本发明涉及禽病毒检测技术领域，具体涉及一种检测新型鸡呼肠孤病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒及应用。
背景技术：
禽呼肠孤病毒(avianorthoreovirus，arv)属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属，是引起鸡病毒性关节炎的病原，主要感染肉鸡，肉蛋兼用型鸡也有感染。arv主要侵害鸡的跗关节、趾关节、胫跖关节及其肌腱，引起关节滑膜炎或腱鞘炎等。患病鸡通常呈现跛行、蹲坐、不愿走动及食欲减退甚至废绝的症状，造成了饲料转化率低、死淘残鸡增多，降低了生产效益，给家禽养殖业造成严重经济损失。自20世纪80年代中期该病在我国首次报道以来我国arv的感染情况呈现加重的趋势，临床表现也越来越多样化。
2016年，我国山东、江苏等地肉种鸡场和商品代肉鸡场相继以关节肿胀和跛行为症状的疾病。该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡都可以感染，但对商品肉鸡的危害尤为严重。发病初期主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲废绝及营养吸收不良等，随着病程的发展，感染鸡逐渐出现关节肿胀、发炎，不愿走动，跛行等症状；剖检可见关节腔内纤维素性渗出，腱鞘炎，腓肠腱断裂等病理变化，给我国肉鸡养殖业造成严重的经济损失。
经研究发现，该病的爆发是由一种新型的鸡呼肠孤病毒感染所致，目前尚无疫苗可以进行预防，现有市售的鸡呼肠孤病毒疫苗无法对该病进行有效的防控；常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。在当前这种情况下，控制该病的有效措施是对该新型鸡呼肠孤病毒感染进行监测，以便及早发现感染鸡群对其采取隔离或扑杀措施，以减少新型鸡呼肠孤病毒感染所带来的损失。
目前，对于禽呼肠孤病毒的检测方法主要包括细胞学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断三大类，其中，细胞学诊断技术主要是利用细胞分离培养和电镜观察。该方法操作较为繁琐，检测周期长，检测条件要求较高。免疫学诊断技术主要包括酶联免疫吸附测定(elisa)和免疫荧光方法，该类方法灵敏较高，但对抗体要求也高。分子生物学诊断技术主要包括传统聚合酶链式反应(pcr)方法以及荧光pcr方法，而传统pcr方法只能对病毒感染定性，不能定量，灵敏度也较低；荧光定量pcr技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛的应用。目前已有采用荧光定量pcr方法检测牛群中呼肠孤病毒的报道，但由于该新型鸡呼肠孤病毒系首次报道，针对哺乳动物和其他禽类的呼肠孤病毒诊断策略不能用于该新型鸡呼肠孤病毒的检测，迄今仍未有检测该新型鸡呼肠孤病毒的有效方法。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测新型鸡呼肠孤病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒及应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一组引物和探针，所述引物的核苷酸序列如seqidno.1-seqidno.2所示；所述探针的核苷酸序列如seqidno.3所示。具体如下：
正向引物：m1-f：5’-atggcctatctagccacacctg-3’；(seqidno.1)
反向引物：m1-r：5’-caacgtgatagcatcaatagtac-3’；(seqidno.2)
荧光探针：5’-fam-tgctaggagtcggttctcgca-bhq1-3’；(seqidno.3)
本发明的第二方面，提供上述引物和探针在制备检测新型鸡呼肠孤病毒的试剂或试剂盒中的应用。
所述新型鸡呼肠孤病毒已于2018年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v201817，地址：中国武汉，武汉大学。
本发明的第三方面，提供一种检测新型鸡呼肠孤病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒，所述荧光定量rt-pcr试剂盒含有上述的引物和探针。所述鸡呼肠孤病毒的保藏编号为cctccno：v201817。
