一株产水杨酸的稻田固氮蓝藻及其在稻田中的应用的制作方法

本发明涉及微生物领域和微生物肥料大田应用领域，特别涉及一株产水杨酸的稻田固氮蓝藻及其在稻田中的应用。

背景技术

继1939年印度科学家首次报道用蓝藻肥田后，许多国家相继开展了相关研究，研究证明在水稻田中接种蓝藻可增产。上世纪50年代开始黎尚豪在我国南方部分省区进行了稻田养藻的试验，结果表明水稻增产达10～30％。稻田放养固氮蓝藻不但能为作物提供氮素和有机质、提高产量、降低化肥用量、提高磷酸盐溶解度、减少水土污染，还具有分泌植物激素促进作物生长等有益的生态功能。

植物激素是植物细胞接受特定环境信号诱导产生的、在极低浓度时可调节生理反应的活性物质，它们都是些简单的小分子有机化合物，分为六大类，即生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、乙烯和油菜素甾醇等。植物激素对植物的生长发育有重要的调节控制作用。其中，吲哚乙酸和水杨酸等能在促进植物生长的同时，提高作物的抗逆性，而水杨酸在诱导作物抗病性方面具有重要作用。而国内外已有研究表明固氮蓝藻能够产生包括生长素和细胞分裂素等在内的多种植物激素，但是没有关于稻田固氮蓝藻产生水杨酸的报道。在当前国家要求化肥农药双减的大背景下，如果能筛选到生长迅速、固氮固碳能力强和能产植物激素诱导植物抗病的固氮蓝藻对其作为生物肥料和生物农药用于农业生产具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株产水杨酸的稻田固氮蓝藻。

本发明的另一目的还在于提供上述产水杨酸的稻田固氮蓝藻在稻田中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株产水杨酸的稻田固氮蓝藻，名称为池生念珠藻(nostocpiscinale)scau-003，保藏编号为cctccno：m2018194，保藏日期为2018年4月11日，保藏单位为位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

所述的产水杨酸的稻田固氮蓝藻可作为生物肥料在稻田中进行应用，优选包含如下步骤：在合适的时机往稻田中放入所述的产水杨酸的稻田固氮蓝藻。

所述的合适的时机是将所述的产水杨酸的稻田固氮蓝藻放入稻田时，环境条件有利于所述的产水杨酸的稻田固氮蓝藻存活；优选为温度是25～30℃、阳光充足、放藻后5天内没有大雨的环境条件，或温度低于15℃的环境条件。

所述的产水杨酸的稻田固氮蓝藻在放入稻田时的状态优选为高密度、且漂浮成膜。

所述的产水杨酸的稻田固氮蓝藻优选通过如下步骤培养得到：

(1)在无菌条件下将所述的产水杨酸的稻田固氮蓝藻培养到对数生长期，得到藻种液；

(2)将步骤(1)得到的藻种液接种到灭菌的培养基中，自然环境下培养，得到产水杨酸的稻田固氮蓝藻藻液。

步骤(1)中所述的培养优选为于25～30℃、光照2500～3500lx、光暗时间为14～18h：6～10h进行培养；更优选为于28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h进行培养。

步骤(1)中所述的培养所用到的培养基优选为bg110液体培养基；

bg110液体培养基的组成如下：k2hpo4.3h2o0.04g/l、mgso4.7h2o0.075g/l、cacl2.2h2o0.036g/l、柠檬酸0.006g/l、柠檬酸铁铵0.006g/l、edta0.001g/l、na2co30.02g/l、微量元素a51ml；

微量元素a5的组成如下：h3bo32.860g/l、namoo4.2h2o0.021g/l、znso4.7h2o0.222g/l、cuso4.5h2o0.079g/l、mncl2.4h2o1.810g/l、niso4.6h2o0.479g/l。

