本发明属于药用植物活性成份的提取技术领域，具体涉及一种从南蛇藤茎中同时提取分离雷公藤内酯甲和雷公藤内酯乙的方法。
背景技术：
南蛇藤(celastrusorbiculatusthunb．)是卫矛科南蛇藤属植物，又名过山风，老牛筋（辽宁），降龙草（江苏），钻山龙（江西），穿山龙（福建）等。南蛇藤始载于清代《植物名实图考》，其根、藤茎、叶、果实和种子均可入药，主要分布于我国的东北、西北、华北、华东、西南、广东和两湖地区，药材资源极其丰富，且没有毒性。
传统中医认为其具有清热、祛风、除湿、活血解毒消肿的功效，常用于治疗风湿性关节炎、腰腿痛、筋骨痛、牙痛、闭经、痢疾、跌打损伤、肠风痔漏、毒蛇咬伤、疮疡、痈疖等症；现代药理研究表明南蛇藤具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等活性，目前多用于治疗风湿性及类风湿性关节炎、血液病及皮肤病。
近年来，许多学者对雷公藤内酯类的药理活性和临床应用进行深入而广泛的研究，发现雷公藤内酯甲具有很强的抗肿瘤及免疫抑制作用，雷公藤内酯乙也具有良好的药物活性。
目前，雷公藤内酯甲和雷公藤内酯乙的制备通常是从雷公藤药材中提取纯化获得；然而，由于雷公藤药材毒性大，产量低，严重影响了雷公藤内酯的提取产量，制约了雷公藤内酯活性成分的研究；此外，由于雷公藤药材中活性成分复杂，现有雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙的提取方法并不完善，提取收率极低，例如：中国专利cn105968168a公开了一种从雷公藤中提取分离雷公藤内酯甲的方法，虽然该方法比以往文献报道的提取工艺提高了10-20倍，但提取收率也仅为万分之一（即：10kg雷公藤最终提取约1.0g的雷公藤内酯甲）。
基于上述技术问题，有必要研究开发一种新的雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙的提取分离方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从南蛇藤茎中同时提取分离雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙的方法，以解决现有从雷公藤中提取雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙提取收率低，无法规模化生产的技术难题。
本发明通过研究发现南蛇藤中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙的含量较高，由于南蛇藤药材分布广，产量较大，且没有毒性，因此尝试从南蛇藤茎中提取分离雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙，本发明通过对有机溶剂的合理选择，最后成功的将雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙从成分复杂的南蛇藤中分离提取出来。
为实现上述目的，本发明具体是采用如下技术方案实现的：
步骤s1、南蛇藤茎粉碎成粗粉，加入其重量8-10倍量，体积百分比为95％的乙醇，回流提取2-3次，每次2-3h，合并提取液，浓缩，得粗提浸膏；
步骤s2、将步骤s1得到的粗提浸膏加适量水分散，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收溶剂至干，得乙酸乙酯萃取物；
步骤s3、将步骤s2得到的乙酸乙酯萃取物与重量为乙酸乙酯萃取物1.5-2倍的100~200目硅胶拌样后，上乙酸乙酯萃取物10倍量，200~300目硅胶柱，进行硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯[1：0→5：1→3：1]梯度洗脱，收集洗脱液，每个梯度合并成1个部分；
步骤s4、将步骤s3得到的石油醚-乙酸乙酯[5：1]部分的洗脱液回收溶剂至干，再经其重量8-10倍量，200～300目硅胶柱色谱分离，用石油醚-丙酮[15：1]洗脱，得到雷公藤内酯乙的结晶性粗品，再用石油醚-丙酮[10：1]洗脱，得到雷公藤内酯甲的结晶性粗品；
步骤s5、将步骤s4析出的雷公藤内酯甲的结晶性粗品用适量无水乙醇溶解后重结晶，得到雷公藤内酯甲的纯品；雷公藤内酯乙的结晶性粗品用适量无水乙醇溶解后重结晶，得到雷公藤内酯乙的纯品。
本发明的优点和有益效果为：
（1）本发明提供的从南蛇藤茎药材中提取分离雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙的方法，充分利用资源较广泛的南蛇藤药材，大大降低了制备成本，具有较高的社会经济效益；此外，相比从毒性大、价格高、收率低的雷公藤中制备雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙的方法，该方法提取雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙提取收率可达千分之一，具有提取收率高，操作安全等特点。
（2）与现有技术相比，本发明提取分离雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙时所采用的提取溶剂为乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、丙酮和水，毒性小，工艺简便可行，适用于工业化大生产，且所用溶剂易回收、可反复使用，对环境污染较小，所得最终产物经乙醇重结晶后基本不含有机溶剂残留，所得的雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙纯品为下一步药物的研发和应用奠定了基础。
附图说明
图1为雷公藤内酯甲1h-nmr谱图。
图2为雷公藤内酯甲13c-nmr谱图。
