氯氮平在用于延缓培养的间充质干细胞衰老中的应用的制作方法

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及氯氮平在用于延缓培养的间充质干细胞衰老中的应用。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)具有较强的自我更新和多向分化潜能，在组织工程和再生医学领域中已得到广泛应用。目前，经过广泛的研究，msc可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等分化，其具备广阔的再生医学应用前景。

为了得到足够数量mscs以用于临床治疗，mscs需要在体外大量扩增，然而干细胞在传代培养增殖过程中不可避免的发生复制性衰老现象。为了减缓培养过程中产生的msc衰老，更好地维持干细胞特性，世界范围内的科研团队对此进行了广泛的探索。目前，主要通过调节生长因子、抗氧化剂、营养素的浓度及氧含量等方法延缓细胞培养过程中的衰老，从而促进mscs的增殖。ito等证实成纤维细胞生长因子2通过降低p21、p53、p16基因的表达水平，其可以减缓人mscs长期培养过程中出现的复制性衰老。褪黑素(n-acetyl-5-methoxy-tryptamine)通过清除自由基，其可保护细胞核、线粒体、dna免受氧化应激损伤，因此褪黑素也具备抗衰老的潜能。此外，组蛋白去乙酰酶抑制剂、西罗莫司、单细胞海藻提取物等也被证明能够减缓人脐带msc的衰老。

如果msc在培养过程中的衰老可以减缓，则mscs在再生医学与组织工程领域的应用前景将会更加广阔，这将会造福成千上万的患者。另外，对于msc培养过程中减缓衰老的探索，寻觅安全而有效的方法对其早期干预，对人体衰老的延缓衰同样具有重要的借鉴意义。

目前用于延缓mscs衰老的试剂存在一些不足：1)成本高昂，如生长因子、营养素；2)成分不稳定，常常含有不同类型的杂质，对于临床级msc而言，这会带来一系列不可预知的风险，如单细胞海藻提取物。

氯氮平在临床上面广泛用于失眠、抑郁症、癫痫等疾病的控制，其仅是一种代表性的非典型抗精神病药物，与其他抗精神病药物相比具有较好的疗效。目前，对氯氮平的研究主要集中于神经系统疾病方面的疗效及相关作用机制。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供氯氮平在用于延缓培养的间充质干细胞衰老中的应用，本发明可安全和重复性地实现间充质干细胞衰老的延缓，其成本低廉、过程简单可靠。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：氯氮平在用于延缓培养的间充质干细胞衰老中的应用。

作为上述技术方案的改进，氯氮平先溶解于乙醇中，再用细胞培养基稀释，制备成氯氮平稀释液，所述氯氮平稀释液再添加到间充质干细胞的细胞培养基中。

作为上述技术方案的进一步改进，所述氯氮平稀释液中氯氮平的浓度为12.5～50μg/ml。

作为上述技术方案的进一步改进，间充质干细胞的细胞培养基中氯氮平的浓度为12.5～50μg/ml。

作为上述技术方案的改进，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

另外，本发明还提供氯氮平在制备用于延缓间充质干细胞衰老的药物中的应用。

作为上述技术方案的改进，氯氮平先溶解于乙醇中，再用细胞培养基稀释，制备成氯氮平稀释液，所述氯氮平稀释液再添加到间充质干细胞的细胞培养基中。

作为上述技术方案的进一步改进，所述氯氮平稀释液中氯氮平的浓度为12.5～50μg/ml。

作为上述技术方案的进一步改进，间充质干细胞的细胞培养基中氯氮平的浓度为12.5～50μg/ml。

作为上述技术方案的改进，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

本发明有益效果：本发明提供氯氮平在用于延缓培养的间充质干细胞衰老中的应用，本发明使用的氯氮平稀释液在延缓间充质干细胞衰老的过程中更简便安全和高效，且成本低廉；另外，本发明配制的氯氮平储存溶液，是把氯氮平溶解于无水乙醇中；使用时，是以培养基为溶剂，将氯氮平储存液较大程度地稀释成12.5～50μg/ml，这对细胞几乎没有毒性作用，且保证了氯氮平在细胞培养过程中药效的发挥。

附图说明

图1显示氯氮平作用下，p8代脐带间充质干细胞的表面抗原表达情况的结果；其中，a为control，b为12.5μg/ml氯氮平稀释液；c为25μg/ml氯氮平稀释液，d为50μg/ml氯氮平稀释液；

图2为氯氮平作用下，p8代脐带间充质干细胞的表面抗原表达情况的线形图；

图3为脐带间充质干细胞的β-半乳糖苷酶染色图；其中，a为control，b为12.5μg/ml氯氮平稀释液；c25μg/ml氯氮平稀释液，d为50μg/ml氯氮平稀释液。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

