本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种可应用于从动物组织中高通量提取基因组dna的试剂盒及提取方法。
背景技术：
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驴皮为马科动物驴(equusasinusl.)的干燥皮或鲜皮，是制备传统中药阿胶的原料。阿胶，乃华夏养身之瑰宝，历史悠久。汉《神农本草经》列为上品，明《本草纲目》列为滋补佳品，血肉有情之品，滋补最甚，历代均被作为女性美容养颜佳品。阿胶具有补益气血、增强体质、强心补肺、强筋健骨、美肤养颜等功效。近年来，随着人们生活水平的提高和养生保健意识的增强，阿胶所具有的多重功效越来越受到社会各界人士的关注与欢迎，阿胶的市场需求快速增长。目前，我国市场上每年出现的阿胶产品达5000吨之多。按照每年能正常出栏120万头驴，即使把进口驴皮也算上，年可生产阿胶的产量顶多也就3000来吨。这就意味着市场上销售的有四成不是纯正的阿胶。同时，我国驴养殖业发展严重滞后，驴的存栏数还呈逐年下滑之势，货源紧缺，市场上劣质皮甚至伪品(如马皮、骡皮)等纷纷出现，导致阿胶及其复方制剂产品质量差异较大。不法分子为了降低成本，在制备阿胶过程中，部分或全部掺入马皮、牛皮、骡子皮或其他动物杂皮进行熬制，通过这种方式熬制成的“假阿胶”伪品的存在，不仅危害整个阿胶市场，而且损害了消费者的利益，甚至有些“假阿胶”还存在有毒物质，不但损害了消费者的健康，还严重破坏了我国传统中药保健品的形象。因此，现急需从源头解决这一问题，建立一种高效、可靠方式鉴定驴皮真伪。
传统鉴别驴皮的方法主要通过观察产品外观，颜色，气味等来实现，然而跟驴皮同源性很近的骡子和马皮很难用传统方法来鉴别。而基于源性dna的分析鉴别方法准确度高，特异性强，在中药材源性鉴定中有具有很好的应用前景。dna源性鉴定方法主要分为基因组dna提取和分析两个步骤。基因组dna的传统提取方法有sds抽提法、苯酚抽提法、氯仿抽提法、高盐沉淀法、离子交换法和硅介质选择性吸附法等。然而，上述方法具有操作步骤繁琐、提取的dna纯度较低、部分使用有毒试剂且不适用于工业化生产中等缺点。而近几年新兴的磁珠法核酸提取操作简单，安全无毒，特别适用于自动化，高通量提取。但是目前在售dna提取试剂盒对动物皮类的裂解效果以及提取的基因组dna纯度都不能很好地满足后续检测分析步骤的要求，尤其是自动化高通量提取dna对提取试剂盒的要求更高。本发明试剂盒及提取方法适用于磁珠法高通量自动化提取基因组dna，提取的基因组dna纯度高、提取量大、效果稳定，完全满足下一步的分析检测需求且所采用的试剂安全无毒对实验人员的身体健康提供保障。
技术实现要素：
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本发明提供了一种可应用于从动物组织中高通量提取基因组dna的试剂盒及提取方法，解决了现有技术中存在的问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：
一种可应用于从动物组织中高通量提取基因组dna的试剂盒，包括裂解液、结合液、洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ、洗脱液、蛋白酶k和磁珠；
所述裂解液由以下成分制成:3m-6m异硫氰酸胍、10mm-50mmedta、2％sds、25mmnacl、0.5％-2％triton-x100、2％-5％tween-20，裂解液的ph为7.8；
所述结合液由以下成分制成：3m-6m异硫氰酸胍、1m-2mnacl、1％-2％glucose、35％-50％乙醇，结合液的ph为6.5；
所述洗涤液由洗涤液ⅰ和洗涤液ⅱ组成；所述洗涤液ⅰ由以下成分制成：4m-8m尿素、0.5mnacl、50％乙醇，洗涤液ⅰ的ph为7.5；所述洗涤液ⅱ由以下成分制成：0.5mnaac、70％乙醇，洗涤液ⅱ的ph为6.5；
所述洗脱液为ph8.0的tris溶液。
该可应用于从动物组织中高通量提取基因组dna的试剂盒的提取方法，包括如下操作步骤：
(1)试剂配制：按上述用量，分别配制裂解液、结合液、洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ和洗脱液，灭菌后备用；
(2)用裂解液裂解蛋白：取动物组织样本，至无菌离心管中，加入步骤(1)的裂解液500-800μl、蛋白酶k200-400μg，于50-60℃、800-1500rpm振荡孵育4-6h，至样本完全溶解；
(3)将步骤(2)样品溶解完全的无菌离心管离心处理，得上清液；
