杂交瘤细胞株、制备方法、单克隆抗体、应用及试剂盒与流程

本发明涉及动物基因工程技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株、制备方法、单克隆抗体、应用及试剂盒。

背景技术：

目前在临床上应用较广泛的诊断方法有直肠检查和超声波检查。但直肠检查一般都在母牛配种60d进行，有的甚至时间更长才能做出诊断，这样不仅影响了母牛的繁殖周期，而且，还影响到母牛生产性能的发挥。而超声波检测法成本高，且易感染。有的牛场在使用但是尚未广泛推广的牛妊娠相关蛋白(pag)elisa试剂盒能在妊娠后28d做出较为可靠的判断。但这些方法均只能在奶牛人工授精三周后做出准确诊断。而研究表明，如果人工授精后一个情期内(三周)能排查出空怀牛，即可对其进行快速的同期发情处理，在第21-23d进行复配，减少空怀天数，提高奶牛的繁殖效率，因此从某种程度上来讲，能否于奶牛人工授精后一个情期内判断奶牛妊娠或者空怀，是缩短奶牛产犊间隔和提高繁殖率的关键。

结合珠蛋白(haptoglobin；hp)又称触珠蛋白，是一种急性期蛋白广泛存在于人类和许多哺乳动物的血清及其他体液中，在妊娠初期能够在母体与胚胎之间传递信号。另外，有学者进一步研究发现妊娠期和非妊娠期的子宫内膜组织中均有hp蛋白分泌，但以蜕膜组织中含量最为丰富，分泌期内膜次之，增殖期内膜最低，因而推测hp可能是重要的妊娠相关蛋白。触珠蛋白正在作为一种新的标志性蛋白被人们关注，但该蛋白在奶牛早期妊娠上的作用机理和功能应用上很大程度还是未知。

因此，亟需一种奶牛hp蛋白相关的奶牛早期妊娠诊断方案，并能实现在奶牛人工授精后一个情期内准确判断奶牛妊娠或者空怀。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种杂交瘤细胞株、制备方法、单克隆抗体、应用及试剂盒，实现在奶牛人工授精后一个情期内准确判断奶牛妊娠或者空怀。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株：所述杂交瘤细胞株为cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株和cctccno：c201858的杂交瘤细胞株的组合。

本发明还公开了一种如所述的一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法：

以奶牛rna为模板扩增hp基因片段；

将扩增到的hp基因插入到杆状病毒转移质粒pfastbachtb的ncoi和hindiii位点构建为重组转移质粒pfastbachtb-hp；

将该重组转移质粒pfastbachtb-hp转化至含有杆状病毒骨架质粒的dh10bac感受态细胞，通过同源重组将hp基因整合至杆状病毒骨架质粒bacmid中；

将筛选、纯化后的重组穿梭载体转染到sf9昆虫细胞中，待出现细胞病变后收集细胞上清即获得重组杆状病毒rbacmid-hp；

用重组杆状病毒rbacmid-hp表达的hp蛋白过柱纯化后作为免疫抗原免疫小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤融合，再经3次亚克隆筛选到能稳定分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别是：3b12、4f4、4f11、5d7、5g8、7e5、10c3、12f9；筛选出一对配对的杂交瘤细胞株：4f11和12f9；筛选出的杂交瘤细胞株4f11即为cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株，筛选出的杂交瘤细胞株12f9即为cctccno：c201858的杂交瘤细胞株。

本发明还公开了一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体：所述分泌抗hp蛋白的单克隆抗体选自配对的两种单克隆抗体：一种为cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，另一种为cctccno：c201858的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

本发明还公开了一种如所述的分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的制备方法：向小鼠腹腔注射分别选自如所述的杂交瘤细胞株4f11和12f9的杂交瘤细胞，一段时间后采集小鼠腹水，离心纯化后获得所述分泌抗hp蛋白的单克隆抗体。

本发明还公开了一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体在奶牛早期妊娠检测的应用：所述分泌抗hp蛋白的单克隆抗体选自cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和cctccno：c201858的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

