本发明涉及一种葡萄酒，尤其是一种可使葡糖酒香气更加浓郁、有效提高保肝及调节肠道菌群作用的大鲵活性肽葡萄酒。
背景技术：
葡萄酒是以葡萄为原料酿造的一种果酒，营养丰富，具有促进血液循环、降低血脂、利尿、激发肝功能和防止衰老等功效，可预防坏血病、贫血、脚气病、消化不良和眼角膜炎等疾病。
大鲵的肌肉、皮肤、内脏、脂肪、血液等含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪酸及微量元素等，对大鲵蛋白质进行深加工，可以获得一系列有益于人类生命活动的大鲵保健食品及药品。中国专利申请号为201610314751.x的发明专利申请公开了一种“大鲵活性肽及用途”，大鲵活性肽是按照如下步骤制备：
a.将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积ph7~8的0.01~0.1m磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；
b.离心取上清，采用截留分子量为4000da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；
c.通过sephadexlh-20分子筛层析柱，按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥；
d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10~50mg/ml的去离子水溶液，8000rpm、4℃条件下离心10min，用0.22µm水膜过滤，得到上样上清液；
e.使用ddh2o配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相a，使用ddh2o配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相b；使用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相a100%；20.5~40min，流动相a50%，流动相b50%；40.5~60min,流动相b100%；将上液上清液注入c18柱高效液相色谱仪进样口，收集紫外检测波长280nm的吸收峰；
f.挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。
该专利申请说明书公开了所制备的大鲵活性肽可清除自由基、提高机体免疫力及促进皮肤纤维原细胞增殖。
虽然在微生物发酵过程中加入肽类活性物质可以影响微生物的发酵过程，但是不同来源的肽类活性物质具有不同的结构，每一种肽对微生物发酵过程中的作用也不相同。迄今为止，并没有将大鲵活性肽与葡萄共同发酵制备大鲵活性肽葡萄酒的相关报道。
技术实现要素：
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可使葡糖酒香气更加浓郁、有效提高保肝及调节肠道菌群作用的大鲵活性肽葡萄酒。
本发明的技术解决方案是：一种大鲵活性肽葡萄酒，其特征在于依次按照如下步骤制备：
a.将酿酒用葡萄与大鲵活性肽为原料投入发酵罐中，接入葡萄酿酒酵母，所述大鲵活性肽为原料总质量的0.5~3%，所述葡萄酿酒酵母为原料总质量的0.5~1.0%，加入糖调节原料总糖度为22度，在发酵物中加入二氧化硫，28~32℃发酵10~15d，每升发酵物中二氧化硫加入量为70~100mg；
b.去除发酵液表面的残渣，在10~15℃继续发酵3~5d；
c.向发酵液中加入壳聚糖，壳聚糖添加量为发酵后产物总体积的0.05%，在10~15℃放置10~12h，澄清得发酵液；
d.将发酵液在5~10℃温度下陈酿2~3个月，期间间断补充二氧化硫使发酵液中游离的二氧化硫含量为50~100mg/l，然后进行膜过滤除菌，即得大鲵活性肽葡萄酒。