(4)吸取步骤(3)的上清液200-300ul，加入600-800ul步骤(1)的结合液，及10ul磁珠，充分震荡混匀，置于磁力架上吸附2min，弃去上清液；
(5)加入步骤(1)的洗涤液ⅰ600-800ul，充分震荡混匀，置于磁力架上吸附2min，弃去上清液；
(6)加入步骤(1)的洗涤液ⅱ600-800ul，充分震荡混匀，置于磁力架上吸附2min，弃去上清液；此步骤重复两次，最后弃去上清液，晾干5-10min，待乙醇挥发完全；
(7)加入预热的步骤(1)的洗脱液50-100μl，振荡混匀，磁力吸附2min，吸取上清液，即得。
本发明的有益效果:
本发明试剂盒的裂解液主要用来进一步裂解细胞，结合液提供磁珠与基因组dna结合的环境，用于促进磁珠与基因组dna的结合，使基因组dna和磁珠形成磁珠-dna复合物，而蛋白、rna以及其他代谢产物不能结合在磁珠上；洗涤液ⅰ和洗涤液ⅱ能有效去除盐分及磁珠上残余的蛋白质，并且保证基因组dna不会损失。
本发明利用各试剂的组合作用充分消化、裂解、破坏细胞去除蛋白，得到了高纯度dna。与传统的试剂盒相比，本发明试剂盒裂解速度快、提取纯度高、提取量大，所用试剂无毒无害、安全稳定高效，适用于高通量自动化生产；与传统的人工操作相比，效率大大提升，误差减少，对试剂盒的要求更高，更为精确；其原因在于：
裂解液中的sds(十二烷基磺酸钠)，将细胞膜裂解，在蛋白酶k和edta的存在下，消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使dna从核蛋白中游离出来；异硫氰酸胍是强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离，其可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。异硫氰酸胍含有强力的阴离子和阳离子基团，可以形成较强的氢键。异硫氰酸胍与sds共同作用，可以破坏疏水作用；两者结合使用可大大缩短裂解时间，为高通量自动化生产节约时间。异硫氰酸胍还为下一步提供高盐环境，易于与磁珠溶解结合纯化dna，也解决了磁珠在结合的过程中易于板结、不好分散的问题。
洗涤液中尿素可断裂氢键，其有两种机制：1、变性蛋白与尿素优先结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起n-d反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2、尿素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，其引起的变性往往是不可逆的。本发明采用4-8m尿素，高浓度尿素使蛋白质变性并抑制rnase活性，能较好的除去蛋白得到纯度较高的dna。
本发明试剂盒的成分组成及配比科学合理，相互之间协同作用，利用各试剂的组合作用充分消化裂解破坏细胞去除蛋白，得到高纯度dna。采用该试剂盒进行dna提取，能够从各种类型动物皮中提取出纯度高并且能够进行后续更高级别的分子生物学实验需要的dna，为阿胶及其相关产品的源性鉴定奠定了基础。
与现有的技术相比，本发明试剂盒应用于高通量自动化提取dna中，取样方便、操作简单、用量少、耗时短、实用，所提取的dna浓度高，纯度极好，每天按8h计算，可提取约1000个样本，完全满足工业化生产。用nano-300紫外分光光度计检测本发明方法提取的dna浓度及纯度，90％以上所获得的基因组dna浓度值处于70-300ng/ul之间，od260/280值处于1.7-1.9之间。所提取的dna可开展后续的分子生物学分析：如基因克隆、测序、荧光定量检测等。
附图说明：
图1为采用本发明实施例1的试剂盒及提取方法获得的dna的pcr扩增图谱；
图2为采用本发明实施例2的试剂盒及提取方法获得的dna的pcr扩增图谱；
图3为采用本发明试剂盒及高通量dna全自动核酸提取仪提取的dna的pcr扩增图谱；
图4为采用本发明试剂盒及高通量dna全自动核酸提取仪提取的dna的另一pcr扩增图谱；
图5为本发明试剂盒与市面现有试剂盒提取dna浓度的比较；
图6为不同样本间dna浓度的比较；
图7为本发明试剂盒与市面现有试剂盒a260/a280的比较；
图8为不同样本间a260/a280的比较；
图9为本发明试剂盒与市面现有试剂盒a260/a230的比较；
图10为不同样本间a260/a230的比较；
其中，统计分析：3组间比较使用one-wayanova，p值标注在图中；2组间比较使用tukey’sposthoctest，***p<0.001，**p<0.005，*p<0.05；line＝mean，bar＝±sem。
具体实施方式：
