本发明属于分子生物学领域，涉及一种新的东方巴贝斯虫基因及其应用。
背景技术：
东方巴贝斯虫是一种经镰形扇头蜱传播，只引起水牛巴贝斯虫病的一种寄生原虫。该虫首次于1984年在中国的中部及南部首次发现，并于1997年正式命名为东方巴贝斯虫。其引起的水牛巴贝斯虫病主要发生在南方多地区，发病季节多在5、6月份，与镰形扇头蜱活动有关，具有显著的地区性与季节性。发病水牛的临床症状主要表现为发热、贫血、黄疸及血红蛋白尿，严重者甚至死亡。如果诊治不及时，死亡率较高，造成水牛养殖业巨大经济损失。目前东方巴贝斯虫的诊断方法主要为显微镜检测、分子生物学检测和血清学检测。其中显微镜检测需要检测人员有丰富的临床经验，且当待检样品染虫率低或混合感染时，容易出现误判；分子生物学检测方法具有灵敏度高、特异性强的特点，但往往需要昂贵的仪器如pcr仪且操作烦杂，难以用于临床检测中；而东方巴贝斯虫的血清学方法目前仍然处于实验室研发阶段，临床上鲜有应用。
本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室的课题组通过大量筛选获得球状体蛋白基因4，通过生物信息学方法，对该基因进行多方面分析发现该基因具有相对保守且良好的抗原性，具有深入研究作为候选诊断抗原的前景，接着从东方巴贝斯虫中扩增得到该基因，并进行重组表达，经免疫印迹和间接免疫荧光实验验证该基因表达的重组蛋白所产生的抗体特异性良好，灵敏度高，可作为东方巴贝斯虫检测的候选抗原分子。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是在东方巴贝斯虫gdna中扩增得到球状体蛋白基因4。
本发明的第二个目的是将所述东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4(sbp4)在大肠杆菌表达系统中高效表达，从而获得重组蛋白。
本发明的第三个目的是提供上述重组蛋白在制备东方巴贝斯虫病的检测试剂盒中的应用。
(1)本发明所述东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4的获得：利用聚合酶链式反应(pcr)的方法，以东方巴贝斯虫gdna为模板，经pcr扩增得到东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4，其核苷酸序列的开放阅读框(orf)如序列表seqidno：1所示。
(2)编码了所述东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4的截短重组蛋白，其氨基酸序列如序列表seqidno：2所示。
(3)所述重组蛋白，其制备方法为：将序列表seqidno：1所示的东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4开放阅读框(orf)截短部分与大肠杆菌表达载体构建重组表达质粒pgex-6p-1-sbp4，利用感受态法转化至bl21(de3)中，经氨苄青霉素筛选高抗性的转化子，并用1mmol/liptg于37℃诱导4h。收集上述iptg诱导表达的菌液，对其进行分离纯化，最终纯化出的蛋白即为编码了东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4的重组蛋白。
(4)重组蛋白纯化处理，按上述方法诱导表达1000ml菌液，将诱导后的菌液于4℃条件下8000r/min离心15min集菌。取20mlpbs重悬菌体沉淀后，使用压力破碎仪破碎3次；4℃，12000r/min离心10min，弃沉淀，收集上清，微滤后，用gst纯化柱进行纯化，纯化步骤同说明书。
(5)应用westernblot的方法进行sbp4免疫原性的检测。将sbp4重组蛋白进行sds-page分离后，将蛋白转移到pvdf膜上后，一抗孵育感染东方巴贝斯虫水牛的阳性血清3h与未感染牛的阴性血清，二抗孵育山羊抗牛血清2h后，利用化学发光方法进行检测，结果显示阳性血清孵育后有特异性的条带产生，大小与重组蛋白大小相同，阴性血清孵育无条带，说明水牛感染东方巴贝斯虫后，会产生针对sbp4的特异性抗体，sbp4可用于东方巴贝斯虫的检测，并且该重组蛋白具有良好的反应原性。
(6)同样利用westernblot的方法，验证sbp4在东方巴贝斯虫中的存在，用重组蛋白制备的鼠源多克隆抗体及鼠阴性血清分别孵育东方巴贝斯虫全虫抗原及水牛红细胞裂解物,结果显示只有阳性血清孵育全虫抗原会产生特异性条带，且大小与预期的相符，说明sbp4在东方巴贝斯虫中真实存在。
