选择性，检测巯基化合物简便、灵敏、快速，结果准确。
附图说明
图1是实施例1制备的标记试剂的合成反应路线图。
图2是实施例1制备的重型标记试剂的核磁1hnmr图谱。
图3是实施例1制备的轻型标记试剂的核磁1hnmr图谱。
图4是实施例1制备的标记试剂与巯基化合物的反应路线图。
图5是实施例2本发明轻型标记试剂和重型标记试剂衍生5种硫醇标准品的质谱多反应监测(简称mrm)离子色谱流图。
图6是实施例3采用本发明标记试剂标记的正丙硫醇和正丁硫醇的轻型衍生物的二级质谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
如图1所示，本发明所述咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂的合成共有3步。
重型标记试剂以[d2]-马来酸酐为基础原料，具体合成操作步骤如下：
1、中间体ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑的制备
250ml三口烧瓶中加入10g咔唑和16.5g4-溴乙酰苯胺，加入150ml二甲亚砜作为溶剂，加入5g碳酸钾、2.5g碘化亚铜与3ml二叔戊酰甲烷，油浴130℃反应12h过夜；反应结束待反应液冷却至室温25℃后抽滤，然后将抽滤液倒入600ml25wt％的nacl中析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑，收率为85wt％。
2、中间体ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑的制备
250ml三口烧瓶中加入10g中间体ⅰ，加入100ml二甲亚砜与20ml50％的氢氧化钾溶液，油浴加热并控制反应温度在100℃，搅拌反应2小时；冷却后将反应液沿着烧杯壁慢慢倒入600ml水中，并搅拌5分钟；将析出的固体过滤并干燥，用乙醇重结晶制得中间体ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑，收率为90wt％。
3、目标产物n-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-n-[d2]马来酰亚胺的制备
在100ml的圆底烧瓶中加入2.5g[d2]-马来酸酐和20ml丙酮，搅拌至[d2]-马来酸酐完全溶解后，滴加约25ml含有4g中间体ⅱ的丙酮溶液，继续搅拌1小时后，将溶剂蒸干，回收固体并干燥，固体干燥后加入乙酸酐溶液溶解，再加入0.5g无水乙酸钠，然后用85℃的油浴加热反应1小时，待反应液冷却后沿烧杯壁慢慢倒入500ml冰水中，将析出的固体过滤并干燥，用乙腈重结晶三次，得到n-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-n-[d2]马来酰亚胺纯品，收率为60wt％。
产物表征：
1hnmr(500mhz,dmso,ppm)δ8.39(dd,j＝8.0,1.5hz,2h),7.78(d,j＝8.6hz,2h),7.73–7.66(m,4h),7.36(dd,j＝11.3,4.2hz,2h),6.76(d,j＝8.6hz,2h)；(如图2所示).
found:c75.0,h4.34,n7.61,o13.04；calculated:c74.99,h4.38,n7.60,o13.03.
ms:m/z:[m+h]+＝368.1.
轻型标记试剂以[d0]-马来酸酐为基础原料，其合成步骤与重型标记试剂合成步骤相同，产物表征：
核磁1hnmr(500mhz,dmso,ppm)δ8.39(d,j＝8.0hz,2h),7.78(d,j＝8.2hz,2h),7.73–7.66(m,4h),7.36(t,j＝7.5hz,2h),7.30(s,2h),6.76(d,j＝8.6hz,2h)；(如图3所示).
found:c75.40,h3.82,n7.65,o13.10；calculated:c75.40,h3.85,n7.65,o13.11.
质谱ms:m/z:[m+h]+＝366.1.
实施例2
本实施例采用实施例1所述方法合成本发明咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂，同时将其应用于巯基样品检测。
配制ph＝7.4、浓度为0.01mol/l的醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液；分别配制浓度为1×10-4mol/l的ncpm-[d0]和ncpm-[d2]的乙腈溶液；配制浓度为1×10-6mol/l的5种硫醇标准品，2-巯基乙醇，正丙硫醇，正丁硫醇，3-巯基己醇与苄硫醇的乙腈溶液。
依次将50μl醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液、100μl硫醇标准品溶液和50μl轻型标记试剂ncpm-[d0]的乙腈溶液加到2ml的安剖瓶中，于40℃的水浴中反应10min。同时，于同样的条件下用重型标记试剂ncpm-[d2]标记经柱纯化/膜过滤后的洋葱实际样品。反应完成后将上述两个轻/重标记后的反应液按体积比为1:1进行混合，然后进行hplc-ms/ms分析。本发明柱纯化可采用常规纯化分离柱进行处理或者采用现有0.22μm有机滤膜过滤，在本实施例中具体采用lichrolut-en固相小柱进行分离纯化。
轻型标记试剂衍生后所得轻型衍生物的峰面积表示为a1，硫醇的浓度表示为c1；重型标记试剂衍生后所得重型衍生物的峰面积记为a2，洋葱实际样品中硫醇的浓度表示为c2，则根据公式c1/c2＝a1/a2，即可求得洋葱实际样品中硫醇的浓度。
本发明所述标记试剂与硫醇反应为迈克尔加成反应，选择性强，且反应速度快，具体化学反应式如图4所示。
图5示出了5种硫醇标准品的离子色谱流图。其中轻型标记衍生物与重型标记衍生物浓度比为4:1，在10分钟内实现了分析的5种硫醇标准品衍生物的完全分离，轻/重衍生物保留时间差异小于0.05分钟，完全符合质谱定量的要求。
实施例3
本实施例采用实施例2所述方法进行标记与检测，并进一步对样品进行硫醇的定量分析。
本实施例硫醇的定量分析采用安捷伦1290型超高效液相色谱系统，6460型三重四级杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源(esi)。
色谱条件：流动相a为5％乙腈+95％水，流动相b为100％乙腈，流动相中添加浓度为0.1％的甲酸以增强分析物的离子化效率；采用梯度洗脱，设置流动相b初始梯度为65％，6分钟后变为80％，并保持2分钟；进样量为1μl，流速为0.2ml/min。质谱条件：esi：正离子模式，干燥气温度：300℃，流速：10l/min，雾化压力：40psi，鞘气温度：250℃，流速：8l/min，毛细管电压：3.5kv。以上条件中百分比均为体积百分比。
碰撞电压(fragmentor)和裂解能(ce)参数如下表所示：
衍生物均显示较强的[m+h]+信号，轻型衍生物主要产生m/z338.2和m/z372.3的碎片离子，重型衍生物主要产生m/z340.2和m/z374.3的碎片离子，图6示出了以正丙硫醇和正丁硫醇的轻型衍生物为代表的质谱裂解图。