进一步的，所述荧光定量pcr试剂盒中还包括：标准品和荧光定量pcr反应试剂。
优选的，所述标准品由如下方法制备而成：
采用seqidno.1-seqidno.2所示的引物扩增保藏编号为cctccno：v201817的鸡呼肠孤病毒的基因组，得到扩增产物，将扩增产物连接到载体上，筛选阳性克隆并提取质粒dna，即制备得到标准品。
所述荧光定量pcr反应试剂包括：onesteprt-pcrbuffer、takaraextaqhs和primescriptrtenzymemixⅱ。
本发明的第四方面，提供一种检测新型鸡呼肠孤病毒的检测试剂，所述检测试剂含有上述的引物和探针。
本发明的第五方面，提供上述荧光定量rt-pcr试剂盒或上述检测试剂在如下(1)-(3)中任一种中的应用：
(1)对鸡感染新型鸡呼肠孤病毒进行流行病学调查；
(2)对血液或血清制品中的新型鸡呼肠孤病毒污染进行监控；
(3)精确检测新型鸡呼肠孤病毒拷贝数，明确鸡呼肠孤病毒的感染进程。
本发明的第六方面，提供一种利用上述荧光定量rt-pcr试剂盒检测鸡呼肠孤病毒的方法，包括如下步骤：
(1)将标准品进行梯度稀释，之后进行荧光pcr反应，根据标准品的浓度和ct值，绘制荧光定量标准曲线；
(2)提取待测样品总rna，进行荧光pcr反应，收集待测样品荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到ct值及扩增曲线，对待测样品进行定性和定量检测。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中，荧光pcr反应的程序为：42℃5min，95℃10sec，reps：1；95℃5sec，60℃34sec，reps：40。
本发明的有益效果：
(1)针对新发现的能够导致肉鸡关节肿大、跛行的新型鸡呼肠孤病毒，本发明设计了可以对该新型鸡呼肠孤病毒进行检测的荧光定量rt-pcr试剂盒，该试剂盒的特异性强，只与新型鸡呼肠孤病毒特异性结合，与其他鸡源病毒，如禽流感病毒(aiv(h9n2))、禽痘病毒(apv)、新城疫病毒(ndv)、腺病毒(fav)、减蛋综合征病毒(edsv)、传染性法氏囊病毒(ibdv)及传染性支气管炎病毒(ibv)等都没有交叉反应。
(2)检测的灵敏度高，在标准品为4×101-4×109拷贝范围内都有极好的线性关系，检测范围可达9个数量级，可以高效检测新型鸡呼肠孤病毒病鸡组织以及无临床症状的病毒携带鸡，提高了检测效率。
(3)采用本发明的试剂盒能够对新型鸡呼肠孤病毒感染进行监测，以便及早发现感染鸡群对其采取隔离或扑杀措施，以减少新型鸡呼肠孤病毒感染所带来的损失；还可以对鸡感染呼肠孤病毒进行流行病学调查，以及对血液或血清制品中的鸡呼肠孤病毒污染进行监控。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所介绍的，2016年，我国山东、江苏等地肉种鸡场和商品代肉鸡场相继以关节肿胀和跛行为症状的疾病。该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡都可以感染，但对商品肉鸡的危害尤为严重。发病初期主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲废绝及营养吸收不良等，随着病程的发展，感染鸡逐渐出现关节肿胀、发炎，不愿走动，跛行等症状；剖检可见关节腔内纤维素性渗出，腱鞘炎，腓肠腱断裂等病理变化，给我国肉鸡养殖业造成严重的经济损失。研究发现该病的流行是由新型鸡呼肠孤病毒引起的。目前尚无能够有效控制该新型鸡呼肠孤病毒感染的药物和方法。基于此，本发明提出了一种能够检测该新型鸡呼肠孤病毒的荧光定量pcr试剂盒，以便能及早发现感染鸡群对其采取隔离或扑杀措施，以减少新型鸡呼肠孤病毒感染所带来的损失。
我们知道，禽呼肠孤病毒的宿主范围较广，各种禽类中普遍存在这种病毒，自1954年以来已经在鸡、鹅、鸽子、鸵鸟、鸭、火鸡及其它野鸡等多种发病或是健康的禽类中分离到呼肠孤病毒，而从不同宿主中分离到的呼肠孤病毒其存在较大的变异性，其致病性、基因序列和主要蛋白的编码都存在差异。
