本发明属于基因工程技术领域，具体涉及来源于海洋微生物宏基因组的冷激蛋白基因csp、其编码蛋白及该基因在提高植物抗逆性方面的应用。
背景技术：
干旱、低温等非生物胁迫严重影响农作物的生长，对我国粮食的产量带来不可估量的损失。通过传统育种方式提高农作物对非生物胁迫的耐受性进展缓慢且周期较长，而通过基因工程的手段解决上述问题，大大加快了育种进程，有效弥补了传统育种方法的缺陷。
冷激蛋白(csps)是一类高度保守的核酸结合蛋白，在微生物、动物、植物中广泛存在。1987年首次在大肠杆菌中发现冷激蛋白cspa，此后陆续又发现了8个冷激蛋白家族成员。研究发现，csps均含有1个冷休克功能域(coldshockdomaincsd)，该类csps普遍具有rna伴侣功能，可有效破坏低温条件下rna形成的二级结构，保障rna翻译正常进行。近些年来，关于csp基因提高植物抗逆性的研究已经成为热门，但大多数研究的基因来源集中在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等已知微生物，而海洋环境微生物中99％是不可培养的，目前还没有海洋环境微生物中分离得到csp基因的报道。
本申请利用rt-pcr、race及锚定pcr技术从海洋微生物宏基因组中分离出csp全长cdna，分析其编码蛋白质序列的结构特征、进化关系，使其在拟南芥和玉米中过表达，研究csp在干旱及低温胁迫下的功能，以期为进一步揭示该基因的生物学功能及调控机制奠定基础。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种来源于海洋微生物宏基因组的冷激蛋白基因csp、其编码蛋白及该基因在植物耐旱性方面的应用。
冷激蛋白是广泛存在于细菌、植物与动物中的一类高度保守的核酸结合蛋白，能够增强细胞抵御冷激胁迫的能力，通过rna分子伴侣活性参与转录、翻译及生长发育和逆境胁迫应答等细胞生理活动。过表达该基因能够提高转基因植物对于干旱和低温胁迫的耐受性，这种提高转基因植物的抗逆特性，可通过转基因技术应用于农作物上，为后期分子育种奠定基础。
本发明的目的之一在于提供一种具有耐旱能力的来源于海洋微生物宏基因组的基因csp，其碱基序列如seqidno.1。其序列由216个碱基组成，自5’端第1到第216位残基为该基因的开放阅读框序列。
本发明进一步提供具有与上文所述的seqidno:1所示的碱基序列95％以上的同源性，且编码与seqidno:1所示的碱基序列编码的蛋白质具有相同生物学功能蛋白质的碱基序列。
本发明的目的之二在于提供具有上文所述冷激蛋白基因csp编码的蛋白csp，其氨基酸序列如seqidno:2，其是由71个氨基酸残基组成的蛋白质。本发明进一步提供所述冷激蛋白基因csp编码的蛋白的衍生蛋白质，即由序列表中seqidno.2的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而产生的具有相同的生物学功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。
本发明的目的之三在于提供一种重组表达载体，该重组表达载体上含有上文所述的碱基序列；且在优选的技术方案中，该重组表达载体以ptf101作为表达载体，该重组表达载体含有除草剂的抗性基因，可以利用除草剂对转基因植株进行筛选。
本发明的目的之四在于提供一种含有上文所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞优选为根癌农杆菌eha101菌株。
本发明的目的之五在于提供上文所述的冷激蛋白基因csp在培育耐干旱和/或耐低温转基因植物中的应用。该基因的转基因植物在干旱及低温胁迫下耐受性明显提高。优选的技术方案中，该基因在提高拟南芥和玉米在干旱胁迫下的耐受性性能中有较好的应用效果。