本发明是以葡萄与大鲵活性肽为原料进行发酵，不但具有葡萄酒抗氧化、增强免疫力等功能，而且使葡萄酿酒酵母产生了特殊的风味物质，香气成分总量高、种类多，使葡糖酒香气更加浓郁，同时可有效提高葡萄酒的保肝及调节肠道菌群作用。
附图说明
图1是本发明实施例小鼠肝损伤实验的肝组织切片图。
具体实施方式
实施例1：
a.将经清洗及干燥等处理的赤霞珠葡萄与大鲵活性肽为原料投入发酵罐中，接入葡萄酿酒酵母；大鲵活性肽按照中国专利申请号为201610314751.x的发明专利申请公开的“大鲵活性肽及用途”的方法制备，葡萄酿酒酵母为葡萄酒活性干酵母rv002；大鲵活性肽为原料总质量的2%，葡萄酿酒酵母为原料总质量的0.8%，加入糖调节原料总糖度为22度，在发酵物中加入二氧化硫，30℃发酵13d，每升发酵物（葡萄、大鲵活性肽、糖及酵母等）中二氧化硫加入量为90mg；
b.去除发酵液表面的残渣，在13℃继续发酵4d；
c.向发酵液中加入壳聚糖，壳聚糖添加量为发酵后产物（发酵后所有物质的总和）总体积的0.05%，在13℃放置11h，澄清得发酵液；
d.将发酵液在8℃温度下陈酿2.5个月，期间间断补充二氧化硫使发酵液中游离的二氧化硫含量为80mg/l（发酵液），然后进行膜过滤除菌，即得大鲵活性肽葡萄酒，酒精度为12%（v/v）。
实施例2：
a.将经清洗及干燥等处理的赤霞珠葡萄与大鲵活性肽为原料投入发酵罐中，接入葡萄酿酒酵母；大鲵活性肽按照中国专利申请号为201610314751.x的发明专利申请公开的“大鲵活性肽及用途”的方法制备，葡萄酿酒酵母为葡萄酒活性干酵母rv002；大鲵活性肽为原料总质量的3%，葡萄酿酒酵母为原料总质量的1.0%，加入糖调节原料总糖度为22度，在发酵物中加入二氧化硫，32℃发酵15d，每升发酵物（葡萄、大鲵活性肽、糖及酵母等）中二氧化硫加入量为70mg；
b.去除发酵液表面的残渣，在10℃继续发酵5d；
c.向发酵液中加入壳聚糖，壳聚糖添加量为发酵后产物（发酵后所有物质的总和）总体积的0.05%，在10℃放置12h，澄清得发酵液；
d.将发酵液在5℃温度下陈酿3个月，期间间断补充二氧化硫使发酵液中游离的二氧化硫含量为100mg/l（发酵液），然后进行膜过滤除菌，即得大鲵活性肽葡萄酒，酒精度为12%（v/v）。
实施例3：
a.将经清洗及干燥等处理的玫瑰香葡萄与大鲵活性肽为原料投入发酵罐中，接入葡萄酿酒酵母；大鲵活性肽按照中国专利申请号为201610314751.x的发明专利申请公开的“大鲵活性肽及用途”的方法制备，葡萄酿酒酵母为葡萄酒活性干酵母rv002；大鲵活性肽为原料总质量的2%，葡萄酿酒酵母为原料总质量的0.8%，加入糖调节原料总糖度为22度，在发酵物中加入二氧化硫，30℃发酵10d，每升发酵物（葡萄、大鲵活性肽、糖及酵母等）中二氧化硫加入量为100mg；
b.去除发酵液表面的残渣，在15℃继续发酵3d；
c.向发酵液中加入壳聚糖，壳聚糖添加量为发酵后产物（发酵后所有物质的总和）总体积的0.05%，在15℃放置10h，澄清得发酵液；
d.将发酵液在10℃温度下陈酿2个月，期间间断补充二氧化硫使发酵液中游离的二氧化硫含量为80mg/l（发酵液），然后进行膜过滤除菌，即得大鲵活性肽葡萄酒，酒精度为12%（v/v）。
实验：
以实施例1的方法但不加入大鲵活性肽获得的葡萄酒为对照品。
一.香气测定
采用搅拌棒吸附萃取-气相色谱-质谱联用法对本发明实施例1的大鲵活性肽葡萄酒以及对照品的香气成分分别进行测定，结果如表1。
表1
由表1可知，本发明实施例1的大鲵活性肽葡萄酒中香气成分中醇类、萜烯类、酸类、醛酮类以及其它物质分别为9、5、22、8、5、2种，总质量浓度分别为15778.18、3885.72、142549.03、51091.04、577.08、831.22μg/l。而对照品中香气成分中醇类、萜烯类、酸类、醛酮类以及其它物质分别为7、3、13、7、1、0种，总质量浓度分别为13004.09、1064.69、34400.20、18475.12、67.58、0μg/l。结果表明，本发明实施例1的大鲵活性肽葡萄酒香气成分总量高、种类多，与对照品相比葡萄酒香气更加浓郁。
二.大鲵活性肽葡萄酒保护二乙基亚硝胺（den）导致的小鼠肝损伤的作用