7)通过间接免疫荧光的方法，发现sbp4存在于东方巴贝斯虫细胞核中，并逐渐散在分布到红细胞的细胞质中，说明利用间接免疫荧光的方法可成功检测东方巴贝斯虫。
本发明涉及的编码了东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4的重组蛋白可有效检测水牛血液中东方巴贝斯虫的存在，具有良好的免疫原性，是开发东方巴贝斯虫病血清学诊断方法的候选因子。
附图说明
图1为东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4扩增电泳图。1：克隆引物从东方巴贝斯虫总gdna中扩增的目的基因；m：dna分子量标准(购自大连宝生物)。
图2为利用同源重组方法扩增目的片段及载体电泳图。1：表达引物从gdna中扩增目的基因；2：表达引物扩增pgex-6p-1质粒后的线性载体片段；m：dna分子量标准。
图3为东方巴贝斯虫球状体蛋白4定性分析的sds-page电泳结果。1：iptg诱导的pgex-6p-1-sbp4表达产物；2：未诱导的pgex-6p-1-sbp4；3：纯化后的pgex-6p-1-sbp4重组蛋白；m：蛋白质分子质量标准。
图4为东方巴贝斯虫球状体蛋白4的免疫原性的结果。1：重组蛋白与感染东方巴贝斯虫的水牛阳性血清反应；2：重组蛋白与健康水牛血清反应；m：蛋白质分子质量标准。
图5为东方巴贝斯虫球状体蛋白4的自然形式的westernblot鉴定。1：东方巴贝斯虫全虫抗原与sbp4阳性多抗血清反应；2：水牛红细胞与sbp4阳性多抗血清反应；3：东方巴贝斯虫全虫抗原与鼠阴性血清反应；4：水牛红细胞与鼠阴性血清反应。
图6为利用间接免疫荧光检测东方巴贝斯虫。1:hochest：东方巴贝斯虫的核显蓝色；594：sbp4显红色；merge：二者叠加可见红细胞内的蓝色的东方巴贝斯虫核和存在于东方巴贝斯虫细胞核中的sbp4；2：sbp4逐渐扩散至染虫红细胞胞质内。标尺大小为2μm。
图7为本发明构建的pgex-6p-1-sbp4重组质粒图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：东方巴贝斯虫的纯化
采集染虫水牛血液(染虫率约5～10％)100ml抗凝血于2个50ml离心管中，3000rpm低速离心10min，去除上清与红细胞之间的白色絮状物(白细胞)；缓慢加入红细胞3倍体积的1xpbs,摇匀，重复此操作3次至上清无色透明；加入2倍体积的红细胞裂解液，摇匀，室温静置30min,10ml注射器反复吹打10次后，12000rpm离心10min，收集沉淀，重复此步骤3次直至上清无色透明；沉淀用1xpbs溶解，即为东方巴贝斯虫。
实施例2：东方巴贝斯虫gdna的提取
将所提取的上述虫体溶液用于gdna的提取，提取试剂盒为天根试剂盒。提取的gdna样品冻存于-20℃，备用。
实施例3：东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4的克隆及序列分析
1)引物设计
利用clonemanager软件设计上下游引物f1:5'-atggtggctctttccctacg-3'；r1:5'-ttactcagtggtggtttcggtttc-3'。
2)pcr扩增：以东方巴贝斯虫gdna为模板，以f1、r1引物进行pcr扩增，反应体系为25μl，pcr反应体系如下：
pcr反应条件：反应条件为94℃5min；94℃30sec，55℃90sec，68℃1min；72℃10min；35个循环周期。
3)pcr产物鉴定：扩增完成后，取pcr产物10μl用10×核酸上样缓冲液点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×tae缓冲液，120v，电泳30分钟观察结果，得到目的片段(见图1)。
4)目的基因的克隆、筛选与测序