本发明的有益效果：
本发明的基因csp来源于海洋微生物宏基因组，其编码的冷激蛋白csp是一类高度保守的核酸结合蛋白，通过rna分子伴侣活性参与转录、翻译及生长发育和逆境胁迫应答等细胞生理活动。该基因能提高转基因植物在干旱及低温胁迫下的耐受性，同时也预示着它在农作物抗逆方面的应用价值，为后续分子育种奠定基础。
附图说明
图1为csp基因克隆pcr电泳图，其中：图1a为保守区部分片段克隆，泳道m为dl2000marker，泳道1和泳道2为克隆所得保守区片段，长度约为190bp；图1b为3′端部分片段克隆，泳道m为dl2000marker，泳道1为克隆所得3′部分片段，长度约为850bp；图1c为5′端部分片段克隆，长度约为750bp，泳道m为dl2000marker，泳道1为克隆所得5′部分片段；图1d为orf全长pcr电泳图，泳道m为dl2000marker，泳道1为orf，全长216bp。
图2为系统发育树分析。
图3为csp基因酶切位点分析。
图4为重组植物表达载体ptf101-csp的结构图谱，重组载体具有除草剂抗性，其中：图4a为35s启动子调控的载体；图4b为ubi启动子调控的载体。
图5为除草剂筛选后所获得的阳性转基因拟南芥苗。
图6为干旱胁迫条件下转基因以及野生型拟南芥的生长情况及各项生理指标的测定结果。
图7为低温胁迫条件下转基因以及野生型拟南芥的生长情况及各项生理指标的测定结果。
图8为玉米的转化过程图。
图9为转基因玉米的检测图；a中a和b分别为csp基因和标记基因bar的检测结果，wt为野生型玉米，泳道1-9为转基因玉米；b为bar试纸条的检测结果，wt为野生型玉米，1-9为转基因玉米；c为rna提取结果，m为dl2000marker，wt为野生型玉米，泳道1-9为转基因玉米；d为半定量检测结果，wt为野生型玉米，泳道1-9为转基因玉米；e为southern杂交结果，wt为野生型玉米，泳道1-3为转基因玉米。
图10为干旱胁迫条件下转基因以及野生型玉米的生长情况及各项生理指标的测定结果。
图11低温胁迫条件下转基因以及野生型玉米的生长情况及各项生理指标的测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照常规条件或分子克隆中所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。下面实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。试验中使用的试剂盒以及试剂：无缝连接试剂盒：trangene公司，peasy-uniseamlesscloningandaseemblykit；质粒提取试剂盒：sangonbiotech公司，sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒；玉米转化培养基配置试剂均购自sigma公司。
实施例1csp基因的克隆与分析
(1)海洋微生物采集：海水取自中国大连黑石礁海域，经过沙滤装置得到能直接用于养殖的干净海水。将干净海水进行抽滤，微生物则留在滤膜上，再用洁净的刀片轻轻刮取并用海水冲洗离心，获得海洋微生物混合样品。将该海洋微生物混合样品迅速保存于4℃，并尽快用于后续dna提取实验。结合物理化学的细胞裂解法和多种酶消化法，从海洋微生物样品中提取并纯化得到质量好纯度高的海洋微生物宏基因组dna。
(2)兼并引物设计：对ncbi网站上提供的大肠杆菌、枯草杆菌、沙门氏杆菌、嗜热链球菌等微生物的csp家族基因序列进行同源性比对，查找相关文献，在其高度保守区设计一对简并引物，在其高度保守区设计一对兼并引物，序列分别为表1中的csp-1和csp-2。
(3)保守区扩增：以海洋微生物宏基因组dna为模板，以csp-1和csp-2为正反向引物，pcr扩增csp基因部分编码区(图1a)。
