本发明涉及桑黄领域，具体是一种有利于桑黄中黄酮类物质富集的液体发酵培养方法。
背景技术：
桑黄为珍贵稀有的药用真菌，生长被子植物的树干上，如桑树、杨树、松树等，有“森林黄金”之称，认为是已知高等真菌中抗癌效果最好的珍稀药用菌类之一，已成为药用真菌研究领域的一个热点。桑黄中含有多种化学成分，其中，多糖、黄酮和酚类等物质为其主要有效成分。现代药理作用研究表明，桑黄具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、抑菌、消炎、保肝护肝及抑制尿酸等多种药理活性。桑黄也是国际公认的使用免疫疗法治疗癌症的领域中有效率排在前茅的一种真菌。桑黄及其提取物是通过激活人体免疫系统从而产生治疗功效，因此对人体无毒无害，即使长期大剂量服用也无任何毒副作用。对于其他各种因免疫系统异常而引起的疾病如糖尿病，肝功能异常等也有其特别的效果。然而，高等真菌中的次生代谢产物面临着资源匮乏、生物分离、鉴定、生物合成的新陈代谢和筛选模型等诸多挑战，使其大规模生产受到了限制。但是由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，自然界中桑黄子实体稀少，虽能人工栽培出桑黄子实体，但所需条件苛刻，生物学效率低，目前难以实现规模化栽培，自然界中桑黄子实体稀少，野生真菌价格十分昂贵，目前难以实现规模化栽培。针对该问题，目前较多采用液体深层发酵技术，该技术具有无菌、生产条件可控、短时间内可获得大量细胞产物和代谢物、可自动化控制及规模化生产等优点，然而，不少学者对药用真菌发酵进行研究但得到次级代谢产物含量比较低，因此，为了加强药用真菌次生代谢产物的产量，有必要对培养基成分、各种发酵工艺参数进行研究，以期其产量能够达到理想水平。
目前对于桑黄有效成分研究主要集中于多糖类化合物，而桑黄是少有的可以产生黄酮类化合物的药用真菌，研究报道黄酮类化合物具有广泛的药理作用。此外，对于桑黄发酵培养研究中，主要评价其菌丝体及多糖类化合物的产量，对其中黄酮类化合物的考察相对较少。因此，在药用真菌桑黄的液体培养条件方面，以其菌丝体中次生代谢产物中黄酮类化合物的含量为目标，开发具有有利于黄酮类化合物富集的液体培养方法具有现实意义。
现有的桑黄液体发酵培养基优化技术如下：第一，综合碳氮源的筛选:以基础培养基为对照，分别以2%豆粉、1%豆粉+1%玉米粉、2%麸皮、2%花生粉为综合碳氮源，替代基础培养基中的玉米粉，其他成分不变，接种10%的液体菌种，28℃、180r/min振荡培养3.5d，测定菌丝体产率；第二，最适碳源、源的筛选:以基础培养基为对照，分别添加2%的蔗糖、2%乳糖、2%可溶性淀粉替代葡萄糖，其他成分不变，接种10%的液体菌种，28℃、180r/min振荡培养3.5d，测定菌丝体产率，在碳源试验基础上，分别以1%的酵母膏、牛肉膏、硫酸铵及1%混合氮源(蛋白胨酵母膏=1)代替基础培养基中的蛋白胨，同法进行最适氮源的筛选试验；第三，正交试验因素及水平:根据单因素试验结果，选取最适的碳源、氮源、综合碳氮源，采取l9(34)正交试验的方法对发酵培养基配方进行优化；第四，桑黄液体发酵培养条件优化：采用常规实验方法对发酵培养基初始ph值、培养温度、接种量、装液量及摇床转速进行优化实验，发酵实验的基础培养条件:接种10%的液体菌种，于28℃、180r/min振荡培养3.5d，测定菌丝体产率；第五，桑黄液体发酵周期测定：在优化培养基及培养条件下，对桑黄菌株进行液体发酵培养，24、36、48、60、70、75、78、82、100、108h时对菌丝体产率、黄酮含量进行动态测定，确定最佳的液体发酵周期。这种方法的培养基配置不易，培养成本高，黄酮类化合物的产量却不高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种有利于桑黄中黄酮类物质富集的液体发酵培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种有利于桑黄中黄酮类物质富集的液体发酵培养方法，包括母种制备和桑黄液体培养，母种制备的具体步骤如下：