取peasy-blunt载体1μl(50ng/ul)与胶回收的目的片段3μl混合后，加入6μl溶液i，混匀后置16℃连接过夜。取10μl连接产物，无菌条件下加入大肠杆菌trans-t1感受态细胞中，用移液器温和反复吹打混匀，冰浴放置30min。42℃水浴，热激90sec，之后立即冰浴3min使之冷却，注意不要晃动。转移菌液至装有500μl预热至37℃的lb培养液中，150rpm37℃温和振荡45min，使细菌恢复抗药性。向含氨苄青霉素(amp)(100μg/ml)的lb琼脂平板上加入40μlx-gal(20mg/ml)、4μliptg(200mg/ml)，均匀涂布，37℃放置半小时后，取150μl菌液涂布于平板上。倒置平皿于37℃恒温培养箱培养12～16h，置于4℃使蓝色充分显现，挑白色菌落接种于含150μg/mlamp的lb培养液中，剧烈振摇(230rpm)12～16h后鉴定。将pcr扩增为阳性的克隆，取菌液送上海勤科生物科技有限公司进行测序分析，得到945bp的gdna序列，该基因有完整的开放阅读框(orf)，其开放阅读框的序列如序列表seqidno：1所示的序列。
序列号：seqidno：1
序列长度：945bp
序列类型：gdna
来源：东方巴贝斯虫
序列特征：有正确的开放阅读框(orf)：945bp；决定位置：起始、终止密码子存在位置：atg，1位；taa，945位。
5)上述步骤4所得序列orf全长945bp，该基因编码的蛋白质含有314个氨基酸，分子量约为36.3kda。利用美国国家生物技术信息中心(ncbi，nationalcenterforbiotechnologyinformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的blast(basiclocalalignmentsearchtool)软件对所测氨基酸序列进行分析。用dnastar软件包里的megalign软件，通过clustalw方法比较的不同物种之间核苷酸序列相似度。结果表明获得了东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4的全长orf编码区序列。
实施例4：原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的诱导表达
1)设计东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4的表达引物：
根据东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4的orf序列设计表达的同源引物为f2:5'-ttctgttccaggggcccctggaggaagttgttgaggaacc-3'；r2:5'-gatcgtcagtcagtcacgatgttactcagtggtggtttcgg-3'.用于扩增载体的同源引物为f3:5'-catcgtgactgactgacgatc-3'；r3:5'-caggggcccctggaacagaa-3'.
2)重组表达质粒的构建
由于sbp4利用signalp4.1server预测在66-69bp之间有一个信号肽存在，为便于原核表达，将sbp4进行截短表达，表达区域为70-945bp。
利用同源重组的方法将sbp4截短片段与gst标签载体pgex-6p-1连接。
3)pcr扩增：分别以东方巴贝斯虫gdna及pgex-6p-1质粒为模板，以f2、r2与f3、r3引物分别进行pcr扩增，反应体系为50μl，pcr反应体系如下：
pcr反应条件：反应条件为94℃5min；94℃30sec，55℃90sec，68℃1min；72℃10min；35个循环周期。
4)pcr产物鉴定：扩增完成后，取pcr产物用10×核酸上样缓冲液点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×tae缓冲液，120v，电泳30min观察结果，分别得到目的片段与载体的线性片段(见图2)。
5)分别进行载体与目的片段的胶回收，测定回收浓度。取pgex-6p-1回收产物3.2μl(32ng/μl)与胶回收的sbp42.8μl混合后，加入1μlexnasetmⅱ,5×cebuffer2μl及灭菌水1μl，混匀后37℃连接40min。取10μl连接产物，无菌条件下加入大肠杆菌trans-t1感受态细胞中，用移液器温和反复吹打混匀，冰浴放置30min。42℃水浴，热激90sec，之后立即冰浴2min使之冷却，注意不要晃动。转移菌液至装有500μl预热至37℃的lb培养液中，150rpm37℃温和振荡50min，使细菌恢复抗药性。向含氨苄青霉素(amp)(100μg/ml)的lb琼脂平板上加入40μlx-gal(20mg/ml)、4μliptg(200mg/ml)，均匀涂布，37℃放置半小时后，取150μl菌液涂布于平板上。倒置平皿于37℃恒温培养箱培养12～16h，挑白色菌落接种于含150μg/mlamp的lb培养液中，剧烈振摇(230rpm)12～16h后鉴定。