(4)pcr产物回收：采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，紫外灯照射下切下190bp区域的凝胶，用宝生物公司的minibestagarosegeldnaextractionkitver.3.0dna回收试剂盒回收pcr产物。
(5)将回收的片段连接到t载体上，并用热激转化法将载体导入dh5α感受态细胞内。将细胞涂布于含有amp抗生素的平板上进行筛选培养，待生长出阳性单菌落后，挑取菌落在液体培养基中摇菌并提质粒送测序，测序后即可确定csp基因的部分片段信息。
2、csp基因3’端和5’端部分编码区的克隆
(1)csp基因3'端部分编码区克隆
根据已克隆得到的csp基因保守区序列设计一条特异性巢式引物，以海洋微生物宏基因组dna为模板，首先用外侧特异性引物csp-1进行单引物扩增，在末端转移酶(tdt)的作用下，在单链扩增产物的3’末端加上寡聚鸟嘌呤，以加尾产物为模板，利用两条特异性引物csp-3和oligod(c)18进行pcr扩增，将pcr结果电泳，得到850kb左右的csp3'端片段(图1b)，回收电泳条带，连接到pmd18-t克隆载体上，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，37℃过夜培养至长出单菌落；挑取单菌落过夜摇菌，提质粒，质粒pcr确定阳性克隆并测序。
(2)5'端部分编码区克隆
根据已克隆得到的csp基因保守区序列设计一条特异性巢式引物，以海洋微生物宏基因组dna为模板，首先用外侧特异性引物csp-2为引物进行单引物扩增，在末端转移酶(tdt)的作用下，在单链扩增产物的5’末端加上寡聚鸟嘌呤，以加尾产物为模板，利用两条特异性引物oligod(c)18和csp-4对加尾的产物进行pcr扩增，将pcr结果电泳，得到csp5'端片段(图1c)，回收500-750bp电泳条带，连接到pmd-18t克隆载体上，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，37℃过夜培养至长出单菌落；挑单菌落过夜摇菌，提质粒，质粒pcr筛选出阳性克隆并测序。
3、海洋微生物csp基因编码区获得
拼接测得序列，通过ncbiorffinder软件获得csp基因编码区序列216bp。设计orf全长引物，引物序列为表1中的csp-s和csp-a，以海洋微生物宏基因组dna为模板在lataq酶作用下进行pcr扩增，得到216bp的片段(图1d)，将pcr产物回收，连接pmd18-t载体，连接产物转化dh5α感受态细胞，37℃过夜培养至长出单菌落；挑单菌落过夜摇菌，经质粒pcr检测，获得阳性克隆，将阳性质粒测序，得到216bp的csp编码区。测序结果表明全长序列与拼接序列完全相同。
4、海洋微生物csp基因序列生物信息学分析
(1)开放性阅读框(orf)及氨基酸序列预测
利用ncbi在线分析csp基因的orf。根据基因的开放阅读框，利用genetool软件，推测氨基酸序列。
(2)csp基因编码蛋白与已报道的其他csp蛋白序列的同源性分析
利用ncbi查找并分析氨基酸同源性。对csp氨基酸进行同源性分析，显示该氨基酸与eccspg(大肠杆菌)的同源性最高达87％，与eccspa,eccspb，eccspc，eccspd，eccspe，eccspf，eccsph(大肠杆菌)、bscspb(枯草芽孢杆菌)、csp2039(南极适冷菌)、cscspa,cscspb(新月状柄杆菌)和pfcspa(荧光假单胞菌)等冷休克蛋白氨基酸序列同源性在85％～50％之间(表2)。
(3)系统发育分析
利用clustalx和mega5.0与csp家族其他基因所编码的氨基酸序列相比较，对csp进行系统发育树分析，表明其与来自大肠杆菌的eccspg，eccspb，eccspa亲缘关系较近(图2)。
