本发明涉及医药技术领域，特别涉及从植物中提取的环烯醚萜化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
茜草科耳草属植物在我国有50多种，其20多种药用，大多为清热解毒类中药，用于治疗感冒，多种炎症及癌症。黄毛耳草(herbahedyotidschrysotrichae)又名石打穿，用于治疗病毒性肝炎、跌打损伤、小儿急性肾炎、风湿性关节炎、疮疔肿痛和各种癌症。
技术实现要素：
本发明从植物中提取出具有生物活性的环烯醚萜类化合物，并提供了其在制备治疗疼痛或急性炎症的药物中的应用。具体地说，本发明提供了环烯醚萜类化合物，其结构如式i所示：
或其可药用盐
其中：
r2为coor5，r3为羟基或烷氧基，可以是c1-c6烷氧基，例如c1-c4烷氧基或c1-c3烷氧基，且r4为r6-oh；
或者r2、r3结合为内酯，可以是具有5-7个环原子的内酯，例如具有5、6或7个环原子的内酯，且r4为c1-c6亚烷基oc(o)r7，其中的亚烷基例如c1、c2、c3、c4、c5、c6亚烷基，如亚甲基；
r1为糖基，优选糖基选自葡萄糖基、半乳糖基、甘露糖基、阿拉伯糖基、木糖基、核糖基、来苏糖基和夫糖基或其他多羟基化合物基团；
r5为c1-c6烷基，例如c1-c4烷基或c1-c3烷基，如甲基；r6为c1-c6亚烷基、亚杂环基或亚苯基，所述亚烷基例如c1、c2、c3、c4、c5、c6亚烷基，如亚甲基；r7为c1-c6烷基或c6-c10芳基，所述烷基例如c1-c4烷基或c1-c3烷基，如甲基，所述芳基例如苯基、萘基。
所述化合物例如：
化合物1
化合物2
在一个实施方案中，所述化合物是化合物1和/或化合物2。
在另一个实施方案中，所述化合物是化合物1和/或化合物2以外的式i化合物。
本发明还提供了上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)黄毛耳草带根全草或有效部位，如根、茎、叶，可以剪成1-2cm小段，用乙醇水溶液回流提取，例如用10倍量95%乙醇水回流提取2次，例如每次2h，合并提取液，过滤，回收乙醇，例如回收乙醇至0.5-1倍量药材体积左右，静置沉淀，过滤，得过滤液；
(2)过滤液依次用三氯甲烷、醋酸乙酯萃取，例如萃取3次，例如每次100ml，合并相同萃取液，得萃取后水层液。
(3)水层液浓缩至干，加甲醇溶解，硅胶拌样，挥发甲醇至干，上硅胶色谱柱分离，三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，分别收集并合并含主要成分的馏分，例如可以每50ml收集，收集合并馏分12-25（含化合物1），29-42（含化合物2），回收溶剂至干，甲醇分别溶解后上sephadexlh-20柱纯化，以甲醇洗脱，分别收集合并含主要成分的馏分，例如可以每50ml收集，收集合并馏分4-7，在收集馏分的过程中，可以对收集的馏分进行薄层色谱试验（展开剂可以为三氯甲烷-甲醇（4∶1），香草醛—硫酸试剂显色），随后结晶，例如可以用氮气吹至少量体积，可在4℃冷藏结晶，过滤，甲醇清洗结晶；结晶复用甲醇溶解，重结晶，例如可以用氮气吹至少量体积，可在4℃重结晶，过滤，甲醇冲洗，干燥，得化合物，其中包括化合物1和化合物2。所得化合物可进行进一步的结构修饰和转化，得到结构类似的衍生物。
发明人通过理化性质和现代波谱学手段(uv、ir、ms、1h-nmr、13c-nmr和2d-nmr)对分离得到的化合物进行了结构鉴定，证实其为结构如式i所示的环烯醚萜化合物。
本发明的另一个目的在于提供一种式i所示化合物在制备治疗疼痛药物中的应用。所述疼痛例如急性疼痛、亚急性疼痛、神经性疼痛、全身性疼痛；所述疼痛例如由炎症引起。
本发明的另一个目的在于提供一种式i所示化合物在制备治疗或消除急性炎症药物中的应用。急性炎症例如浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎和出血性炎。
本发明的再一个目的在于提供一种药物组合物，包含上述式i所示化合物。
本发明还提供了一种治疗疼痛或者治疗或消除急性炎症的药物组合物，含有治疗有效量的上述式i化合物以及一种或多种药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，所述药物或组合物不含除所述式i化合物以外的其它治疗活性成分。