6)pgex-6p-1-sbp4表达载体构建及阳性克隆子鉴定
将pgex-6p-1-sbp4质粒(1μl)无菌条件下加入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(100μl)，用移液器温和反复吹打混匀，冰浴放置30min。42℃水浴，热激90sec，之后立即冰浴2min使之冷却，注意不要晃动。转移菌液至装有500μl预热至37℃的lb培养液中，150rpm37℃温和振荡45min，使细菌恢复抗药性，取150μl菌液涂布于含有氨苄青霉素(amp)(100μg/ml)的lb琼脂平板上。倒置平皿于37℃恒温培养箱培养12～16h，挑单个菌落接种于含150μg/mlamp的lb培养液中，剧烈振摇(230rpm)12～16h后鉴定。同时转化未加入任何外源基因的pgex-6p-1空载体作为阴性对照。
取1μl菌液做pcr，反应体系为25μl，如下：
pcr反应条件：反应条件为95℃5min；94℃30sec，55℃90sec，72℃1min；72℃10min；35个循环周期。
扩增为阳性的克隆子，取菌液送上海勤科生物科技有限公司，进行测序分析。
7)pgex-6p-1-sbp4重组蛋白的原核表达
按1：100将上述阳性pgex-6p-1-sbp4/bl21(de3)菌液加入含有amp的lb培养基，37℃，200rpm培养至od600为0.6左右，加入0.8mmol/liptg于37℃诱导4h。收集大量诱导表达的菌液，在4℃以8000rpm离心15min，弃上清，加入pbs重悬菌体沉淀后，压力破碎3次；然后4℃，12000rpm离心10min，弃沉淀，收集上清，微滤后即为重组表达的粗蛋白(图3)。
8)重组蛋白的纯化
利用glutathionesepharose4b进行重组蛋白的纯化：取1.33mlglutathionesepharose4b胶原液，1800rpm,5min离心去上清,加入10ml1×pbs，轻摇至glutathionesepharose4b胶悬浮于溶液中，1800rpm，5min离心弃上清；加入1ml1×pbs重悬，即可得50％的glutathionesepharose4b胶。诱导200ml菌体，4℃12000rpm，1min集菌，然后pbs洗涤诱导后菌体2-3次，1×pbs(一般用1/10体积)重悬菌体，超声波破碎至清亮，12000rpm，20min离心取上清，在上清中加入适量经处理过的50％的glutathionesepharose4b胶(一般20ml上清对应1ml胶)，室温摇床轻轻晃动令其吸附蛋白1h；2000rpm，5min离心弃上清；加入至少10倍体积pbs，轻摇至glutathionesepharose4b胶悬浮于溶液中，2000rpm，5min离心弃上清；重复上述步骤两次；加入1mlgstelutionbuffer，轻摇10min；2000rpm，5min离心，收集上清；重复上述步骤至少两次；sds-page电泳检测蛋白纯度，紫外分光光度计检测蛋白浓度；将蛋白分装置于-80℃保存(图3)。
实施例5：重组蛋白免疫原性及自然形式的鉴定
1)免疫原性的鉴定
将纯化后的重组蛋白先进行sds-page电泳，然后在50v电压下转移到pvdf膜上，3h后将pvdf膜用tbst-5％脱脂奶粉封闭1h，tbst洗3次，每次5min；分别将pvdf膜放入1:100稀释的东方巴贝斯虫水牛阳性血清和健康水牛血清中，室温孵育1h，tbst洗3次，每次5min；加入二抗(1:5000稀释的兔抗牛igg)，室温孵育1h，tbst洗3次，每次5min后，加入bcl显色。westernblot结果表明，纯化后的重组蛋白sbp4在70kda与东方巴贝斯虫阳性的水牛血清有特异性反应，但与健康水牛血清无反应(见图4)。
2)sbp4自然形式的鉴定
将东方巴贝斯虫的全虫抗原进行sds-page电泳，利用半干转将蛋白转移到pvdf膜上后，用tbst-5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，tbst洗3次，每次5min；分别将pvdf膜放入1:50稀释的sbp4鼠源阳性血清与阴性血清中37℃孵育2h，tbst洗3次，每次5min；加入二抗(1:2000稀释的山羊抗鼠igg)，室温孵育1h，tbst洗3次，每次5min后，加入bcl显色。westernblot结果表明，东方巴贝斯虫与sbp4阳性血清反应出现约37kda的特异性条带，与阴性血清反应无条带(见图5)。