(4)csp基因的酶切位点分析
利用nebcutter进行csp基因酶切位点分析(图3)，用于植物表达载体构建时酶切位点的选择。
表1csp基因的克隆与分析中所用引物
表2冷激蛋白csp与其他微生物csp蛋白序列同源性分析
实施例2转csp基因拟南芥的获得
(1)csp基因植物表达载体构建
①采用生工生物工程有限公司质粒小提试剂盒，分别提取pmd18-csp质粒和植物双元表达载体ptf101空质粒，具体方法见说明书。
②利用smai及saci两种限制性内切酶对pmd18-csp、ptf101-35s和ptf101-ubi质粒进行双酶切反应，使其线性化，回收csp基因片段及ptf101载体大片段。
③利用t4连接酶将回收纯化后的植物表达载体ptf101-35s、ptf101-ubi分别与csp基因编码区进行连接。分别得到重组载体ptf101-35s-csp和ptf101-ubi-csp(结构图谱分别为图4a和图4b)。
④采用热激法将连接液转化大肠杆菌dh5α，pcr检测筛选出阳性克隆。
⑤阳性重组质粒转化农杆菌：分别提取含ptf101-35s-csp和ptf101-ubi-csp重组载体的大肠杆菌质粒，转化根癌农杆菌eha101感受态细胞。根癌农杆菌eha101感受态细胞的制备方法如下：挑取eha101单菌落于含有50mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的yep液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。取过夜培养的菌体按1:100的比例接种到50mlyep液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养3-4h至细菌生长对数期od600＝0.5-0.6左右。取5ml菌液于4℃，4000rpm离心10min，沉淀用5ml预冷的te(ph7.5)洗涤一次，加1ml新鲜的yep培养基，重新悬浮，分装，-70℃保存。
采用冻融法将质粒ptf101-35s-csp和ptf101-ubi-csp导入农杆菌，方法如下：取两管根癌农杆菌(agribecteriumtumefaciens)eha101菌株感受态细胞置冰上融化，分别加入1μg质粒ptf101-35s-csp和ptf101-ubi-csp，混匀，然后依次在冰上、液氮中及37℃水浴中放置5min，用yep液体培养基稀释至1ml，于28℃，180rpm振荡培养2-4h；取适量菌液涂布于含有50mg/l利福平、50mg/l卡那霉素和100mg/l壮观霉素的yep平板培养基上，28℃培养36h左右长出抗性菌落，pcr及酶切确定阳性克隆。含ptf101-35s-csp重组载体的根癌农杆菌用于后续双子叶植物拟南芥的转化(以下简称“ptf101-35s-csp农杆菌”)；含ptf101-ubi-csp重组载体的根癌农杆菌用于后续单子叶植物玉米的转化(以下简称“ptf101-ubi-csp农杆菌”)。
(2)花序侵染法转化拟南芥
a.转化用农杆菌菌液的制备：将从-80℃冰箱中取出来的ptf101-35s-csp的农杆菌在固体的yep培养基(yep+50mg/lrif+50mg/lkan+100mg/lspec)中进行划线培养。挑取生长状态良好的单菌落接种于5ml含有上述抗生素的yep液体培养基中，28℃，180rpm过夜摇菌20h左右。将过夜活化的农杆菌按照1:50的比例加入到不含抗生素的液体yep培养基中，28℃振荡培养4～6h至od600约为0.5～0.6。
b.供转化用拟南芥的处理：选取株高10～15cm，生长状态好、最大花序已产生一个角果的野生型拟南芥用于转化，转化之前将果荚及已开放的花朵全部剪掉，只留花蕾，前一晚利用毛细管吸水作用将苗浇透。