步骤(2)中所述的接种中藻种液的加入量优选按培养基体积的0.5％计算。

步骤(2)中所述的培养基优选为不含硝酸钠的bg11液体培养基(bg110)。

步骤(2)中所述的自然环境优选为农户房前屋后空地。

步骤(2)中所述的培养中所用的容器优选为敞口容器；更优选为塑料盆。

步骤(2)中所述的培养的步骤优选为：在培养容器的开口处覆盖上蚊帐或纱窗布，防止蚊虫产卵；白天置于阳光直晒的地方培养，晚上移入室内；待藻生长至形成藻膜即可。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明通过分离纯化筛选得到产生高浓度水杨酸等植物激素、生长快、固氮固碳能力强的稻田固氮蓝藻，可以用于新的施加方式在水稻田作为生物肥料使用，可以代替一半的化学氮肥，同时增加水稻抗倒伏和抗病害能力。

附图说明

图1是水稻-固氮蓝藻共养-纹枯病苗期微室接种的培养结果图；其中，图a为在烧杯中培养的照片图；图b为不同处理培养得到的水稻苗；从左到右依次为空白对照组、scau-003组、scau-010组、scau-012组和fachb119组。

图2是光学显微镜下的固氮蓝藻图；其中，图a为放大300倍的照片图，图b是放大1500倍(油镜)的照片图。

图3是固氮蓝藻16srdna基因序列的blast比对结果图。

图4是固氮蓝藻rbclx基因序列的blast比对结果图。

图5是scau-003的生长性能检测结果图；其中，图a为生长曲线图，图b为比生长速率计算图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：稻田固氮蓝藻藻株scau-003分离纯化和鉴定

(1)藻种分离与纯化

表层土样：采自华南农业大学增城临西基地水稻田。

藻种的分离和纯化：取土壤样品按1g加入20mlbg110液体培养基中，在光照培养箱中温度28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h预培养7天。然后取上层含藻的清液，涂布于9cm含bg110固体培养基的平皿上。待长出肉眼可见的菌落后，小心挑出重新划平板，镜检，此过程重复3次以上以获得单种培养的固氮蓝藻。最后经紫外线照射和多种抗生素联合处理得到无菌藻株。具体方法为：将od680调至0.05左右的藻液20微升小心涂布在石英比色皿内壁上，在紫外灯下照射20-30分钟。处理后用40微升bg110培养基将藻细胞冲洗下来后涂布于含bg110培养基的琼脂固体平板上。待长出肉眼可见菌落后，挑出置于bg110液体培养基中培养至对数生长期。依次经过含10mg/l青霉素的bg110液体培养基处理3天，离心取藻细胞，用bg110液体培养基冲洗悬浮后，再用1mg/l庆大霉素和1mg/l卡那霉素按青霉素处理方法依次处理后，最终悬浮于bg110培养基即得到无菌藻细胞。

bg110培养基的配方如下所示：

表1bg110培养基药品清单

表2微量元素a5清单

(2)固氮蓝藻-水稻共养抗病性评估

挑选分离得到的三株无菌藻种进行检测，分别命名为scau-003、scau-010、scau-012。同时用购自中国科学院淡水藻种库(湖北武汉)的固氮蓝藻藻株fachb119作为对照。

根据文献(徐国娟等，中国水稻科学,2015,29(1)：97-105)方法进行改进，建立了水稻苗期半固体培养-藻液体培养的稻藻共培养、纹枯病菌微室接种技术。具体步骤如下：将萌发后的3颗水稻种子(黄华占，购自深圳隆平金谷种业有限公司)，置于含400ml1/2ms半固体培养基的1l敞口玻璃烧杯中，在人工气候室中温度29℃、湿度85％、光照3000lx、光暗时间为16h:8h进行培养。待水稻幼苗生长至2叶1心时，加入40ml在bg110培养基中生长到对数生长期的固氮蓝藻藻液(分别为scau-003、scau-010、scau-012和fachb119)，培养7天后，在水稻叶鞘放置立枯丝核菌(中国广东广州的广东省微生物研究所菌种库，编号gim3.512)菌饼。此时用剪去底部的2.5l空塑料桶套在玻璃烧杯上，以形成相对密闭环境使纹枯病发病。以不加藻的处理杯为空白对照，处理和对照各三个重复。评估了藻与水稻共养对水稻纹枯病的抗性，结果见表3和图1。从表3和图1可知scau-003处理的水稻株高和病情抑制率均高于空白对照组和fachb119处理组。因此，选择scau-003进行鉴定。