清洁级昆明种小鼠，体质量18～22g，雌雄各半，于12h黑暗，12h光亮的塑料饲养箱内饲养，室温20±2℃，湿度40%~60%，自由采食和饮水。48只小鼠随机分为6组：空白对照组、本发明实施例1的大鲵活性肽葡萄酒组、对照品组、大鲵活性肽葡萄酒+den组、对照品+den组以及den组。将本发明实施例1大鲵活性肽葡萄酒、对照品每天定时灌胃1次，5ml/（kg•bw），连续灌胃30d；
而大鲵活性肽葡萄酒+den组、对照品+den组，除按上述方法分别灌胃大鲵活性肽葡萄酒、对照品外，还需同时灌胃den50mg/kg•bw；den组单独灌胃den50mg/kg•bw。最后一次灌服药品后1h，摘眼球取血。将采集的全血于37℃恒温30min，然后于4℃冰箱中1h，在3000rpm下离心3min，分离血清，检测alt、ast以及mda指标，结果如表2。
表2
表2显示，本发明实施例1组（大鲵活性肽葡萄酒）的alt、ast以及mda指标与对照组的指标没有显著差异。实施例1+den组的alt、ast以及mda指标显著好于对照品+den组以及den组，表明本发明实施例1大鲵活性肽葡萄酒对肝脏无损害，可显著降低den对肝脏的损伤，具有保护肝脏的作用显著。
对各实验组进行肝组织切片检查，结果如图1。图1中a、b、c、d、e、f分别为对照组、实施例1组、对照品组、实施例1+den组、对照品+den组以den组。从图1中可以看出来，对照组与实施例1组小鼠肝细胞索状排列规则，肝细胞胞浆均匀，核仁清晰（图1a、b）。对照品组、对照品+den组以及den组肝细胞紊乱，有气球样变细胞，并伴有炎症细胞浸润现象（图1c、e、f）。实施例1+den组（图1d）的肝细胞细胞形状基本规则，有少量炎症细胞浸润。结果表明，本发明实施例1的大鲵活性肽葡萄酒对肝脏无损害，可降低den对肝脏的损伤，具有保护肝脏的作用。
三.大鲵活性肽葡萄酒调节肠道菌群作用的测定
将30只昆明小鼠中随机分成3组，每天分别采用生理盐水、大鲵活性肽葡萄酒、对照品对各组小鼠进行灌胃，灌胃量为0.2ml/10g，连续20d。最后一次灌胃24h后，采用拎尾法收集各组粪便于干燥无菌的离心管中，立即放于液氮中速冻。将速冻的小鼠粪便进行针对16srrna基因v4区采用v4通用引物进行pcr扩增及测序，对获得的数据进行生物信息学分析。
通过生物信息学进行对比发现，大鲵活性肽葡萄酒组和对照品组获得的粪便菌群与生理盐水组小鼠的粪便菌群有显著差异。在门的水平上，拟杆菌门（bacteroidetes）在大鲵活性肽葡萄酒组小鼠粪便菌群中的相对比例最高，为74.57%，对照品组为43.79%，生理盐水组为36.23%。小鼠肠道中的拟杆菌门（bacteroidetes）主要为拟杆菌纲（bacteroidia），拟杆菌门（bacteroidetes）是肠道内第二大优势类群，参与肠道内糖类、脂类的代谢，对宿主健康有很重要的影响，大鲵活性肽葡萄酒组的拟杆菌门（bacteroidetes）的显著增加，提示肠道中物质代谢存在一定程度的优化。厚壁菌门（firmicutes）在大鲵活性肽葡萄酒组小鼠粪便菌群中的相对比例达到38.27%，对照品组为17.94%，生理盐水组为16.54%。厚壁菌门（firmicutes）在肠道中能够帮助多糖发酵，厚壁菌门包括芽孢杆菌纲（芽孢杆菌目和乳杆菌目），其中芽孢杆菌属的主要作用是维持动物肠道的健康。本试验中小鼠粪便中的第二大优势菌就是厚壁菌门（firmicutes），表明大鲵活性肽葡萄酒能够参与小鼠糖类代谢，保持肠道菌群健康。而变形菌门（proteobacteria）在大鲵活性肽葡萄酒组小鼠粪便菌群中为4.47%，对照品组为6.37%，生理盐水组为7.34%。变形菌门（proteobacteria）是细菌中最大的一门，包括大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺旋杆菌等病原菌，这类细菌易引起动物腹泻。大鲵活性肽葡萄酒组变形菌门的大量减少，提示小鼠肠道中存在的炎症状态有所改善。