c.转化：将已经准备好的拟南芥植株到插入到转化液中，确保所有的花蕾都已浸入到农杆菌菌悬液中，顺时针缓慢摇晃2min。
d.转化后处理：标记已转化植株，将其平放于培养箱中，在黑暗条件下培养2天后，将植株立起正常培养，收获种子(转入的当代为t0代，其收获的种子为t1代)。
(3)转基因拟南芥的除草剂筛选
将收获的转基因种子和野生型种子均匀的撒播于方形盆中，培养条件为温度24℃/22℃(昼/夜)，光周期16h/8h，空气湿度60％-70％。待拟南芥长至两片真叶时开始喷洒浓度为40mg/l的basta溶液，每2-3天喷洒一次，喷洒3-4次后可观察到转基因植株存活(图5a和图5b)，野生型植株死亡(图5c)。
实施例3干旱胁迫条件下转基因拟南芥的生理检测
将筛选后转基因拟南芥移栽到方形盆中，每个方形盆内栽种两棵过表达csp的拟南芥，待生长5周后用于下一步生理检测。用于对照野生型拟南芥采用同前文相同的培养方式，不喷洒basta溶液，待生长5周时与实验组同期进行生理检测。
选取生长状况一致的转基因和野生型拟南芥实验。本实验采用苛扣浇水的方法模拟自然条件下的干旱，即干旱处理前给所有植株浇以充足的水分，之后不再浇水。分别在干旱处理的第0天、第3天、第6天、第9天和第12天，取样测定叶片相对含水量(rwc)、丙二醛(mda)含量、叶绿素含量和sod酶活性等各项生理指标。为保证实验结果的准确性，各指标的测定均设有三个重复。
实验结果：实验结果表明，干旱处理前野生型和转基因拟南芥生长状态很好，叶片饱满且舒展，无萎蔫的状况(图6a中a和b)。干旱12天后，野生型拟南芥叶片出现明显的萎蔫和干枯，强烈的氧化作用更使叶片颜色变深，茎也无法直立(图6b中a)；而转基因拟南芥叶片虽有失水现象，叶片颜色相较于干旱处理前也有所变深，但叶片仍能保持舒展，生长状况良好(图6b中b)。
生物量可以有效反应植物体内有机物质的积累。选取初始生长状态一致的野生型植株和转基因植株，干旱处理12天后，野生型和转基因拟南芥干重分别为23.2mg和32.4mg，过表达csp基因的植株比野生型植株的干重高出39％。
测定干旱处理前后的叶片相对含水量可以进一步了解拟南芥中水分损失情况。实验结果表明，在正常生长条件下，野生型拟南芥(wt)与转基因拟南芥(csp)的叶片相对含水量差异不显著，分别为87.47％和83.03％；经过12天的干旱胁迫，野生型拟南芥的叶片相对含水量骤降至27.65％，而转基因拟南芥的叶片相对含水量保持在72.58％(图6c)。
叶绿素含量的多少影响着植物对光能的吸收和转换效率。干旱胁迫前，转基因拟南芥与野生型拟南芥叶片中的叶绿素含量相差不显著，在自然干旱胁迫下，转基因株系与野生型株系中叶绿素都在流失，但野生型拟南芥下降速率比转基因拟南芥速率快。在干旱处理第0、3、6、9和12天，转基因拟南芥中叶绿素含量分别是野生型拟南芥的0.98、1.20、1.12、1.31和1.30倍，除第0天外，转基因拟南芥的叶绿素含量均显著高于野生型(图6d)。
如图6e所示，在正常生长条件下，野生型和转基因拟南芥叶片中的mda含量均较低，且二者无显著差异；干旱6天后，野生型拟南芥中mda含量急速上升，转基因型虽然也有所上升，但是幅度不大。干旱12天时，转基因拟南芥的mda含量显著低于野生型拟南芥。上述结果表明，转基因拟南芥受到的伤害更小。
超氧化物歧化酶(sod)是植物体内重要的活性氧清除剂。实验结果表明(图6f)，sod的活性随着干旱胁迫的进行呈现先升高后降低的趋势，在干旱第6天时达到最高，正常生长时活性最低，且转基因植株的sod活性始终高于野生型植株。
因此，该实验证明了过表达csp基因能通过提高叶片相对含水量、叶绿素含量、sod酶活性、降低mda含量及促进转基因植株根系的生长，从而使得其具有优于野生型植株的表型及生理特性，最终在干旱胁迫下受到较少的伤害。