本发明还公开了一种用于奶牛早期妊娠检测的双抗夹心elisa试剂盒：所述试剂盒包括：包被有cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的酶标板，以及辣根过氧化物酶标记cctccno：c201858的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

在上述技术方案的基础上，所述试剂盒还包括：

底物液：100mmol/l的柠檬酸溶液：24.3ml，200mmol/l的na2hpo4.12h2o：25.7ml混匀，加入50mg的四甲基联苯胺，临用前加入50μl的30％h2o2；

终止液：蒸馏水177.8ml和浓硫酸22.2ml；

洗涤液：1000ml10mmol/lph7.4的pbs中加入0.5mltween-20；

阴性对照和阳性对照。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明提供一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株为cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株和cctccno：c201858的杂交瘤细胞株的组合。

本发明提供分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，通过pcr扩增奶牛hp基因，将扩增到的hp基因插入到杆状病毒转移质粒pfastbachtb的ncoi和hindiii位点构建为重组转移质粒pfastbachtb-hp，然后将该重组转移质粒转化至含有杆状病毒骨架质粒的dh10bac感受态细胞，通过同源重组将hp基因整合至杆状病毒骨架质粒bacmid中，将筛选、纯化后的重组穿梭载体转染到sf9昆虫细胞中，待出现细胞病变后收集细胞上清即可获得重组杆状病毒rbacmid-hp。用上述重组杆状病毒表达的hp蛋白过柱纯化后，作为免疫抗原免疫小鼠，得到能稳定分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。现有技术表达hp蛋白表达都是原核表达方式，本案采用真核表达方式，通过杆状病毒表达hp蛋白，能使hp蛋白结构及功能接近天然蛋白，具有较高的表达量和生物活性。应用于奶牛早期妊娠检测能够更早判断奶牛妊娠或空怀，检测结果准确。

本发明还公开了一种抗hp蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体选自配对的cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和cctccno：c201858的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。本发明还公开了一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的制备方法，向小鼠腹腔注射分别选自杂交瘤细胞株4f11和12f9的杂交瘤细胞，一段时间后采集小鼠腹水，离心纯化后获得所述分泌抗hp蛋白的单克隆抗体。

本发明提供将分泌抗hp蛋白的单克隆抗体应用于奶牛早期妊娠检测，能够实现在奶牛人工授精后一个情期内准确判断奶牛妊娠或者空怀，较之常规诊断技术，能缩短20天左右的空怀期，节省奶牛养殖成本，经济效益显著，应用前景广泛。

本发明还提供一种用于奶牛早期妊娠检测的双抗夹心elisa试剂盒，该试剂盒可在21d左右检测出妊娠奶牛，检测结果准确。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组质粒pfastbachtb-hp酶切鉴定图；

图2为本发明实施例1中重组杆状病毒质粒的pcr鉴定示意图；

图3为本发明实施例1中重组杆状病毒转染sf9细胞后的细胞病变示意图；

图4为本发明实施例1中表达蛋白的western-blot检测结果示意图；

图5为本发明实施例2中单克隆抗体western-blot检测结果示意图；

图6为本发明实施例9中抗体纯度示意图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：重组杆状病毒rbv-hp感染sf9细胞表达hp

1、引物的设计

根据genebank上公布的hp基因序列(nm_001040470)设计一对扩增hp基因的特异性引物f1/f2，并在上游引物中插入ncoi酶切位点，下游引物中插入hindiii酶切位点。引物由大连宝生物工程有限公司合成。引物如下：

f1：aaaccatggcgatgagcgccctgcaancoi

f2:tttaagcttttagttgttagcgatgghindiii

2、pcr扩增

以本实验室分离到的妊娠奶牛牛血rna为模板扩增hp基因片段，扩增条件为：①94℃3分钟，②(94℃30秒→55℃30秒→72℃1分30秒)共35个循环；③72℃10分钟。反应结束后用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