表3藻稻共养-纹枯病菌微室接种技术评估结果

(3)藻种的鉴定

scau-003的藻株形态如图2所示，为具有异形胞的丝状固氮蓝藻。

藻株采用16srdna法进行序列分析：用16s一对引物27f(agagtttgatcmtggctcag)和1492r(tacggytaccttgttacgactt)进行pcr扩增，通过测序确定16srdna序列(如下所示)，再通过genebank进行blast比较分析，结果如图3所示，表明该藻与已知的nostocsp.pcc9426亲源关系最近，说明该藻种属于念珠藻属。

16srdna序列：

ccttggcggttgcttaccatgcagtcgaacggaatcttaggatttagtggcggacgggtgagtaacgcgtgagaatctagcttcaggtcggggataactactggaaacggtggctaataccggatgtgccgaaaggtgaaaggcttgctgcctgaagatgagctcgcgtctgattagctagttggtgtggtaagagcgcaccaaggcgacgatcagtagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttccgcaatgggcgaaagcctgacggagcaataccgcgtgagggaggaaggctcttgggttgtaaacctcttttctcaaggaataagttctgaaggtacttgaggaataagcatcggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggatgcaagcgttatccggaatgattgggcgtaaagcgtccgcaggtggctgtgtaagtctgctgttaaagagtctagcttaactagataaaagcagtggaaactacatagctagagtacgttcggggtagagggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgtagagatcaggaagaacaccggtggcgaaggcgctctactaggccgtaactgacactgagggacgaaagctaggggagcgaatgggattagataccccagtagtcctagccgtaaacgatggatactaggcgttgcgagtatcgaccctcgcagtgccggagccaacgcgttaagtatcccgcctggggagtacgcacgcaagtgtgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagtatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccaagacttgacatgtcgcgaatcctcttgaaagggaggagtgccttcgggagcgcgaacacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgtttttagttgccagcattaagttgggcactctagagagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcagcatgccccttacgtcttgggctacacacgtactacaatgctccgaacagagggcagcgagctagcgatagcaagcaaatcccggaaatcggagctcagttcagatcgaaggctgcaactcgccttcgtgaaggaggaatcgctagtaattgcaggtcagcatactgcagtgaattcgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatggaagctggcaacgcccgaagtcattaccccaactttcgagagggggatgcctaaggca。

为了进一步鉴定该藻株，提取该藻基因组dna后，用两对引物：cx(5’-ggcgcaggtaagaaagggtttcgta-3’)和cw(5’-cgtagcttccggtggtatccacgt-3’)对固氮蓝藻特异基因rbclx进行了扩增和测序(如下所示)。根据blast分析结果如图4所示，可见，该藻与已知的nostocpiscinalecena21同源性极高(99％)。即该藻种鉴定为nostocpiscinalecena21。

rbclx基因序列：

ggtgatgactccgtactacaatttggtggtggtacactcggacacccctggggtaatgctcctggtgcaaccgctaaccgtgtagctttggaagcgtgtatccaagctcgtaacgaaggccgcaacttggcgcgtgaaggtaacgatgttattcgtgaagctgctaagtggtctcctgaactagctgctgcttgcgaactgtggaaagaaatcaagttcgagtttgaggcaatggataccgtctgatcatcaagtaaaaggtaaaaagttaaaaggtaaaagaaaatctttttacttattactttttacttttaacttaaatttgggctgggtcaagcatgaatctcaagcaaattgcgaaagatacagccaaaactctccaaagctacctaacatatcaggcgctaaggattgtactggcacagctaggcgaaacgaatccaccgttagctgtttggctgcataacttttctgccggaaaagttcaggatggagaagcttatattgaacaacttttccaacacaaacctgacttagcacagcgaattatgacagttagagaacatatagccgaagaagtggcagagttcttaccagaaatggttcgcattggtattaagcaagccaatatggaacagcgtcgccaacacttagaacgcatcacgcagctgagtttaactaaccccagtcctgaatcagaacaacagcaattttccgatcctgactgggataacttagccagttaggaaacatccaagtcgtcactcaatagcaaacctttattattagctatgc。

