本发明公开了一个抗白粉病的黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料，并提供了一个与该渐渗系材料中抗白粉病基因共分离的分子标记，属于蔬菜分子遗传育种技术领域，可用于黄瓜白粉病抗性分子标记辅助育种。
技术背景
黄瓜是我国大面积栽培的主要蔬菜之一，具有极高的社会价值和经济效益。黄瓜白粉病是一种广泛发生的世界性病害，是黄瓜主要叶部病害之一。在中国，白粉病与霜霉病、蔓枯病并列为黄瓜三大病害，具有潜育期短，再侵染频繁，流行性强和周年发生等特点，给黄瓜生产带来严重经济损失。防治黄瓜白粉病最经济有效的方法就是培育抗病品种，因此抗白粉病育种成为黄瓜抗病育种的主要目标之一。
由于研究者所用材料不同、抗病鉴定方法和标准各异、白粉病菌的致病类型和生理分化不清楚等因素，致使黄瓜白粉病抗性的遗传机制仍然存在诸多分歧和不足，至今没有实现黄瓜白粉病抗性基因的精细定位。目前，黄瓜抗白粉病材料或品种的选育主要依靠田间自然发病或苗期接种的方法进行表型鉴定，该方法不仅耗时长，需要大量的人力和物力，且容易受外界条件的影响，表型选择效率不高，选育难度大，育成的黄瓜品种存在白粉病抗性不稳定，易受栽培环境影响等弊端。近年来，随着分子标记技术的发展，许多研究者利用与目标性状qtl或基因紧密连锁的分子标记对种质进行辅助选择，这一方法不受基因表达和环境因素的影响，可在早代进行选择且操作简单，很大程度上提高了选择的速度和准确性。其中snp(singlenucleotidepolymorphism)分子标记是一种基于全基因组重测序开发的新的分子标记，由单碱基突变引起的dna序列多态性，因其在基因组内分布广、密度大、稳定性和多态率高，检测容易，重复性好、对dna质量要求较低等优点，可以高效准确地用于遗传图谱构建，利用与目标性状连锁的分子标记进行辅助育种。
基于上述目的，本发明公布了一个对白粉病具有完全抗性的黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料，并开展了黄瓜-酸黄瓜白粉病抗性遗传机制和抗白粉病基因定位研究。以感白粉病自交系‘长春密刺’为母本，抗白粉病黄瓜-酸黄瓜渐渗系‘il52’为父本，构建了ril(recombinantinbredline)群体和f2群体，利用ril群体对黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗白粉病基因进行初定位，同时结合双亲重测序结果开发分子标记，利用f2群体对抗白粉病基因进行精细定位，并筛选到与黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗白粉病基因共分离的snp6标记，该标记可为黄瓜白粉病分子标记辅助选择育种提供新型、高效、实用的分子标记。
技术实现要素：
(一)技术问题
本发明涉及一个与黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗白粉病基因共分离的分子标记，目的是为后续的抗白粉病基因的克隆与功能研究，以及黄瓜抗白粉病新材料的创制提供基础，加快黄瓜优良品种选育和基因功能组学的研究进程。
(二)技术方案
本发明提供的一种与黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗白粉病基因共分离的分子标记的特征在于：有一个snp标记与黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗白粉病基因完全共分离，所述snp分子标记引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，
snp6：正向引物snp6-f：5′tttcttgtacaggggaaggtgg3′，
反向引物snp6-r：5′tgttttggtcaggcaaagggt3′。
上述引物用于鉴定黄瓜种质材料白粉病抗性的具体方法为：
(1)以待鉴定材料的dna作为模板，用snp6分子标记引物对进行pcr扩增；
(2)pcr扩增反应体系组成为：2×taqmastermix10.0μl，ddh2o5.0μl，正、反向引物各2.0μl，dna(10ng)1.0μl，反应总体积为20μl。反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min20s，共35个循环；72℃延伸7min，4℃保存；
(3)pcr产物检测：以反向引物snp6-r作为测序引物，将反应产物送到一代测序公司进行sanger法测序(双脱氧末端终止法测序)分析。测序结果如果能在序列tgcctctcttcttctctcttttgca[t/c]tcttttttcctttcttggtaattct中间位置处检测到纯合的c/c碱基的植株则为含有抗白粉病基因的植株。
(三)有益效果
(1)通过筛选获得一个与黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗白粉病基因共分离的分子标记snp6，为分子标记辅助育种和克隆基因奠定了基础。利用本发明中与黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗白粉病基因紧密连锁的分子标记snp6，进行抗白粉病基因的鉴定，在包含193个单株的样品中选择效率为100％。
(2)通过本发明分子标记定位的基因位点精确，鉴定方便。由于这个标记与黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗白粉病基因完全共分离，因此，在苗期就可以用上述的分子标记方法测定植株的白粉病抗性，有效解决了表型鉴定结果可靠性低、费时、成本高、难度大等问题，简便又快速。