实施例6：利用免疫荧光法鉴定东方巴贝斯虫
取1μl染虫血均匀涂于干净载玻片上制备血液涂片,吹干后，用100％冰甲醇室温固定30min，然后使用0.5％的tritonx-100通透5min，pbs洗涤3次后，用含1％(m/v)牛血清白蛋白(bsa，购自sigma公司)的pbs溶液37℃封闭1h。pbs洗3次，每次2min；加入一抗(1:50)sbp4鼠源阳性血清与阴性血清，37℃孵育1h，pbs洗3次，每次2min；加入二抗(1:1000稀释的594荧光山羊抗鼠igg及hochest进行细胞核染色)，室温孵育1h，pbs洗3次，每次2min后，使用抗荧光猝灭剂封片。在激光共聚焦显微镜下观察实验结果(图6)，可见东方巴贝斯虫的核显蓝色(hochest),sbp4显红色，二者叠加可见红细胞内的蓝色的东方巴贝斯虫核和存在于东方巴贝斯虫细胞核中的sbp4蛋白(merge)及sbp4逐渐散在分布在核周围(图6)。
序列表
<110>华中农业大学
<120>东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4及其编码的蛋白
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>945
<212>dna
<213>东方巴贝斯虫(babesiaorientalis)
<400>1
atggtggctctttccctacgcagcctacttttcgtggctctccttggctactccaaggtc60
ttcgcagaagaggaagttgttgaggaacccgttgaatttgagcctgaggttgaagattac120
taccttcaaaatgaagaaccagcgtttcaggtgcacggcgaacccgatgccatgtcattg180
gaccttctccagcccgtcaacacacaccgcatcttgaaggaaacggagggtaactctccc240
caccagattatccgctacaagcctatgcaaccattcaggttggcatccgtctcctgggca300
caggcccccatcttcgagctcgaccctgaaaagcccgaggatgcagaaaggtccatcgat360
gaagtttctgtcttccgcaactgctacgacactgttatctccgttaaggtcggtgacgaa420
gtcttcttctacaatggaaaggacgatgcattcgtacaggttgatgctgaggattgccaa480
caatacagaatggatatcgaaaagctgttcacctacgacatcaccgactgggaagaatct540
ccctgccgtactgtagagaaggtgacttcatacgttattgagtggtgccacatccacccc600
aacacctgctactacgctgacaagatcactgctaaagaccagactctctgggagaccaac660
gactctggagaacacttcggtggtgtcagcatagtcactaacggcaacgagaaacttgtc720
ggtcttcacatcgttaaaggtgaagaagggagattgctctacttccatgctgtcgatgac780
cactacaagcccattaccgacgatgagatgaaggtcatctacaatgaatacaagcagaag840
gatgaggctgagagagccaagtatgagtctgagcctcaggctactcaggaaactgagact900
acggaagaagaggtccaagaagaaaccgaaaccaccactgagtaa945
<210>2
<211>314
<212>prt
<213>东方巴贝斯虫(babesiaorientalis)
<400>2
metvalalaleuserleuargserleuleuphevalalaleuleugly
151015
tyrserlysvalphealagluglugluvalvalglugluprovalglu
202530
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