实施例4低温胁迫条件下转基因拟南芥的生理检测
选取生长状况一致的转基因和野生型拟南芥进行实验。对其进行15℃寒冷胁迫，同样在第0天、第3天、第6天、第9天、第12天测量以下生理指标。实验设置三次生物学重复，三次技术重复，以减小实验误差对结果造成的影响。
实验结果：正常生长时，转基因和野生型(分别为图7a中a和b)拟南芥生长状况良好且状态基本一致，但在经过12天的寒冷处理后，野生型拟南芥叶片出现萎蔫的状况，叶片颜色变深，部分叶片出现黄斑(图7b中a)；而转基因拟南芥仍能正常生长(图7b中b)。
生物量是反映植物体内有机物质积累的重要指标。寒冷处理后野生型拟南芥的整株干重为28.8mg，转基因拟南芥的整株干重为49.3mg；转基因拟南芥比野生型拟南芥的生物量高出了41.47％。
叶片相对含水量的变化如图7c所示，正常生长时，野生型和转基因拟南芥的叶片相对含水量都约为88％，寒冷胁迫12天后，转基因和野生型拟南芥的叶片相对含水量都有所下降且最终二者差异显著，分别为74％和64％。
叶绿素影响着植物的光合作用速率，与植物的生长密切相关。实验结果表明(图7d)，低温处理前，转基因拟南芥与野生型拟南芥叶片中的叶绿素含量相差不大，在低温处理过程中，转基因拟南芥与野生型拟南芥中叶绿素含量都在逐渐下降，但转基因拟南芥的叶绿素含量总体上都高于野生型。
在低温胁迫下，野生型和转基因拟南芥的丙二醛(mda)含量都有明显的升高(图7e)。在低温处理前6天，转基因拟南芥中mda含量无明显差异，而野生型拟南芥的mda含量明显升高。随着低温处理天数的不断增加，拟南芥叶片中的mda含量不断上升，干旱处理12天时，野生型拟南芥中mda的含量0.135μmol/g，而转基因拟南芥中仅为0.112μmol/g，显著低于野生型。
超氧化物歧化酶(sod)能减少植物在逆境下受到的伤害。实验结果表明，正常生长条件下，野生型和转基因拟南芥中sod活性基本一致，随着胁迫时间的推移，转基因和野生型拟南芥中sod活性都在上升，低温胁迫12天时csp基因过表达的拟南芥中sod酶活性显著高于野生型拟南芥(图7f)。
因此，该实验证明了过表达csp基因能通过提高叶片相对含水量、叶绿素含量、sod酶活性、降低mda含量，从而使得其具有优于野生型植株的表型及生理特性，最终在低温胁迫下受到较少的伤害。
实施例5转csp基因玉米的获得及检测
(1)玉米转化培养基
yep培养基：酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂8g/l，ph＝6.8。
侵染培养基：n6盐3.99g/l，2,4-d20mg/l，脯氨酸0.7g/l，蔗糖68.4g/l，葡萄糖36g/l，ph＝5.2。
共培养培养基(1-4d的新鲜培养基)：n6盐3.99g/l，2,4-d20mg/l，脯氨酸0.7g/l，蔗糖30g/l，凝胶2.5g/l，ph＝5.8高温灭菌后加入agno30.85mg/l。
恢复培养基：n6盐3.99g/l，2,4-d20mg/l，脯氨酸2.8g/l，蔗糖30g/l，mes0.5g/l，琼脂8g/l，ph＝5.8高温高压灭菌后加入头孢、agno30.85mg/l。
筛选培养基i：n6盐3.99g/l，2,4-d20mg/l，脯氨酸2.8g/l，蔗糖30g/l，mes0.5g/l，琼脂8g/l，ph＝5.8高温高压灭菌后加入头孢200mg/l、agno30.85mg/l、双丙氨磷1.5mg/l。
筛选培养基ii：n6盐3.99g/l，2,4-d20mg/l，脯氨酸2.8g/l，蔗糖30g/l，mes0.5g/l，琼脂8g/l，ph＝5.8灭菌后加入头孢、agno30.85mg/l、双丙氨磷3mg/l。
再生培养基i：ms盐4.4，改良维生素，蔗糖60g/l，肌醇100mg/l，凝胶4g/l，ph＝5.8高温高压灭菌后加入头孢200mg/l、双丙氨磷1.5mg/l。