(3)本发明提供的分子标记可广泛应用于分子辅助育种中黄瓜抗白粉病基因的分子检测，实现基因的产业化分子育种。
附图说明
图1：感白粉病自交系‘长春密刺’(左边植株)与抗白粉病黄瓜-酸黄瓜渐渗系‘il52’(右边植株)在田间自然发病情况下的白粉病抗性表现
经过2016年春季，2017年春季对‘长春密刺’(左边植株)和黄瓜-酸黄瓜渐渗系‘il52’(右边植株)进行成株期白粉病田间自然发病鉴定，发现‘长春密刺’极感白粉病，黄瓜-酸黄瓜渐渗系‘il52’免疫白粉病。
图2：利用155个ril群体对抗白粉病基因pm进行初定位(a)和193f2群体对pm近一步定位(b)
利用155个ril(长春密刺×il52)群体的连锁图和白粉病表型统计结果，将抗白粉病基因pm初定位在5号染色体上indel73和indel83之间，利用双亲重测序结果在indel73和indel83区间内部继续开发新的ssr、indel和snp标记，结合193株f2(长春密刺×il52)群体的连锁图和白粉病表型统计结果，将抗白粉病基因pm精细定位在5号染色体17id185和17id211之间，两标记之间遗传距离为0.5cm，物理距离为468-kb，其中分子标记snp6与抗白粉病基因pm完全共分离。
图3：‘长春密刺’，f1(长春密刺×il52)和‘il52’在分子标记snp6处的碱基类型
以snp6-r位测序引物，通过对‘长春密刺’，f1(长春密刺×il52)和‘il52’以snp6-f/snp6-r引物对的pcr扩增产物进行sanger法测序(双脱氧末端终止法测序)分析，发现在序列tgcctctcttcttctctcttttgca[t/c]tcttttttcctttcttggtaattct中间位置处，‘长春密刺’扩增出纯合的t/t碱基，其表型为感白粉病；f1(长春密刺×il52)扩增出杂合的t/c碱基，其表型为感白粉病；‘il52’扩增出纯合的c/c碱基，其表型为抗白粉病。
具体实施方式
2016年春季对‘长春密刺’，‘il52’，f1(长春密刺×il52)和“长春密刺×il52”构建的155个ril群体进行白粉病抗性表型鉴定，2017年春季对‘长春密刺’，‘il52’，f1(长春密刺×il52)以及‘长春密刺×il52’构建的155个ril群体和193个f2群体进行白粉病抗性表型鉴定，计算抗、感表型分离比，进行白粉病抗性遗传分析，发现‘长春密刺’感白粉病，‘il52’抗白粉病(图1)，f1(长春密刺×il52)感白粉病，ril群体中抗、感分离比符合1∶1(χ2＝0.316，p＝0.574)，f2群体中抗、感分离比符合1∶3(χ2＝0.085，p＝0.771)(表1)，表明‘il52’中的白粉病抗性是由一个单隐性基因pm控制。
表1黄瓜-酸黄瓜渐渗系il52中白粉病抗性遗传规律
选用1440对ssr引物和190对indel引物在‘长春密刺’和‘il52’之间进行多态性引物筛选，最终197对ssr引物和19对indel引物在155个ril(长春密刺×il52)群体中进行pcr扩增，用joinmap4.0构建连锁图谱，并初定位‘il52’中抗白粉病基因pm。结果显示，pm初定位于5号染色体上标记indel73和indel82之间(图2a)。结合亲本重测序数据在pm附近开发新的ssr、indel和snp标记，利用193个f2(长春密刺×il52)群体对pm进行精细定位，最终将pm定位在标记17id185和17id211之间(图2b)，两标记之间遗传距离为0.5cm，物理距离为468-kb，并鉴定到与pm完全共分离的分子标记snp6。
1、与pm共分离的分子标记引物设计
在上述分子标记连锁图谱构建和黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料il52抗白粉病基因pm发掘的研究中，分子标记snp6与pm完全共分离。该标记引物是通过双亲全基因组重测序，利用samtools软件检测长度为1-bp且在双亲基因组间发生突变的位点，并根据该位点上下游200-bp的序列，用premier5.0软件设计而成。
标记snp6引物序列为：snp6-f：5′tttcttgtacaggggaaggtgg3′，
snp6-r：5′tgttttggtcaggcaaagggt3′。
2、标记引物snp6-f/snp6-r在f2群体中的分子检测
为了验证该分子标记的准确性，本实验室利用snp6-f/snp6-r引物在193个f2(长春密刺×il52)群体中进行pcr扩增，然后以snp6-r为测序引物对扩增产物进行sanger法测序，在序列tgcctctcttcttctctcttttgca[t/c]tcttttttcctttcttggtaattct中间位置上检测碱基类型，再结合单株的表型鉴定结果进行可靠性分析。结果显示，‘长春密刺’的碱基类型为纯合t/t，‘il52’的碱基类型为纯合c/c，f1(长春密刺×il52)的碱基类型为杂合t/c，与其表型完全对应(图3)，并且在193个f2(长春密刺×il52)群体中的基因型与其表型完全吻合，符合抗(c/c)∶感(t/c)∶感(t/t)＝1∶2∶1分离比(表2)，表明分子标记snp6与pm完全共分离。
pcr扩增反应体系组成为：2×taqmastermix10.0μl，ddh2o5.0μl，正、反向引物各2.0μl，dna(10ng)1.0μl，反应总体积为20μl。反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min20s，共35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。pcr产物检测：以snp6-r为测序引物，将反应产物送到一代测序公司进行sanger法测序。
表2‘长春密刺’，‘il52’，f1和193个f2群体在分子标记snp6处的基因型与其表型鉴定结果