将其命名为池生念珠藻(nostocpiscinale)scau-003，保藏编号为cctccno：m2018194，保藏日期为2018年4月11日，保藏单位为位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

实施例2：scau-003生长、固氮、固碳和生物量能力评估

用上述bg110液体培养基接种生长到对数生长期的藻种scau-003后，在光照培养箱中，温度28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h进行培养，藻株scau-003的生长曲线如图5所示，od680值从接种时的0.08升高到第13天的0.65，增加超过5倍。计算结果表明该藻具有较高的比生长速率(μ＝0.163d^-1)。

用同样的方法培养藻，在第4天取样，取藻液通过乙炔还原-气相色谱法测定固氮酶活性，测定结果表明该藻的固氮酶活性为0.309±0.032μmolc2h2·h^-1·(μgchla)^-1。在第15天取样，收集藻细胞，冻干后用toc仪器法测定藻细胞总碳和总氮。测得藻细胞总碳和总氮含量分别为1.457±0.599％和0.037±0.017％。

此外，在bg110培养基、温度28℃、光照3000lx、10l盆敞开培养。该藻湿重可以达到15.384±2.251g/l，干重达0.413±0.047g/l。说明该藻具有较强的生物量累积能力和固氮固碳能力，可为水稻生产提供有机物和氮源。

实施例3：scau-003产生水杨酸等植物激素能力评估

scau-003藻在bg110培养基中培养20d，离心取藻细胞冻干。上清液用0.22微米滤膜过滤。取藻细胞在液氮中研磨破壁后加入含内标(5mg/ldhz)的1mlbieleski缓冲液(60％甲醇、25％氯仿、10％甲酸和5％的水)，超声(频率20khz，功率200w，工作/间歇为30s/30s)3min以充分提取。离心收集上清液，沉淀用0.3ml含2％甲酸和50％甲醇的溶液再次超声3min提取，离心收集上清液，与第一次提取的上清液合并，40℃减压旋转蒸发至干后，用ph＝3的甲醇水溶液(甲醇和水按体积比1:1配比，用1mol/l盐酸ph调节为3)定容至1ml，以备uplc-ms-ms测定。上述培养液用bieleski缓冲液萃取，取有机相40℃旋转蒸发至近干后，用ph＝3的1:1甲醇水溶液定容至1ml备用。

色谱条件：所用仪器为uplc-ms-ms(waters)，色谱柱为acquityuplcbehc18柱(2.1×50mm，1.7μm,waters)。流动相:0.1％甲酸水(a)/0.1％甲酸乙腈(b)体系用于正负离子测定模式。流速0.3ml/min。进样量10μl。柱温40℃，样品温度25℃。梯度洗脱条件为:0～2min，90％～75％a；2～3min，75％～40％a；3～3.5min，40％～90％a；3.5～5min，90％a。质谱条件：毛细管电压1.50kv；脱溶剂气流n2，流速800l/h；脱溶剂温度400℃；锥孔气流n2，流速150l/h；离子源温度150℃；碰撞室压力3.1×10^-3mbar；碰撞气体为氩气，质谱参数如下所示。

表4质谱参数

注：(1)为定量离子

藻细胞和培养液中的植物激素浓度见表5，从实验结果看藻细胞可以产生较高浓度的生长素类物质iba、细胞分裂素类物质tzr及水杨酸sa。藻细胞的水杨酸的产量为μg/g水平。而水杨酸可以诱导作物提高抗逆性，国内外研究已经发现其在抗高低温、抗干旱、抗倒伏和抗病虫害方面具有重要作用。