3、重组转移质粒pfastbachtb-hp的构建

回收pcr阳性产物，通过ncoi和hindiii酶切位点，将扩增到的hp基因克隆到pfastbachtb载体中经酶切和测序鉴定证实实物构建正确，获得阳性重组质粒pfastbachtb-hp。重组质粒酶切鉴定结果如图1所示，图中1、2为重组质粒pfastbachtb-hpncoi和hindiii酶切产物，3为dnamark(dl2000)。

4、将构建好的pfastbachtb—hp载体转入到含穿梭载体bacmid的感受态细胞dh10bac中，蓝白斑筛选出白色阳性克隆，提取重组bacmid质粒，用m13通用引物pcr鉴定。pcr鉴定结果如图2所示，图中1为dnamark(dl2000)；2、3为pfastbachtb—hppcr鉴定；4为野生型bacmid的pcr鉴定。

5、利用脂质体介导的转染法，将筛选、纯化后的重组穿梭载体转染到sf9昆虫细胞中，待出现细胞病变后收集细胞上清即可获得重组杆状病毒。

1)制备bacmiddna质粒并测定其浓度，将形态良好、生长旺盛的sf9细胞接入6孔细胞培养板，在27℃培养箱中培养，待细胞长至70-80％单层准备转染。

2)配制细胞转染液：取两个1.5ml无菌离心管，a管加入5-8μl脂质体和100μl无血清grace’s培养液，混匀室温静置5min其间于b管加入100μl无血清grace’s培养液和3-5μg待转染bacmiddna，混匀室温静置5min。

3)将a管中的混合液滴加至管b中，混匀后于室温静置20min，其间吸弃待转染细胞孔的培养基，用无血清grace’s培养液洗涤3次。

4)吸弃待转染细胞孔的无血清grace’s培养液，将b管中的200μl混合液滴加到细胞单层上，补加800μl无血清grace’s培养液轻轻摇匀，然后将细胞板置于27℃培养箱中培养。

5)培养5h后吸弃转染混合液加3mlgrace’s生长液继续培养72h。

于27℃培养，待出现细胞病变后收集细胞培养上清即可获得重组杆状病毒，并将第一代的重组杆状病毒继续接种sf9细胞传代，即可得到高滴度的重组杆状病毒，将重组杆状病毒继续接种昆虫细胞扩大收集病毒上清，500x离心5min，转移上清至无菌管于-80℃。参见图3所示，图中显示了正常sf9细胞和rbacmid-hp转染后的细胞病变。

6、sds-page和western-blot检测目的蛋白的表达

将重组杆状病毒接种sf9细胞72小时后，收集细胞样品。加入等量2xsds—page上样缓冲液重悬，混匀，95℃水浴5min，然后置冰上等待上样，进行sds-page和westernblot分析。本发明中westernblot使用的一抗是抗his标签的单抗(三鹰)，使用二抗是hrp标记的羊抗鼠igg，结果图4所示。

实施例2：单克隆抗体的制备

1)单克隆抗体的制备

用上述重组杆状病毒表达的hp蛋白过柱纯化后，根据公式计算蛋白质浓度。用该hp蛋白作为抗原免疫balb/c小鼠。

纯化后的hp蛋白作为免疫抗原免疫6周龄雌性bablb/c小鼠共5次，每次间隔2-3周。第一次免疫用hp蛋白加等量的弗氏完全佐剂，免疫剂量100μg/只，免疫途径颈背部多点皮下注射，以后用弗氏不完全佐剂。四免后12-15天尾部小量采血，间接elisa测定血清效价，若血清效价合格，融合后前三天做加强免疫。用hp蛋白腹腔注射，剂量为100μg/只。最后一次免疫后一周将免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤融合，再经3次亚克隆筛选到能稳定分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别是：3b12、4f4、4f11、5d7、5g8、7e5、10c3、12f9.通过体外培养法收集上清，经离心后去除细胞碎片，细胞上清-20℃保存。按照常规方法制备单克隆抗体的腹水，挑选雌性小鼠，每只腹腔注射无菌石蜡油0.5ml，分多点注射，10-14天后，将状态良好的杂交瘤细胞从细胞培养瓶内轻轻吹下，1000r/min离心10min，弃上清，用无菌pbs悬浮，计数备用；每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞5x10⁵-1x10⁶个，注射后轻柔小鼠腹部，使细胞均匀分散于小鼠的腹腔中；7-10天后，可见小鼠腹腔明显增大，采集腹水将腹水3000r/min离心10min，收集上清-20℃保存。