在一个实施方案中，所述药物或组合物不含除所述式i化合物以外的其它的黄毛耳草成分。
附图说明
图1是化合物1的质谱；
图2是化合物1的氢谱；
图3是化合物1的碳谱；
图4是化合物2的质谱；
图5是化合物2的氢谱；
图6是化合物2的碳谱。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1本发明化合物的制备
(1)干燥的黄毛耳草带根全草，剪成1-2cm小段，10倍量95%乙醇水回流提取2次，每次2h，合并提取液，过滤；回收乙醇至0.5-1倍量药材体积左右，静置沉淀，过滤，得过滤液；
(2)过滤液依次用三氯甲烷、醋酸乙酯萃取，萃取3次，每次100ml，合并相同萃取液，得萃取后水层液；
(3)水层液浓缩至干，加甲醇溶解，硅胶拌样，挥发甲醇至干，上硅胶色谱柱分离，三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，分别收集并合并含主要成分的馏分，每50ml收集，收集合并馏分12-25（含化合物1），29-42（含化合物2），回收溶剂至干，甲醇分别溶解后上sephadexlh-20柱纯化，以甲醇洗脱，分别收集合并含主要成分的馏分，每50ml收集，收集合并馏分4-7，在收集馏分的过程中，对收集的馏分进行薄层色谱试验（展开剂为三氯甲烷-甲醇（4∶1），香草醛—硫酸试剂显色）；氮气吹至少量体积，4℃冷藏结晶，过滤，甲醇清洗结晶；结晶复用少许甲醇溶解，氮气吹至少量体积，4℃重结晶，过滤，甲醇冲洗，干燥，得化合物，包括化合物1和化合物2。
实施例2本发明化合物的结构鉴定
化合物1：esi-msm/z:437.1059[m+na]+。1h-nmr(500mhz,cd30d)δ:7.30(1h,d,j=2.05hz,h-3),5.95(1h,d,j=1.05hz,h-1),5.73(1h,s,h-7),5.56(1h,d,j=6.6hz,h-6),4.79(1h,dd,j=1.0,14.3hz,h-l′),4.68-4.64(2h,t,h-10a,10b),3.92(1h,dd,j=2.1,11.85hz,h-6′a),3.68-3.65(2h,m,h-6′b,5),3.39-3.17(5h,m,h-3′,5′,4′,9,2′),2.07(3h,s,ch3coo);13c-nmr(500mhz,cd30d)δ:172.56(c-11),172.23(ch3co),150.27(c-3),144.29(c-8),128.93(c-7),106.18(c-4),100.02(c-1′),93.31(c-1),86.30(c-6),78.38(c-3′),77.889(c-5′),74.65(c-2′),71.60(c-4′),62.80(c-6′),61.91(c-10),45.27(c-9),37.45(c-5),20.62(ch3)。
高分辨质谱分子量分析，化合物1分子量为414.1059，分子式为c18h22o11，相似度99.14%。经查新化合物1与化合物asperuloside（车叶草苷）有相同的13c化学位移，13c化学位移相似度100%，13c化学位移数据见表1。结合1h-nmr谱，确定化合物1为asperuloside（车叶草苷）。
表1化合物1与asperuloside（车叶草苷）13c化学位移比较
化合物1asperuloside（车叶草苷）
化合物2:esi-msm/z:427.1213[m+na]+。1h-nmr(500mhz,cd30d)δ:7.54(1h,s,h-3),5.83(1h,s,h-7),5.22(1h,d,j=6.0hz,h-1),4.70(1h,d,j=8.0hz,h-1′),4.58(1h,t,j=1.0hz,h-6),4.37(1h,d,j=15.2hz,h-10a),4.22(1h,d,j=15.0hz,h-10),3.90(1h,d,j=11.0hz,h-6′a),3.66(1h,dd,j=5.0,11.0hz,h-6′b),3.78(3h,s,och3),3.22～3.41(4h,m,h-2′,3′,4′,5′),3.01～3.08(2h,m,h-5,9);13c-nmr(500mhz,cd30d)δ:170.301(c-11),153.848(c-3),147.518(c-8),130.147(c-7),110.836(c-4),100.335(c-1′),98.367(c-1),82.302(c-6),78.424(c-3′),77.902(c-5′),74.801(c-2′),71.555(c-4′),62.708(c-6′),61.046(c-10),52.042(och3),47.164(c-9),45.637(c-5)。