再生培养基ii：ms盐4.4，改良维生素，蔗糖60g/l，肌醇100mg/l，凝胶4g/l，ph＝5.8。
(2)农杆菌介导的幼胚侵染法转化玉米
a.转化用农杆菌菌液的制备：将从-80℃冰箱中取出来的ptf101-ubi-csp农杆菌在固体的yep培养基(yep+50mg/lrif+50mg/lkan+100mg/lspec)中进行划线培养2～3d。用涂布棒蘸取部分菌落涂布于含有上述抗生素的yep培养基上，19℃过夜培养。用接种环刮取适量菌落置于含as的侵染培养基中，于室温下低速振荡培养4～5h，od550约为0.35～0.45。
b.供转化用玉米的处理：选取授粉两周左右的hi-ii品种玉米果穗，其粒数大于100粒且无病虫害，剥掉果皮，将果穗置于75％的酒精溶液中消毒10-15min。
c.侵染：将消毒完的玉米穗置于超净工作台中，用灭菌的解剖刀削去玉米粒顶部1～2mm，剥取完整幼胚放于洗液中，幼胚大小选取范围为1.5～2.0mm，每管100个，用抽滤好的洗液洗两次，然后加入1～1.5ml菌悬液，温和颠倒20次。黑暗条件下直立静置5min。
d.共培养：幼胚转移到灭菌的滤纸上，然后将滤纸倒置于共培养培养基表面，用解剖刀调整幼胚盾面朝上，然后将其置于19℃培养3d。
e.恢复：共培养结束后，挑选状态较好的幼胚转移到恢复培养基，28℃暗培养7天。
f.筛选：恢复结束后将幼胚转入筛选培养基i，两周后转入筛选培养基ii，每两周换一次筛选培养基ii，直至出现抗性愈伤。
g.再生：将状态较好的愈伤转移至再生培养基i，两周换一次培养基直至长出胚状体，将胚状体转移至再生培养基ii，置于光照下培养，直至分化形成新的植株。
h.炼苗和移栽：待幼苗长至5cm左右时，打开瓶盖，炼苗2天左右，根部洗净培养基，移栽入由蛭石及营养土配制的基质中，浇透水，于人工气候培养箱中缓苗一周，然后移栽到温室。
图8中a表示共培养3d后；b表示筛选2周后；c表示筛选4周后；d表示筛选6周后；e表示分化出的胚状体；f表示再生出的植株。
(3)转csp基因玉米的检测
对转基因玉米进行了csp基因和bar基因两对引物的pcr检测(分别为图9a中的a和b)，表明转化成功，共获得9个株系(图9a～d中1～9)。然后对其进行bar试纸条检测，结果表明：与野生型玉米相比，转基因玉米的bar蛋白成功表达(图9b)。将获得的幼苗与生产上常用的郑58进行杂交，获得杂交一代的种子。
对杂交一代玉米种子进行pcr检测，每个株系选取一株阳性植株提取rna(图9c)，并将其反转录成cdna，进行rt-pcr检测(图9d)，内参基因选取ef-1α，结果表明，9个株系在转录水平上均有表达csp基因。选取表达量较高的4、5、9号株系进行后续生理实验。
为检测转基因玉米的csp基因整合情况，采用southern杂交对选定的三个株系进行分析。具体实验步骤参照地高辛试剂盒。检测结果表明，野生型植株(wt)没有显示出杂交信号，而(1～3)三个转基因株系均有杂交信号。外源基因csp已整合到玉米基因组中,且三个株系均为单拷贝(图9e)。
表3转基因玉米基因pcr检测所用引物
实施例6干旱胁迫条件下转基因玉米的生理检测
用碱法提取玉米种子胚乳dna，通过pcr检测区分csp基因阳性与阴性种子，以每个株系的pcr阴性种子作为野生型对照，在人工气候培养箱中进行干旱实验。培养温度为26℃/24℃(昼/夜)，光周期16h/8h，空气湿度60-70％。干旱处理前选取均为三叶一心期的苗(图10a，其中a为野生型株系，b为csp基因转基因株系)，采取苛扣浇水法进行两周干旱处理，即干旱处理前给所有植株浇以充足的水分，之后不再浇水。干旱前后均测定玉米的叶片相对含水量、mda含量和sod含量。
实验结果：两周后，观察玉米的性状，三个株系均出现萎蔫的干旱性状，但与野生型植株(图10b中a)相比，转基因植株的萎蔫表型则较轻(图10b中b)。