2)单克隆抗体识别表位的分析

采用相加指数法测定单克隆抗体的抗原识别表位，即用hp蛋白以3-4μg/ml浓度100μl包被酶标板，封闭，洗涤后分别加入饱和稀释度的单克隆抗体，37℃作用60min，同样洗涤后，每孔分别两两组合加入另一株单克隆抗体，37℃作用60min，再洗涤后加入工作浓度的hrp标记山羊抗小鼠二抗(sigma公司产品)，37℃作用60min，最后再洗涤，底物显色测定od450值。按如下公式计算两种单克隆抗体叠加后的ai值：

ai＝(a1+2—a1)/a2*100％(a1+2)表示2株单克隆抗体叠加后的od值；a1表示第一株单克隆抗体自身叠加的od值；a2表示第2株单克隆抗体自身叠加的od值)当两两抗体叠加之后的ai值大于30％，判为两株单克隆抗体识别不同位点。

经相加指数计算，并结合单克隆抗体腹水效价的结果，确定识别2个不同表位的单克隆抗体代表株分别为4f11和12f9。

3)杂交瘤细胞腹水中单克隆抗体效价的测定

腹水mcab的效价测定：采用间接elisa法。包被表达蛋白，以羊抗鼠igg作为二抗测腹水效价。细胞上清从1:100开始作倍比稀释，腹水从1/500开始作倍比稀释，按照间接elisa方法测定其效价。细胞培养上清和纯化腹水的效价测定结果分别见表。

表1两株单克隆杂交瘤细胞培养上清抗体elisa效价

表2两株单克隆抗体腹水的效价

4)免疫印迹(western-blot)试验

按常规方法进行sds-page和western-blot试验，单克隆抗体4f11和12f9分别作为一抗，1:10000稀释的羊抗鼠igg(sigma公司)作为二抗，显色结果显示，2株单克隆抗体均能特异性识别hp蛋白，参见图5所示，图中1为12f9抗体，2为4f11抗体。

5)单克隆抗体的亚类鉴定

按照伯奥通小鼠单抗ig类/亚类鉴定试剂盒操作说明书进行。亚类鉴定的结果是，上述8株单抗除3b12、4f11、10c3为igg2a外，其余单抗均属于igg1

6)杂交瘤细胞系分泌单克隆抗体的稳定性检测

在杂交瘤细胞冻存6个月后，从液氮中取出冻存的杂交瘤细胞株复苏，其小鼠腹水效价未见明显降低。

实施例3：分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株

本发明实施例公开了一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株：杂交瘤细胞株为cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株(即杂交瘤细胞株4f11)和cctccno：c201858的杂交瘤细胞株的组合(即杂交瘤细胞株12f9)。

实施例4：分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

s1，以奶牛rna为模板扩增hp基因片段；

s2，将扩增到得的hp基因插入到杆状病毒转移质粒pfastbactmhtb的ncoi和hindiii位点构建为重组转移质粒pfastbachtb-hp；

s3，将该重组转移质粒pfastbachtb-hp转化至含有杆状病毒骨架质粒的dh10bac感受态细胞，通过同源重组将hp基因整合至杆状病毒骨架质粒bacmid中；

s4，将筛选、纯化后的重组穿梭载体转染到sf9昆虫细胞中，待出现细胞病变后收集细胞上清即可获得重组杆状病毒rbacmid-hp；

s5，将重组杆状病毒rbacmid-hp感染sf9细胞后表达hp蛋白；

s6，将纯化后的hp蛋白作为免疫抗原免疫小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤融合，再经3次亚克隆筛选到能稳定分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别是：3b12、4f4、4f11、5d7、5g8、7e5、10c3、12f9；筛选出一对配对的杂交瘤细胞株4f11和12f9；筛选出的杂交瘤细胞株4f11即为cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株，筛选出的杂交瘤细胞株12f9即为cctccno：c201858的杂交瘤细胞株。