表5藻细胞及培养液中各激素浓度

实施例4：固氮蓝藻稻田大田小区放养试验

(1)试验设计

于2017年7月-12月在江门市新会区某农场开展固氮蓝藻固氮替代化学氮肥和提高水稻抗逆性试验。试验设3个处理(均添加同样npk肥作为基肥)：

处理一：常规施肥对照ck(全量的追肥)

处理二：施固氮蓝藻scau-003，追肥中除氮肥不施用以外其他肥料同ck(藻添加：分别在中耕后3-5天、分蘖期和封行前5-8天时分三次加入。

固氮蓝藻scau-003的扩大培养方法如下：

1)在实验室无菌条件下，用bg110液体培养基于温度28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h进行培养，从20ml培养放大到1l水平。

2)将100mlbg110培养基浓缩营养液(100倍)用自来水或者煮开过10min的井水稀释100倍到10l，置于大塑料盆中并加入藻种液50ml，盆上覆蚊帐或纱窗布覆盖四周用长尾夹夹住防止蚊虫产卵，置于阳光直晒的地方培养，晚上移入室内。取培养10-14天的高密度且漂浮成膜的藻15～20l/亩，在尽量不破坏藻膜的条件下释放到稻田。大田实验每个小区为5m*5m(长*宽)，每个处理三个重复。

(2)试验结果

由于该藻株上浮性强，容易形成藻膜，在户外抗逆性很强，在比较适合的温度和光照条件下能迅速大量繁殖。在大田成功后，实现了快速生长扩繁。在经历三次台风，施藻稻田倒伏较对照显著减少，后期在白叶枯病爆发时，实验对照及周边稻田都出现大面积受害，但对施藻稻田影响很小。最后产量实现了增长，见表6，实测产量增幅超过17％。

表6藻处理对水稻产量的影响

(3)结论

说明水稻生产中加藻能替代追加氮肥，显著增加水稻的抗逆性，增加产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一株产水杨酸的稻田固氮蓝藻及其在稻田中的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物27f

<400>1

agagtttgatcmtggctcag20

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物1492r

<400>2

tacggytaccttgttacgactt22

<210>3

<211>1380

<212>dna

<213>池生念珠藻(nostocpiscinale)

<220>

<223>16srdna

<400>3

ccttggcggttgcttaccatgcagtcgaacggaatcttaggatttagtggcggacgggtg60

agtaacgcgtgagaatctagcttcaggtcggggataactactggaaacggtggctaatac120

cggatgtgccgaaaggtgaaaggcttgctgcctgaagatgagctcgcgtctgattagcta180

gttggtgtggtaagagcgcaccaaggcgacgatcagtagctggtctgagaggatgatcag240

ccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttcc300

gcaatgggcgaaagcctgacggagcaataccgcgtgagggaggaaggctcttgggttgta360

aacctcttttctcaaggaataagttctgaaggtacttgaggaataagcatcggctaactc420

cgtgccagcagccgcggtaatacggaggatgcaagcgttatccggaatgattgggcgtaa480

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cagtggaaactacatagctagagtacgttcggggtagagggaattcctggtgtagcggtg600

aaatgcgtagagatcaggaagaacaccggtggcgaaggcgctctactaggccgtaactga660

cactgagggacgaaagctaggggagcgaatgggattagataccccagtagtcctagccgt720

aaacgatggatactaggcgttgcgagtatcgaccctcgcagtgccggagccaacgcgtta780

agtatcccgcctggggagtacgcacgcaagtgtgaaactcaaaggaattgacgggggccc840

gcacaagcggtggagtatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccaagactt900

gacatgtcgcgaatcctcttgaaagggaggagtgccttcgggagcgcgaacacaggtggt960

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ggaggaaggtggggatgacgtcaagtcagcatgccccttacgtcttgggctacacacgta1140

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tggaagctggcaacgcccgaagtcattaccccaactttcgagagggggatgcctaaggca1380

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>池生念珠藻(nostocpiscinale)

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<223>rbclx基因序列

<400>6

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aagttcaggatggagaagcttatattgaacaacttttccaacacaaacctgacttagcac540

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