本申请发明人从具有关节肿胀、跛行症状的肉鸡肌腱组织中分离出一株n-arv-ly383，禽类呼肠孤病毒基因由分节段的10个基因片段(包括：l1-l3、m1-m3、s1-s4)组成，本发明对上述新分离的鸡呼肠孤病毒n-arv-ly383进行了全基因组测序，并分别将10个基因片段与现有报道的禽呼肠孤病毒进行了序列比对和同源性分析，结果发现，新分离毒株n-arv-ly383的10个基因片段多位于一个相对独立的分支中，说明新分离的毒株n-arv-ly383不同于其他的禽呼肠孤病毒，为正呼肠孤病毒属的1个单独种。并将该新型鸡呼肠孤病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v201817。与现有的禽呼肠孤病毒相比，本发明的鸡呼肠孤病毒n-arv-ly383全基因组中的10个基因片段均发生了基因重组和突变，因此，本发明所要检测的新型鸡呼肠孤病毒和现有报道的鸡呼肠孤病毒存在变异性，现有技术中对于已报道的鸡呼肠孤病毒尚无有效的检测方法，对于该新型鸡呼肠孤病毒的检测其难度更大。
对于荧光定量rt-pcr检测而言，如何设计引物和探针序列是保证检测有效性的关键。虽然现有技术中有诸多引物设计的软件和引物设计原则等，但要设计得到特异性强、灵敏度高的引物和探针组合，并非是通过引物设计软件就可以简单获得的，这需要技术人员利用其专业知识不断的选择优化靶标区域，再根据优化的靶标区域进行引物设计，以及对设计的引物进行反复的筛选、优化、再设计。具体而言，由于本发明所要检测的新型鸡呼肠孤病毒不同于现有报道的鸡源呼肠孤病毒，如何特异性的检测本申请的新型鸡呼肠孤病毒，而避免与其它鸡源病毒发生交叉反应，是本发明引物和探针设计的难点所在。对于呼肠孤病毒的检测，有的以s6节段保守区设计引物，有的以s7基因保守区设计特异性扩增引物和taqman探针，因此，对于呼肠孤病毒的检测而言，如何选择靶标区域进行引物和探针设计目前尚无统一的认知。本发明在试验过程中对进行引物和探针设计的靶标区域进行了优化，结果发现，以该新型鸡呼肠孤病毒的m1基因的序列保守区进行引物和探针设计，可以实现对该新型鸡呼肠孤病毒的特异性检测。
本发明所设计的引物、探针进行配合使用，二者相辅相成，在设计过程中又进一步充分考虑了荧光定量pcr的反应条件，避免引物、探针之间的相互干扰，最终设计了本申请引物、探针。其中：
正向引物：m1-f：5’-atggcctatctagccacacctg-3’；(seqidno.1)
反向引物：m1-r；5’-caacgtgatagcatcaatagtac-3’；(seqidno.2)
荧光探针：5’-fam-tgctaggagtcggttctcgca-bhq1-3’；(seqidno.3)
荧光探针的5’端标记荧光报告基团fam，3’端标记荧光淬灭基团bhq1，扩增片段长度93bp。
本发明在试验过程中，还通过呼肠孤病毒基因的其它保守区序列以及其他的引物设计原则设计了多组不同的引物、探针，并分别进行组合，经反应后分别检测其特异性和扩增效率，以筛选最优的可用于临床检测的引物和探针组合。例如：
第一组：
正向引物：f:5’-gtaagcaacctcaggatatcg-3’；
反向引物：r；5’-tcatgtcgcgcgtcgtat-3’；
荧光探针：5’-fam-tcaaaatggtggacttcagtttcgat-tmara-3’。
第二组：
正向引物：f:5’-tgacaggcctgactacgtta-3’；
反向引物：r；5’-atgcttgaagtgagacgtac-3’；
荧光探针：5’-fam-tgcgagtcggttcagtttcgat-tmara-3’。
结果发现，以采用本发明的引物与探针组合(seqidno.1-seqidno.3)对该新型鸡呼肠孤病毒进行检测的特异性和灵敏度最优。而其他的引物和探针组合则不能对新型鸡呼肠孤病毒和其它鸡源病毒进行有效的区分，容易出现假阳性或假阴性。
本发明在试验过程中还优化了荧光定量pcr条件，在试剂盒的临床应用中最大限度减少操作，既保证灵敏度，又最大限度降低各种污染，确保结果的科学、精确。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如j.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；d.l.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。