图3为雷公藤内酯乙1h-nmr谱图。
图4为雷公藤内酯乙13c-nmr谱图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
仪器与试药
仪器：熔点用x－4型显微熔点测定仪测定；bukerav500mz核磁共振谱仪，英国micromassgctei-ms；薄层和柱色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂出品；色谱用试剂均为上海沪试化工厂生产，ar级。
试药与试剂：南蛇藤茎药材（产地：吉林松原）；乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚和丙酮为分析纯；水为超纯水。
实施例1
一种从南蛇藤茎中同时提取分离雷公藤内酯甲、雷公藤内酯乙的方法，具体包括以下步骤：
步骤s1、南蛇藤茎10kg粉碎成粗粉，加入其重量10倍量，体积百分比为95％的乙醇，回流提取3次，每次3h，提取液合并，浓缩，得粗提浸膏约1kg；
步骤s2、将步骤s1得到的粗提浸膏加适量（约5l）水分散，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收溶剂至干，得乙酸乙酯萃取物410g；
步骤s3、将步骤s2得到的乙酸乙酯萃取物（400g）与重量为乙酸乙酯萃取物1.5-2倍的100~200目硅胶拌样后，上乙酸乙酯萃取物10倍量，200~300目硅胶柱（柱内径为14cm），进行硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯[1：0→5：1→3：1]梯度洗脱，每个梯度洗脱40l，收集洗脱液，每个梯度合并成1个部分；
步骤s4、将步骤s3得到的石油醚-乙酸乙酯[5：1]部分的洗脱液回收溶剂至干（65g），再经其重量8-10倍量硅胶（200～300目）柱色谱分离（柱内径为8cm），用石油醚-丙酮[15：1]洗脱10l，得到雷公藤内酯乙的结晶性粗品（16.5g）；再用石油醚-丙酮[10：1]洗脱10l，得到雷公藤内酯甲的结晶性粗品（12.8g）；
步骤s5、将步骤s4析出的雷公藤内酯乙的结晶性粗品用适量（100-200ml）无水乙醇溶解后重结晶，得到雷公藤内酯乙的纯品（8.3g）；雷公藤内酯甲的结晶性粗品用适量（100-200ml）无水乙醇溶解后重结晶，得雷公藤内酯乙的纯品（12.5g）。
雷公藤内酯甲的结构鉴定：
雷公藤内酯甲：无色方晶，易溶于氯仿，溶于甲醇；libermann-burchard反应阳性。mp.320-322℃，ei-msm/z(%):454(m+,0.12),436(m-h2o,1.27),285(m-c11h21o,1.25),246(m-c14h24o2,100),190(m-c18h24o3，16.06),119(m-c21h35o3，39.82)；
1h-nmr(500mhz，cdcl3)δ：0.78（3h,s），0.87（3h,s），0.93（3h,s），0.94（3h,s），0.99（3h,s），1.07（3h,s），1.20（3h,s），3.22（1h,dd，j=3.8,11.2hz），5.29（1h,t，j=3.5hz），4.14（1h,d，j=5.5hz），见图1；
13c-nmr(125mhz，cdcl3)δ：39.3(c-1),27.2(c-2),78.9(c-3),38.8(c-4),55.3(c-5),18.3(c-6),33.2(c-7),39.9(c-8),47.6(c-9),37.1(c-10),23.5(c-11),124.6(c-12),140.3(c-13),42.6(c-14),27.2(c-15),24.4(c-16),33.9(c-17),43.5(c-18),38.7(c-19),43.5(c-20),39.3(c-21),83.1(c-22),28.1(c-23)，15.6(c-24),15.6(c-25),16.9(c-26),25.2(c-27),21.0(c-28),24.1(c-29),182.3(c-30)，见图2。其nmr数据与文献[于东防，朱海涛，陈麒.雷公藤中三萜内酯a分子结构的研究[j].中草药，1993，23（4）：171-174]基本一致，化学结构式如下：
雷公藤内酯甲；
雷公藤内酯乙的结构鉴定：
雷公藤内酯乙：无色方晶，易溶于氯仿，溶于甲醇；libermann-burchard反应阳性。mp.310-312℃;
1hnmr(cdcl3,500mhz):0.87(3h,s,ch3),0.97(3h,s,ch3),1.04(3h,s,ch3),1.04(3h,s,ch3),1.09(3h,s,ch3),1.11(3h,s,ch3),1.20(3h,s,ch3),5.32（1h，t，j=3.5hz,12-h），4.14(1h，d，j=5.4hz,22-h)，见图3；
13c-nmr(cdcl3,125mhz):39.9(c-1),35.3(c-2),217.5(c-3),47.3(c-4),55.1(c-5),19.7(c-6),32.6(c-7),39.8(c-8),46.8(c-9),36.7(c-10),24.3(c-11),124.4(c-12),140.4(c-13),42.7(c-14),27.2(c-15),23.9(c-16),34.0(c-17),46.7(c-18),38.3(c-19),43.6(c-20),36.7(c-21),83.0(c-22),26.8(c-23),21.4(c-24),15.5(c-25),16.9(c-26),25.7(c-27),23.5(c-28),21.4(c-29),182.2(c-30)，见图4。其nmr数据与文献[秦国伟，杨学敏，顾文华，等.雷公藤中两种新三萜内酯—雷公藤内酯甲和乙的结构[j].化学学报，1982，40：637]报道一致，化学结构式如下：
雷公藤内酯乙。