现有技术表达hp蛋白表达都是原核表达方式，本案采用真核表达方式，通过杆状病毒表达hp蛋白，能使hp蛋白结构及功能接近天然蛋白，具有较高的表达量和生物活性。应用于奶牛早期妊娠检测能够更早判断奶牛妊娠或空怀，检测结果准确。

实施例5：一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体

本发明实施例公开了一种抗hp蛋白的单克隆抗体：分泌抗hp蛋白的单克隆抗体选自配对的两种单克隆抗体：一种为cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，另一种为cctccno：c201858的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

实施例6：一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体的制备方法

向小鼠腹腔注射分别选自实施例4的杂交瘤细胞株4f11和12f9的杂交瘤细胞，一段时间后采集小鼠腹水，离心纯化后获得所述分泌抗hp蛋白的单克隆抗体。

实施例7：一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体在奶牛早期妊娠检测的应用

本发明实施例公开了一种分泌抗hp蛋白的单克隆抗体在奶牛早期妊娠检测的应用。分泌抗hp蛋白的单克隆抗体选自cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和cctccno：c201858的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

实施例8：一种用于奶牛早期妊娠检测的双抗夹心elisa试剂盒

本发明实施例公开了用于奶牛早期妊娠检测的双抗夹心elisa试剂盒，包括：包被有cctccno：c2017119的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的酶标板，以及辣根过氧化物酶标记cctccno：c201858的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

试剂盒还包括：

底物液：100mmol/l的柠檬酸溶液24.3ml，200mmol/lna2hpo4.12h2o25.7ml混匀，加入50mg的四甲基联苯胺，临用前加入50μl的30％h2o2；

终止液：蒸馏水177.8ml和浓硫酸22.2ml；

洗涤液：1000ml10mmol/lph7.4的pbs中加入0.5mltween-20。

阴性对照和阳性对照，其中，阴性对照为空怀奶牛血清，阳性对照为妊娠奶牛血清。

实施例9：双抗夹心elisa抗原检测方法的建立

1)检测hp蛋白的单克隆抗体

包被在酶标板的抗hp蛋白的单克隆抗体为杂交瘤细胞株4f11(cctccno：c2017119)分泌获得，酶标记hp蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株12f9(cctccno：c201858)分泌获得。

2)单克隆抗体腹水的制备与纯化

按上述方法制备4f11和12f9的单克隆抗体腹水。利用ge公司的proteing预装柱进行单克隆抗体igg纯化。纯化后利用sds-page鉴定，结果获得了纯度很好的单克隆抗体，参见图6所示，图中1为12f9抗体，2为4f11抗体。

3)酶标单克隆抗体的制备

利用加强型活化氧化物酶及标记试剂盒对单克隆抗体4f11和12f9进行hrp酶标记，记为4f11-hrp和12f9-hrp。应用间接elisa的方法鉴定其活性。结果，效价达到1：10⁴和1:2x10⁴。

4)夹心配对抗体的选择

将4f11和12f9单克隆抗体提纯的igg作为捕获抗体，4f11-hrp和12f9-hrp作为检测抗体，进行夹心配对性实验，以od450nm值最高的配对为最佳的抗体组合，比较结果如表3，结果发现，4f11作为捕获抗体，12f9-hrp作为检测抗体效果最好。

表3夹心配对抗体的选择

5)单抗包被浓度及酶标单克隆抗体(12f9-hrp)工作浓度的确定采用方阵滴定法来测定：选定p/n最大且阳性od450nm值1.5左右的孔，其所对应的捕获抗体包被浓度和酶标检测抗体的浓度为最佳条件，最终确定单克隆抗体包被浓度为3μg/ml，酶标抗体的作用浓度为0.8μg/ml。