实施例1：荧光定量pcr引物和探针的设计
根据二代测序技术获得新型鸡呼肠孤病毒(保藏编号为cctccno：v201817)的全基因组序列，全基因组序列中l1、l2、l3、m1、m2、m3、s1、s2、s3、s4这10个基因片段的序列分别如seqidno.4-seqidno.13所示。
针对m1基因的序列保守区设计特异性的引物序列和荧光探针序列，序列设计如下：
正向引物：m1-f：5’-atggcctatctagccacacctg-3’；(seqidno.1)
反向引物：m1-r；5’-caacgtgatagcatcaatagtac-3’；(seqidno.2)
荧光探针：5’-fam-tgctaggagtcggttctcgca-bhq1-3’；(seqidno.3)
荧光探针的5’端标记荧光报告基团fam，3’端标记荧光淬灭基团bhq1，扩增片段长度93bp(seqidno.14所示)。
实施例2：荧光定量pcr检测方法的建立
(1)病毒rna的提取：
采用经典的trizol法或商品化试剂盒提取待测样品总rna；
(2)荧光pcr反应体系建立：
所用一步法荧光定量试剂盒采用来自takara公司的货号为rr064a的onestepprimerscripttmrt-pcrkit试剂盒，在200μl荧光pcr反应管中依次加入2×onesteprt-pcrbufferⅲ～10μl，1×takaraextaqhs(5u/μl)～0.4μl，primescriptrtenzymemixⅱ～0.4μl，pcrforwardprimer(10μm)～0.4μl，pcrreverseprimer(10μm)～0.4μl，probe～0.8μl，roxreferencedyeordyeⅱ(50×)～0.4μl，步骤(1)中提取的待测样品totalrna～2μl，使用rnasefreedh2o补充至20μl体系。置于abi7300fast荧光定量pcr仪中进行反应，反应条件为42℃5min，95℃10sec，reps：1；95℃5sec，60℃34sec，reps：40。
(3)标准曲线的制备：
为了准确定量样本中病毒的拷贝数，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线。首先设计m1基因的正向和反向引物(seqidno.1和seqidno.2所示)，扩增新型鸡呼肠孤病毒基因组得到93bp的扩增产物(seqidno.14所示)，按照经典的分子克隆操作方法，将其连接到pmd18-t载体上，命名为pmd-m1，筛选阳性克隆并提取质粒dna，利用分光光度计测量质粒浓度，即为标准品。对标准品进行10倍梯度稀释，之后进行taqman荧光pcr反应，根据标准品的浓度和ct值，仪器软件会自动绘制出荧光定量标准曲线；具体为：y＝-3.3610x+45.655，相关系数r2＝0.9948，呈现良好的线性关系；其中，x代表样品的拷贝数对数，y代表ct值。
(4)检测结果的判定：
根据荧光定量pcr反应收集荧光信号，再利用仪器软件处理数据，得到扩增曲线、ct值。以标准品最低浓度对应的ct值及扩增曲线作为判定依据。
结果判定方法：若待测样品荧光信号超过阈值且ct≤35.0，同时扩增曲线为平滑的“s”型，则可以判定待测样品中含有新型呼肠孤病毒。
根据荧光定量标准曲线，可以对样品中新型鸡呼肠孤病毒进行定量测定。
实施例3：试剂盒的组成、实验参数的优化及特异性、灵敏性和重复性考察
1.试剂盒的组成：
本实施例的试剂盒为荧光定量pcr试剂盒，用于检测新型鸡呼肠孤病毒(保藏编号为cctccno：v201817)。试剂盒中含有：实施例1设计的seqidno.1所示的正向引物(10μm)，实施例1设计的seqidno.2所示的反向引物(10μm)，实施例1设计的seqidno.1所示的探针，标准品和荧光定量pcr反应试剂。
标准品由如下方法制备而成：
采用seqidno.1-seqidno.2所示的引物扩增保藏编号为cctccno：v201817的鸡呼肠孤病毒的基因组，得到93bp的扩增产物，将扩增产物连接到pmd18-t载体上，筛选阳性克隆并提取质粒dna，即制备得到标准品。
荧光定量pcr反应试剂包括：2×onesteprt-pcrbufferⅲ，1×takaraextaqhs(5u/μl)，primescriptrtenzymemixⅱ，，roxreferencedyeordyeⅱ(50×)，rnasefreedh2o。