生物量可以有效反映植物体内有机物质的积累。分别测定野生型与转基因的根长、鲜重和干重。试验数据表明，l9转基因株系的根长显著大于野生型株系，l5转基因株系的鲜重显著大于野生型株系。三个转基因株系的干重均显著大于野生型株系(表4)。
叶片相对含水量是衡量植物体内水分状况的一个标准，它反映了组织的代谢活动。植物叶片相对含水量越接近正常水平，说明植物生理代谢越正常。干旱处理前三个株系的叶片相对含水量较一致，均达到90％以上，且转基因与野生型之间无显著差异；干旱处理后，野生型植株的叶片相对含水量降到了50％左右，转基因植株则在70％左右，显著高于野生型植株(图10c)。
表4玉米的根长、鲜重和干重
植物在逆境下往往发生膜脂过氧化。丙二醛(mda)是膜脂过氧化的最终产物之一，mda的积累对膜和细胞会造成一定的伤害，因此，植物在逆境下mda的累积越少，代表植物的抗逆性越强。干旱处理前，三个株系的mda含量均较低，且转基因与野生型株系无显著差异；干旱后三个株系的mda含量均升高，但与野生型植株相比，转基因植株的mda的含量较低，且l5、l9株系显著低于野生型植株(图10d)。
超氧化物歧化酶(sod)广泛存在于需氧生物体内，它与过氧化氢酶(cat)、过氧化物酶(pod)等酶共同构成保护酶系，因此在植物体内其含量越高表示植物抗逆性越强。干旱处理前，各株系之间的sod含量较低且无显著差异，干旱处理后，各株系sod含量均升高，但转基因株系升高幅度大于野生型株系，且l5和l9株系转基因植株升高幅度显著高于野生型植株(图10e)。
图10中l4、l5、l9分别表示转csp基因4号株系、5号株系和9号株系。
因此，该实验证明了过表达csp基因能通过提高玉米植株的叶片相对含水量、叶绿素含量、sod酶活性、降低mda含量及促进转基因植株根系的生长，从而使得其具有优于野生型植株的表型及生理特性，最终在干旱胁迫下受到较少的伤害。
实施例7低温胁迫条件下转基因玉米的生理检测
实验材料选用l4、l5和l9三个株系，生长状态均为三叶一心期，对其进行三天的短期寒冷处理。处理温度为5℃。处理前后测定植株的叶绿素含量、mda含量和sod含量。
实验结果：叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，寒冷胁迫会导致叶绿素含量的降低，从而会影响植物的正常生长。寒冷处理前各株系叶绿素含量无显著差异。寒冷处理后，各株系叶绿素含量均有所下降，但与野生型株系相比，转基因植株的含量均显著高于野生型植株(图11a)。
植物在低温胁迫下会发生膜脂过氧化。低温处理前，三个株系的mda含量均较低，且转基因植株与野生型植株无显著差异；低温处理后三个株系的mda含量均升高，但与野生型植株相比，转基因植株的mda含量显著低于野生型植株(图11b)。
超氧化物歧化酶(sod)是一种含有金属元素的活性蛋白酶，在需氧生物中普遍存在，其能够防御过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害。植物受到寒冷等逆境胁迫后其体内的sod含量会升高。低温处理前，各株系之间的sod含量较低且无显著差异，低温处理后，各株系sod含量均升高，但转基因植株升高幅度大于野生型植株，且达到显著水平(图11c)。
从以上数据分析得知，过表达csp基因能通过提高叶绿素含量、sod酶活性、降低mda含量，从而使得转基因玉米具有优于野生型玉米的生理特性，最终在低温胁迫下受到较少的伤害。
以上结果表明，转csp基因玉米的耐旱性和耐寒性均优于野生型玉米。
sequencelisting
<110>海洋微生物冷激蛋白基因csp、其编码蛋白及其应用
<120>大连理工大学
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