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。
实施例1
一种可应用于从动物组织中高通量提取基因组dna的试剂盒，包括裂解液、结合液、洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ、洗脱液、蛋白酶k和磁珠；
所述裂解液由以下成分制成:3m异硫氰酸胍、10mmedta、2％(质量百分比)sds、25mmnacl、0.5％(体积百分比)triton-x100、2％(体积百分比)tween-20，裂解液的ph用稀盐酸调节为7.8；
所述结合液由以下成分制成：3m异硫氰酸胍、1.0mnacl、1％(质量百分比)glucose、35％(体积百分比)乙醇，结合液的ph用稀盐酸调节为6.5；
所述洗涤液由洗涤液ⅰ和洗涤液ⅱ组成；所述洗涤液ⅰ由以下成分制成：4m尿素、0.5mnacl、50％(体积百分比)乙醇，洗涤液ⅰ的ph为7.5；所述洗涤液ⅱ由以下成分制成：0.5mnaac、70％(体积百分比)乙醇，洗涤液ⅱ的ph为6.5；
所述洗脱液为ph8.0的tris溶液。
采用上述试剂盒的提取方法，包括如下操作步骤：
(1)按上述量配制各溶液，高压灭菌锅灭菌后备用；
(2)取8张动物组织样本(每个1.5*0.4cm2)，(样本为久放晾干的非浸泡的样本)，分别置于1ml无菌离心管内，各离心管内加入步骤(1)的裂解液600μl、蛋白酶k400μg，于56℃、900rpm振荡孵育4h，至样本完全溶解；
(3)将步骤(2)样本溶解完全的无菌离心管，于12000rpm离心10min；
(4)用移液枪吸取200-300ul的步骤(3)离心后上清液至新的ep管中，继续加入600ul结合液及10ul磁珠，充分震荡混匀，置于磁力架上吸附2min，弃去上清液；
(5)向经步骤(4)处理后的产物中继续加入700ul洗涤液ⅰ，充分震荡混匀，置于磁力架上吸附2min，弃去上清液；
(6)向经步骤(5)处理后的产物中继续加入700ul洗涤液ⅱ，充分震荡混匀，置于磁力架上吸附2min，弃去上清液；该步骤重复两次，最后弃去上清液，晾干5-10min，待乙醇完全挥发；
(7)向经步骤(6)处理后的产物中加入60℃预热的洗脱液100μl，振荡混匀3min，磁力吸附2min，吸取上清液转移至新的ep管中，-20℃保存，即得。
用nano-300紫外分光光度计检测dna浓度及纯度，结果如下表1：
表1
由表1结果可知，本发明试剂盒提取所获得的基因组dna浓度值处于100-300ng/ul，纯度od260/280为1.8-1.9之间，通过本发明所提取的不同样本的基因组dna的纯度及浓度都能达到要求，且dna含量较稳定，纯度也较好。
如附图1所示的荧光定量pcr扩增：
利用上述提取的dna进行pcr扩增：
反应体系：总体积20ul。2*mastermix10ul；5*primermix4ul；2ul模板；双蒸水4ul。
反应程序：95℃预变性3min；95变性10s；63退火及延伸35s；共45个循环。
由图1可得，所提取的dnapcr扩增效果非常好，完全满足pcr反应所需的条件，检测结果全为驴皮样本。
实施例2
一种可应用于从动物组织中高通量提取基因组dna的试剂盒，包括裂解液、结合液、洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ、洗脱液、蛋白酶k和磁珠；
所述裂解液由以下成分制成:6m异硫氰酸胍、50mmedta、质量比2％sds、25mmnacl、体积比2％triton-x100、体积比5％tween-20，裂解液的ph用稀盐酸调节为7.8；
所述结合液由以下成分制成：6m异硫氰酸胍、2mnacl、质量比2％glucose、体积比50％乙醇，结合液的ph用稀盐酸调节为6.5；
所述洗涤液由洗涤液ⅰ和洗涤液ⅱ组成；所述洗涤液ⅰ由以下成分制成：8m尿素、0.5mnacl、体积比50％乙醇，洗涤液ⅰ的ph为7.5；所述洗涤液ⅱ由以下成分制成：0.5mnaac、体积比70％乙醇，洗涤液ⅱ的ph为6.5；
所述洗脱液为ph8.0的tris溶液。
采用上述试剂盒的提取方法，包括如下操作步骤：
(1)按上述量配制各溶液，高压灭菌锅灭菌后备用；
(2)取8张动物组织样本(每个1.5*0.4cm2)，(样本为久放晾干的非浸泡的样本)，分别置于1ml无菌离心管内，各离心管内加入步骤(1)的裂解液600μl、蛋白酶k400μg，于56℃、900rpm振荡孵育4h，至样本完全溶解；
(3)将步骤(2)样本溶解完全的无菌离心管，于12000rpm离心10min；
(4)用移液枪吸取200-300ul的步骤(3)离心后上清液至新的ep管中，继续加入800ul结合液及10ul磁珠，充分震荡混匀，置于磁力架上吸附2min，弃去上清液；