2.实验参数的优化：
对试剂盒中的引物(seqidno.1-2)的荧光定量pcr反应条件进行了优化探索，结果显示，引物为10μm，反应条件为42℃5min，95℃10sec，reps：1；95℃5sec，60℃34sec，reps：40，试剂盒敏感性、检测效果最好。
3.试剂盒的特异性、灵敏性和重复性考察
(1)特异性试验
应用该试剂盒，进行该试剂盒的特异性试验，分别以禽流感病毒(aiv(h9n2))、禽痘病毒(apv)、新城疫病毒(ndv)、腺病毒(fav)、减蛋综合征病毒(edsv)、传染性法氏囊病毒(ibdv)、传染性支气管炎病毒(ibv)、鸡呼肠孤病毒rs13株以及本发明所检测的保藏编号为cctccno：v201817的新型鸡呼肠孤病毒为模板，采用该试剂盒进行荧光定量pcr，结果发现，禽流感病毒、禽痘病毒、新城疫病毒、腺病毒、减蛋综合征病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、鸡呼肠孤病毒rs13株均不能有效扩增；只有保藏编号为cctccno：v201817的新型鸡呼肠孤病毒能够有效扩增。
以上试验结果表明，本发明试剂盒的特异性为100％，具有较强的特异性，试剂盒中引物和探针与新型鸡呼肠孤病毒特异性结合，与其他鸡源病毒都没有交叉反应。
(2)重复性试验
应用该试剂盒，进行该试剂盒的重复性试验。取1.0×103～1.0×108copies/μl6个稀释度的质粒标准品进行批内与批间重复试验，每次取3个重复样本，一次实验中三个重复样本相应的变异系数(cv)小于0.5％，说明其具有极高的重复性。
(3)灵敏性试验
将标准品稀释成不同浓度，采用该试剂盒进行检测，同时以普通pcr检测作为对比。结果发现，荧光定量pcr结果显示，本发明的试剂盒能够检测10个拷贝数的标准品，而且在101-109拷贝范围内都有极好的线性关系，检测范围可达9个数量级；而普通pcr最低只能检测到104个拷贝数的标准品。表明该试剂盒进行荧光定量pcr的灵敏度是普通pcr的至少1000倍，具有较高的灵敏度。
实施例4：本发明试剂盒的临床应用实验1
从山东、江苏等地患关节炎的病料中选取40份样本，抽提rna，用实施例2建立的荧光定量方法进行检测并分析结果。
结果判定方法：若待测样品荧光信号超过阈值且ct≤35.0，同时扩增曲线为平滑的“s”型，则可以判定待测样品中含有新型鸡呼肠孤病毒。
结果表明，40份样本中有38份样本含有新型鸡呼肠孤病毒，检出准确率为100％。
实施例5：本发明试剂盒的临床应用实验2
将临床采集到的感染新型呼肠孤病毒的关节炎发病鸡，取肿胀的肌腱组织加入5倍生理盐水后组织匀浆，反复冻融3次后，取上清接种lmh细胞，待出现稳定细胞病变后收毒。抽提病毒的rna，用实施例2建立的荧光定量方法进行检测并分析结果。
结果判定方法：若待测样品荧光信号超过阈值且ct≤35.0，同时扩增曲线为平滑的“s”型，则可以判定待测样品中含有新型鸡呼肠孤病毒。
经检测，样品中含有新型鸡呼肠孤病毒，符合预期，表明本发明的检测方法准确、可靠。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
sequencelisting
<110>山东农业大学
<120>一种检测新型鸡呼肠孤病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒及应用
<130>2018
<160>14
<170>patentinversion3.5
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<212>dna
<213>人工序列
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<212>dna
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<400>3
tgctaggagtcggttctcgca21
<210>4
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<212>dna
<213>l1基因片段
<400>4
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