高分辨质谱分子量分析，化合物2分子量为404，分子式为c17h24o11，相似度99.83%。经查新发现scandosidemethylester（鸡矢藤次苷甲酯）与化合物2有相同的13c化学位移，相似度为100%，13c化学位移数据见表2。结合1h-nmr谱，确定化合物2为scandosidemethylester（鸡矢藤次苷甲酯）。
表2化合物2与scandosidemethylester（鸡矢藤次苷甲酯）13c化学位移比较
化合物2scandosidemethylester（鸡矢藤次苷甲酯）
实施例3本发明化合物治疗疼痛药物检测
胚胎收集的标准步骤：斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行。每次交配准备4~5对成年斑马鱼，平均每对能产200~300个胚胎。在受精后6小时（即6hpf）和24hpf对胚胎进行清理（移除已死亡胚胎），并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎（kimmeletal.1995）。在28℃条件下用养鱼用水孵育胚胎（养鱼用水水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480~510μs/cm；ph为6.9~7.2；硬度为53.7~71.6mg/lcaco3）。因为胚胎可以从自身的卵黄囊中获取营养物质，所以在受精后9天内（9dpf）不需要喂食。用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死，麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会（avma）对动物麻醉处死的规范要求。
1.确定化合物的最大耐受浓度（mtc）
斑马鱼品系：野生型ab系；
正常对照组：养鱼用水处理正常斑马鱼；
模型对照组：用冰乙酸处理斑马鱼，建立斑马鱼疼痛模型；
供试品组：供试品的五个初始检测浓度分别为：1、10、100、250和500μg/ml；供试品以水溶给样方式处理疼痛模型斑马鱼；
每个实验组均为30尾斑马鱼，在28℃培养箱中孵育；
供试品处理结束后，统计各实验组的斑马鱼死亡数量与毒性情况，确定供试品的最大耐受浓度（mtc）；
如果在最初的浓度检测实验中不能得到mtc，将扩大供试品的检测浓度范围，上限为2000μg/ml或供试品最大溶解度，下限为0.1μg/ml。
所需斑马鱼数目：至少需要210尾斑马鱼.
结果：结果显示，100、250和500μg/ml可明显减少冰乙酸导致的斑马鱼异常运动。
2.评价化合物的镇痛作用
斑马鱼品系：野生型ab品系；
正常对照组：养鱼用水处理正常斑马鱼；
模型对照组：用冰乙酸处理斑马鱼，建立斑马鱼疼痛模型；
供试品组：依据1.的实验结果，选取3个浓度进行评价（通常为1/9mtc、1/3mtc和mtc）；供试品以水溶给样方式处理疼痛模型斑马鱼；
阳性药物对照组：阿司匹林；
每个实验组均处理30尾斑马鱼，28℃培养箱中孵育；
若供试品有镇痛效果，则会减缓冰乙酸所致疼痛引起的斑马鱼异常运动次数增加。供试品处理结束后，利用斑马鱼行为分析仪检测斑马鱼的运动次数（n），评价供试品的镇痛作用，统计学处理结果以
供试品对疼痛缓解作用计算公式如下：
统计学分析采用方差分析和dunnett’st-检验，p<0.05为显著性差异；p<0.01为极显著性差异。
3.结果
在冰乙酸所致疼痛引起的斑马鱼异常运动次数实验中，与模型对照组相比,化合物1和2中、高剂量对冰乙酸所致疼痛引起的斑马鱼有明显的抑制作用。模型对照组、阳性对照药组、化合物1和2低、中、高剂量组的斑马鱼冰乙酸异常运动实验结果见表3：
抑制率（%）=（用药组异常运动均数-模型组异常运动均数）/模型组异常运动均数。
表3.化合物对斑马鱼疼痛的影响（
与模型对照组比较，*p<0.05,**p<0.01.