脐带间充质干细胞的准备

1)将脐带用无菌生理盐水洗净，剪成小段，放入空的培养皿中，用组织镊将脐带撕开，剥离两条动脉血管，撕下分布在血管周围的华尔通氏胶；将分离出来的华尔通氏胶放入50ml离心管中，加入2ml培养基，用剪刀将华尔通氏胶剪成1mm大小的碎块，再加入6ml原代培养基，混匀后均匀放入6个t25的培养瓶中；

2)在t25培养瓶放入培养箱中37℃、5％co2培养；

3)当每个t25培养瓶均长出2～3个集落，每个集落最少有上百个细胞后，将培养瓶中的培养基以及组织块倒出，加入传代用培养基，每个培养瓶2ml；放入培养箱中37℃、5％co2培养。

4)培养2天后，每个培养瓶中加入生理盐水冲洗2次，冲洗后尽量，倒干净生理盐水，然后加入胰酶，消化一分钟，肉眼可见细胞已经成片的脱离瓶底，轻拍培养瓶，然后显微镜下观察，当所有细胞均脱壁时，加入2～3ml培养基终止消化；

5)将培养基倒入离心管中，离心，转速为600g，离心时间4分钟，温度为20℃；

6)将离心后的细胞弃上清，培养基重悬并平均接种至t75培养瓶中，并加入15ml培养基，摇匀，放入培养箱中37℃、5％co2培养，此时细胞为p1代；

7)当瓶中细胞长满时，继续传代培养。

氯氮平处理间充质干细胞

1)氯氮平溶解于无水乙醇中，配制成氯氮平储存溶液；

2)用细胞培养基将氯氮平储存溶液稀释成12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的氯氮平稀释液；

3)将p3代细胞接种于12个t25培养瓶中，每三瓶一组，具体分组情况如下：(i)：对照组(不包含氯氮平)；(ii)：加入3ml浓度为12.5μg/ml的氯氮平稀释液；(iii)：加入3ml浓度为25μg/ml的氯氮平稀释液；(iv)：加入3ml浓度为50μg/ml的氯氮平心事；摇匀，放入37℃、5％co2的培养箱中培养；

4)待瓶中细胞长满时，传代，每瓶细胞传代的细胞数一致，每组加入的氯氮平稀释液如步骤3)所述；重复以上步骤，一直到p8代。

流式检测

1)将各组均取出2瓶刚好长满的t25细胞，倒出培养液，用生理盐水清洗后，胰酶消化；

2)将各组细胞放入离心管中，离心，转速为600g，离心时间4分钟，温度为20℃；

3)离心后去上清，倒入生理盐水吹打混匀，再次离心，转速为600g，离心时间4分钟，温度为20℃；

4)离心后，每组加入8ml生理盐水吹打混匀，并对各组细胞进行细胞计数，调整使得各组细胞数目一致；送流式检测。

流式检测结果如图1和图2所示，control及12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml氯氮平稀释液处理各样本后，mscs细胞中呈阳性表达cd90的比例分别为98.64％、99.47％、99.13％、99.42％；mscs细胞中呈阳性表达cd105的比例分别为86.26％、91.59％、91.72％、92.31％；mscs细胞中呈阳性表达cd73的比例分别为90.80％、93.60％、95.51％、95.01％。高表达cd90、cd105、cd73的mscs，具有延缓细胞衰老的作用，由于本发明采用氯氮平稀释液培养mscs，mscs呈阳性表达cd90、cd105、cd73的比例明显增多，可见氯氮平可用于延缓培养的间充质干细胞的衰老。

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)染色

1)将剩余的一瓶刚好长满的t25细胞消化离心后，用含有氯氮平的培养基混匀各组细胞，并对各组细胞进行细胞计数，调整使得各组细胞数目一致(5×10⁵个/ml)，随后分别接种于6孔板，每组接种两个孔，每孔加入2ml，吹打均匀，放入37℃、5％co2的培养箱中培养；

2)提前4小时将β-半乳糖苷酶染色试剂盒放到4℃冰箱解冻；

3)6孔板中细胞铁壁后，吸出各组细胞的培养液，用生理盐水洗涤一次，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min；

4)吸除固定液，用生理盐水洗涤3次；

5)吸除生理盐水，酶孔加入1ml染色工作液；

6)37℃孵育过夜，孵育时用保鲜膜包裹6孔板，以免染色液蒸发；

7)孵育完成以后，显微镜下拍照。

衰老细胞在ph6.0时具有高酶活性的β-半乳糖苷酶。β-gal是应用最早且最广泛的一种源于溶酶体的衰老标志物，能够在衰老细胞中增加溶酶体生物合成，体内随着细胞老化而逐渐积累增多。经过p3到p8代培养后，如图3所示，光学显微镜下观察到control组细胞体积较大，并呈现出大片蓝色(表达大量的β-半乳糖苷酶)，表现出较明显的衰老特征；12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml氯氮平稀释液处理各样本后，细胞体积相对较小且蓝色较淡，这表明氯氮平可用于延缓培养的间充质干细胞的衰老。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。