步骤一，pda培养基配方包括土豆180-210g、葡萄糖17-22g，再用蒸馏水定容至1l，ph自然值，按照配方制作培养基，各自分装于250ml的锥形瓶中，做好分类标记，用三角瓶封口膜封口，再外扎一层牛皮纸，与其他待灭菌的实验器具一同放入高压蒸汽灭菌锅，115-125℃下灭菌20-28min，降至室温后，放入超净工作台，紫外照射15-20min；
步骤二，取生长于固体斜面且生长状况优良的桑黄菌种，在超净工作台中用接种铲取1mm2的菌块接种于装有pda液体培养基的培养瓶中，放入25-28℃以及转速为150-210转/分钟的恒温振荡培养箱中；
步骤三，24小时内培养基中的菌块周围出现了细微的白色菌丝，培养基颜色为淡黄色；72小时内培养基中的菌块变成外周为细密白色菌丝的菌球，培养基颜色为黄色；培养至第五天，菌球数量增加，培养基颜色为深黄色，此时在超净工作台中向培养瓶中加入高压灭菌过的磁力转子，将培养瓶置于磁力搅拌器上，搅拌速度为1500-1800转/分钟、温度为25-28℃并且用黑纸遮盖培养；
步骤四，24小时后菌液呈黄褐色，菌丝均匀分布于菌液中并且无污染现象，继续搅拌培养，转速调至1200-1350转/分钟，培养过夜，观察菌液的颜色呈棕褐色，菌液面出现白色浮泡，即液态桑黄母种制备完成，可以进行定量接种；
桑黄液体培养的具体步骤如下：
步骤一，取土豆180-210g、葡萄糖17-22g、蛋白胨并且用蒸馏水定容至1l，蛋白胨的最终浓度为2-8g/l，ph自然值，制作培养基，各自分装于250ml的锥形瓶中，高温灭菌，放置常温，紫外消毒；
步骤二，在超净工作台中对液体培养基接入取桑黄母液500ul进行接种，置于25-28℃以及转速为150-180转/分钟的振荡培养箱中培养，72小时各培养基中的情况菌球有8-12个，直径在1.7-1.9cm，菌体颜色深黄色，培养一周后各培养基中菌球有35-45个，直径在0.7-0.9cm，菌体颜色黄褐色；
步骤三，培养15天，菌丝均已成熟，对培养液进行过滤，菌丝体过滤后装至小锥形瓶，封上过滤膜，放入零下85-零下75℃的冰箱，待冷冻干燥；
步骤四，称取菌丝体重量为0.5030-0.5320g，加入质量分数为95%的乙醇10ml中并且放置于离心管，超声50-75min，温度为66-78℃，离心8-12min，取滤液进行旋转蒸发，加入2ml的色谱甲醇溶解，得到成品。
作为本发明进一步的方案：母种制备步骤一中紫外照射的功率为45-60μw/cm2。
作为本发明进一步的方案：桑黄液体培养的步骤一中高温灭菌的温度为136-150℃，紫外消毒的功率为55-75μw/cm2。
作为本发明进一步的方案：桑黄液体培养的步骤四中超声功率为60-80w，超声频率为20-25khz。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的方法中培养基配置简单方便（基础pda培养基、土豆、葡萄糖、水并且加入适量蛋白胨），节约成本，效率较高，黄酮类化合物的产量较高，是一种可以满足市场要求的人工培养方法。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种有利于桑黄中黄酮类物质富集的液体发酵培养方法，包括母种制备和桑黄液体培养，母种制备的具体步骤如下：