4.结论
本实验以用冰乙酸处理斑马鱼，建立斑马鱼疼痛模型，本发明化合物中、高剂量组对冰乙酸引起斑马鱼疼痛具有明显的抑制作用。本发明化合物均表现出明显的镇痛作用。所述疼痛例如急性疼痛、亚急性疼痛、神经性疼痛、全身性疼痛；所述疼痛例如由炎症引起。
本发明以斑马鱼为实验对象，冰乙酸所致疼痛引起的斑马鱼异常运动次数来评价供试品的镇痛作用，以上所述仅是本发明的优选实施方式，还可以小鼠、大鼠等为实验对象，通过化学刺激和热刺激引发疼痛的动物模型对其镇痛药理活性进行研究。本发明制备得到的耳草属植物中环烯醚萜化合物可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防、治疗、协同治疗疼痛的药物。所述药物可以为微乳、注射剂、片剂、胶囊剂、栓剂、口服液等形式。
实施例4本发明化合物消除急性炎症反应药物检测
1.对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀炎症模型的作用
spf级昆明小鼠，体质量18～22g，雌雄各半，本实验采用sc给药方式，实验低、中、高3个剂量浓度分别设置为25、50、100mg/kg。昆明种小鼠80只，根据体质量和性别随机分为8组：模型对照组，氢化可的松阳性对照组（25mg/kg）组，化合物1低、中、高剂量组，化合物2低、中、高剂量组，每组10只。每天给药1次，连续给药5d。最后一次给药40min后，10μl二甲苯均匀涂于小鼠右耳内外侧，左耳涂以同样体积的蒸馏水作对照。40min后重复一次，再过40min后脱颈处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径8mm的打孔器分别在两耳同一部位打下圆耳片，迅速用电子天平秤质量，每只小鼠右耳片减去左耳片质量即为耳片炎症肿胀度，计算耳肿胀率和耳肿胀抑制率。
耳肿胀率＝（右耳片质量－左耳片质量）/左耳片质量
耳肿胀抑制率＝（对照组平均肿胀率－给药组平均肿胀率）/对照组平均肿胀率
2.结果
与模型对照组比较，氢化可的松阳性对照组，化合物1的50、100mg/kg组，化合物2的50、100mg/kg组对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用（p<0.05为显著性差异；p<0.01为极显著性差异。），表明化1和化2可以剂量依赖性的改善二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，结果见表4。
表4.化合物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的拮抗作用(
与模型对照组比较，*p<0.05,**p<0.01.
3.结论
本实验以小鼠急性炎症模型为研究对象，50、100mg/kg的化合物1和2对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀的急性炎症均具有明显的抑制作用，抑制率分别为26.3%、51.5%；24.3%，44.5%。本发明化合物对于急性炎症模型有较好的抑制作用。急性炎症例如浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎和出血性炎。
本发明以斑马鱼为实验对象，冰乙酸所致疼痛引起的斑马鱼异常运动次数来评价供试品的镇痛作用，仅是本发明的优选实施方式，还可以小鼠、大鼠等为实验对象，通过化学刺激和热刺激引发疼痛的动物模型对其镇痛药理活性进行研究。本实验以二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀的急性炎症模型为研究对象来评价供试品的急性炎症消除作用，仅是本发明的优选实施方式。
本发明制备得到的耳草属植物中环烯醚萜化合物可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防、治疗、协同治疗疼痛的药物或急性炎症的药物。所述药物可以为微乳、注射剂、片剂、胶囊剂、栓剂、口服液等形式。配制好的药物可以通过常规途径给药。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进或补充，这些改进或补充也应视为本发明的保护范围。
尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。