6)抗原作用时间的确定

用封闭液作为稀释液稀释阴阳性对照，按确定的程序进行elisa检测，抗原在37℃分别反应30min、45min、60min、90min、120min，在其他条件和反应程序相同的情况下进行elisa检测，确定p/n最小，且阳性值在0.2时最终确定抗原作用时间为60min。

7)酶标单克隆抗体12f9作用时间的确定

按已确定好的反应条件，用已知的阴阳性对照进行elisa抗原检测，酶标单克隆抗体的反应时间分别为30min、45min、60min、90min。确定p/n最小时，结果确定酶标单克隆抗体的最佳工作时间为60min。

8)底物作用时间的确定

将阴阳性对照按照已确定好的条件反应，底物的反应时间分别为5min、10min、15min、20min，双波测定各孔，通过比较p/n值来确定底物作用时间。最终确定底物作用时间为15min左右。

9)阴阳性临界值的确定

选择160份(18-28d)健康空怀牛血清，按照已确定的最佳反应条件进行elisa检测，双波测定各孔，根据公式：阴阳性临界值＝阴性样本平均值+3x标准差(sd)结果，od450的平均值为0.354854，方差为0.073131，当od450≥0.57时判断为阴性，od450≤0.57判断为阳性。

10)敏感试验

采集人工受精后奶牛7d、14d、18d、21d、28d血样，分离血清。分别用本发明elisa试剂盒和进口elisa试剂盒检测，结果表明：该试剂盒可在21d左右检测出妊娠奶牛。

表4与进口试剂盒的比较

实施例10：双抗夹心elisa抗原检测试剂盒临床样品检测结果

用本发明的双抗夹心elisa抗原检测试剂盒，对黄冈、江夏、黄陂奶牛场送检的814份临床样本进行检测，同时与进口elisa抗原检测试剂盒进行比较，结果表明，本双抗夹心elisa抗原试剂盒在21天可以检测出妊娠奶牛而进口试剂盒需要28天。且阴性符合率达到100％，阳性符合率95％以上。

包被酶标板：将4f11单克隆抗体的igg用包被液稀释为3.2μg/ml，100μg/孔，37℃60min，4℃过夜。

洗涤：加洗涤液230μl/孔，每次2min，洗涤3遍，拍干。

封闭：取出包被酶标板，用pbst洗涤4次，3min/次；用5％脱脂乳封闭，300μg/孔，37℃放置2h，封闭后洗涤。

加样：将待检血清用血清稀释液(pbst)等体积稀释后加入上述封闭好的酶标板，100μl/孔：阴阳性对照不稀释，37℃反应90min，洗涤同上。

加酶标单抗：将12f9-hrp稀释到0.8μg/ml，100μl/孔，37℃反应60min，洗涤同上

显色：加入tmb底物液100μl反应10min

终止：加入50μl2mol/mlh2so4终止反应

读板：酶标仪上测定各孔od450nm，进行结果判定。

试剂盒的构成：

酶标板：包被4f11细胞株分泌产生的单克隆抗体。

酶标抗体：辣根过氧化物酶标记12f9细胞株分泌产生的单克隆抗体12f9-hrp

底物液配制：100mmol/l的柠檬酸溶液(21g柠檬酸(c6h8o7.h2o)溶于去离子水，定容至1l)24.3ml，200mmol/lna2hpo4.12h2o(71.6gna2hpo4.12h2o溶于去离子水，定容至1l)25.7ml混匀，加入50mg的四甲基联苯胺(tmb)，临用前加入50μl的30％h2o2；

终止液：(2mol/lh2so4)：分别取蒸馏水177.8ml和浓硫酸22.2ml混合即可。

洗涤液：1000ml10mmol/lph7.4的pbs中加入0.5mltween-20；

阴性对照和阳性对照。

本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。