步骤一，pda培养基配方包括土豆180g、葡萄糖17g，再用蒸馏水定容至1l，ph自然值，按照配方制作培养基，各自分装于250ml的锥形瓶中，做好分类标记，用三角瓶封口膜封口，再外扎一层牛皮纸，与其他待灭菌的实验器具一同放入高压蒸汽灭菌锅，115℃下灭菌20min，降至室温后，放入超净工作台，紫外照射15min，紫外照射的功率为45μw/cm2；
步骤二，取生长于固体斜面且生长状况优良的桑黄菌种，在超净工作台中用接种铲取1mm2的菌块接种于装有pda液体培养基的培养瓶中，放入25℃以及转速为180转/分钟的恒温振荡培养箱中；
步骤三，24小时内培养基中的菌块周围出现了细微的白色菌丝，培养基颜色为淡黄色；72小时内培养基中的菌块变成外周为细密白色菌丝的菌球，培养基颜色为黄色；培养至第五天，菌球数量增加，培养基颜色为深黄色，此时在超净工作台中向培养瓶中加入高压灭菌过的磁力转子，将培养瓶置于磁力搅拌器上，搅拌速度为1650转/分钟、温度为25℃并且用黑纸遮盖培养；
步骤四，24小时后菌液呈黄褐色，菌丝均匀分布于菌液中并且无污染现象，继续搅拌培养，转速调至1200转/分钟，培养过夜，观察菌液的颜色呈棕褐色，菌液面出现白色浮泡，即液态桑黄母种制备完成，可以进行定量接种；
桑黄液体培养的具体步骤如下：
步骤一，取土豆180g、葡萄糖17g、蛋白胨并且用蒸馏水定容至1l，蛋白胨的最终浓度为4g/l，ph自然值，制作培养基，各自分装于250ml的锥形瓶中，高温灭菌，放置常温，紫外消毒；
步骤二，在超净工作台中对液体培养基接入取桑黄母液500ul进行接种，置于25℃以及转速为150转/分钟的振荡培养箱中培养，72小时各培养基中的情况菌球有8个，直径在1.7cm，菌体颜色深黄色，培养一周后各培养基中菌球有35个，直径在0.7cm，菌体颜色黄褐色；
步骤三，培养15天，菌丝均已成熟，对培养液进行过滤，菌丝体过滤后装至小锥形瓶，封上过滤膜，放入零下85℃的冰箱，待冷冻干燥；
步骤四，称取菌丝体重量为0.5030-0.5320g，加入质量分数为95%的乙醇10ml中并且放置于离心管，超声50min，温度为66℃，离心8min，取滤液进行旋转蒸发，加入2ml的色谱甲醇溶解，得到成品。
实施例2
一种有利于桑黄中黄酮类物质富集的液体发酵培养方法，包括母种制备和桑黄液体培养，母种制备的具体步骤如下：
步骤一，pda培养基配方包括土豆200g、葡萄糖20g，再用蒸馏水定容至1l，ph自然值，按照配方制作培养基，各自分装于250ml的锥形瓶中，做好分类标记，用三角瓶封口膜封口，再外扎一层牛皮纸，与其他待灭菌的实验器具一同放入高压蒸汽灭菌锅，121℃下灭菌21min，降至室温后，放入超净工作台，紫外照射18min；
步骤二，取生长于固体斜面且生长状况优良的桑黄菌种，在超净工作台中用接种铲取1mm2的菌块接种于装有pda液体培养基的培养瓶中，放入26℃以及转速为150转/分钟的恒温振荡培养箱中；
步骤三，24小时内培养基中的菌块周围出现了细微的白色菌丝，培养基颜色为淡黄色；72小时内培养基中的菌块变成外周为细密白色菌丝的菌球，培养基颜色为黄色；培养至第五天，菌球数量增加，培养基颜色为深黄色，此时在超净工作台中向培养瓶中加入高压灭菌过的磁力转子，将培养瓶置于磁力搅拌器上，搅拌速度为1500转/分钟、温度为26℃并且用黑纸遮盖培养；
步骤四，24小时后菌液呈黄褐色，菌丝均匀分布于菌液中并且无污染现象，继续搅拌培养，转速调至1300转/分钟，培养过夜，观察菌液的颜色呈棕褐色，菌液面出现白色浮泡，即液态桑黄母种制备完成，可以进行定量接种；
桑黄液体培养的具体步骤如下：
步骤一，取土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨并且用蒸馏水定容至1l，蛋白胨的最终浓度为2g/l，ph自然值，制作培养基，各自分装于250ml的锥形瓶中，在145℃高温灭菌，放置常温，紫外消毒，紫外消毒的功率为70μw/cm2；
步骤二，在超净工作台中对液体培养基接入取桑黄母液500ul进行接种，置于26℃以及转速为150转/分钟的振荡培养箱中培养，72小时各培养基中的情况菌球有10个，直径在1.8cm，菌体颜色深黄色，培养一周后各培养基中菌球有40个，直径在0.8cm，菌体颜色黄褐色；
步骤三，培养15天，菌丝均已成熟，对培养液进行过滤，菌丝体过滤后装至小锥形瓶，封上过滤膜，放入零下80℃的冰箱，待冷冻干燥；
步骤四，称取菌丝体重量为0.5030-0.5320g，加入质量分数为95%的乙醇10ml中并且放置于离心管，超声60min，温度为70℃，离心10min，取滤液进行旋转蒸发，加入2ml的色谱甲醇溶解，得到成品。
实施例3
一种有利于桑黄中黄酮类物质富集的液体发酵培养方法，包括母种制备和桑黄液体培养，母种制备的具体步骤如下：
步骤一，pda培养基配方包括土豆210g、葡萄糖22g，再用蒸馏水定容至1l，ph自然值，按照配方制作培养基，各自分装于250ml的锥形瓶中，做好分类标记，用三角瓶封口膜封口，再外扎一层牛皮纸，与其他待灭菌的实验器具一同放入高压蒸汽灭菌锅，125℃下灭菌28min，降至室温后，放入超净工作台，紫外照射20min，紫外照射的功率为60μw/cm2；
步骤二，取生长于固体斜面且生长状况优良的桑黄菌种，在超净工作台中用接种铲取1mm2的菌块接种于装有pda液体培养基的培养瓶中，放入28℃以及转速为210转/分钟的恒温振荡培养箱中；
步骤三，24小时内培养基中的菌块周围出现了细微的白色菌丝，培养基颜色为淡黄色；72小时内培养基中的菌块变成外周为细密白色菌丝的菌球，培养基颜色为黄色；培养至第五天，菌球数量增加，培养基颜色为深黄色，此时在超净工作台中向培养瓶中加入高压灭菌过的磁力转子，将培养瓶置于磁力搅拌器上，搅拌速度为1800转/分钟、温度为28℃并且用黑纸遮盖培养；
步骤四，24小时后菌液呈黄褐色，菌丝均匀分布于菌液中并且无污染现象，继续搅拌培养，转速调至1350转/分钟，培养过夜，观察菌液的颜色呈棕褐色，菌液面出现白色浮泡，即液态桑黄母种制备完成，可以进行定量接种；
桑黄液体培养的具体步骤如下：
步骤一，取土豆210g、葡萄糖22g、蛋白胨并且用蒸馏水定容至1l，蛋白胨的最终浓度为8g/l，ph自然值，制作培养基，各自分装于250ml的锥形瓶中，在150℃高温灭菌，放置常温，在75μw/cm2进行紫外消毒；
步骤二，在超净工作台中对液体培养基接入取桑黄母液500ul进行接种，置于28℃以及转速为180转/分钟的振荡培养箱中培养，72小时各培养基中的情况菌球有12个，直径在1.9cm，菌体颜色深黄色，培养一周后各培养基中菌球有45个，直径在0.9cm，菌体颜色黄褐色；
步骤三，培养15天，菌丝均已成熟，对培养液进行过滤，菌丝体过滤后装至小锥形瓶，封上过滤膜，放入零下75℃的冰箱，待冷冻干燥；
步骤四，称取菌丝体重量为0.5030-0.5320g，加入质量分数为95%的乙醇10ml中并且放置于离心管，超声75min，超声功率为75w，超声频率为24khz，温度为78℃，离心12min，取滤液进行旋转蒸发，加入2ml的色谱甲醇溶解，得到成品。
以芦丁标准液为横坐标，采用亚硝酸-硝酸铝法测定桑黄菌丝体提取实施例1-3中的黄酮类化合物含量为0.13%、0.17%以及0.15%。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。