(5)向经步骤(4)处理后的产物中继续加入600ul洗涤液ⅰ，充分震荡混匀，置于磁力架上吸附2min，弃去上清液；
(6)向经步骤(5)处理后的产物中继续加入600ul洗涤液ⅱ，充分震荡混匀，置于磁力架上吸附2min，弃去上清液；该步骤重复两次，最后弃去上清液，晾干5-10min，待乙醇完全挥发；
(7)向经步骤(6)处理后的产物中加入60℃预热的洗脱液50μl，振荡混匀3min，磁力吸附2min，吸取上清液转移至新的ep管中，-20℃保存，即得。
用nano-300紫外分光光度计检测dna浓度及纯度，结果如下表2：
表2
由表2结果可知，本发明试剂盒提取所获得的基因组dna浓度值处于100-300ng/ul，纯度od260/280为1.8-1.9之间，通过本发明所提取的不同样本的基因组dna的纯度及浓度都能达到要求，且dna含量较稳定，纯度也较好。
利用上述提取的dna进行荧光定量pcr扩增，如附图2所示：
反应体系：总体积20ul。2*mastermix10ul；5*primermix4ul；2ul模板；双蒸水4ul。
反应程序：95℃预变性3min；95变性10s；63退火及延伸35s；共45个循环。
实施例3
采用本发明的试剂盒，用高通量dna全自动核酸提取仪提取，包括如下操作步骤：
(1)按上述量配制各溶液，高压灭菌锅灭菌后备用；
(2)取192张动物组织样本(每个1.5*0.4cm2)，(样本为久放晾干的非浸泡样本)，放于2个96孔方孔板中，分别各加入600ul裂解液，400ug蛋白酶k，56℃900rpm振荡孵育4h,按以下步骤提取dna；
(3)将步骤(2)样本溶解完全的96孔方孔板2板，于12000rpm离心10min；
(4)将离心好的2板96孔方孔板放于dna核酸提取仪中，将配置好的结合液+磁珠(60:1)、洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ倒入溶液槽内，将96圆孔板、磁力架、枪头、废液槽放入相应的位置，关闭玻璃门；
(5)打开电脑按设定好的程序进行核酸提取，程序步骤为：样本200ul，结合液600ul，磁珠10ul，混匀，震荡10min，磁力吸附2min，弃去上清液；洗涤液ⅰ700ul，震荡2min，磁力吸附2min，弃去上清液；洗涤液ⅱ700ul，均震荡2min，磁力吸附2min，弃去上清液，此步骤重复两次；晾干5-10min，待乙醇挥发；加入洗脱液，按每个样品100μl，振荡混匀3min，磁力吸附2min，将dna样本收集到96孔收集板中。(全自动化操作，无需人工，每次可提样本192个，约1.5h)；
(6)将2板盛有dna样本的96孔板拿出，-20℃保存，即得。
用nano-300紫外分光光度计检测dna浓度及纯度，结果如下表3：
表3
由表3可得，所获得的基因组dna浓度值基本处于100-300ng/ul，纯度od260/280为1.8-1.9之间；即采用本发明试剂盒，利用高通量dna全自动核酸提取仪提取不同动物组织样本的基因组dna的纯度及浓度都能达到要求，且dna含量较稳定，纯度也较好。
利用上述提取的dna进行荧光定量pcr扩增，如附图3及图4所示，根据pcr扩增曲线及ct值可看出，利用全自动高通量核酸提取仪提取的核酸样本完全满足pcr扩增要求，扩增曲线明显，ct值均在20-35之间。其检测结果为：192个样本中，2张马皮，1张骡子皮，其余均为驴皮。
将本发明试剂盒与市面现有试剂盒进行效果比较，具体如下：
1、实验目的：检验本发明研发试剂盒的使用效果
2、实验方法
(1)取8张驴皮样本(每个1.5*0.4cm2)，驴皮为盐干皮，未经浸泡和清洗处理，仅简单去毛。每张驴皮平行取3份，即分为3组每组8个样本，每组分别加入700μl市面现有试剂盒1(附图中简称试剂盒1，下同)、市面现有试剂盒2(附图中简称试剂盒1，下同)和本发明试剂盒裂解液，400μg蛋白酶k(solarbio)，56℃900rpm振荡孵育过夜(10hr)；
(2)分别取3种裂解液上清200μl，后续步骤试剂添加量按照各自说明书要求(参照表5)，磁珠统一使用博日磁珠。操作统一按照：结合振荡混匀10min，磁力吸附2min，洗涤和洗脱振荡3min。最后统一加入60℃预热的自制洗脱液100μl。
效果评价：用紫外分光光度计测定dna浓度，纯度以a260/a280、a260/a230评价。
表4试剂添加量
本试剂盒所采用的配方为：
裂解液由以下成分制成:3.5m异硫氰酸胍、50mmedta、质量比2％sds、25mmnacl、体积比1％triton-x100、体积比2％tween-20，裂解液的ph用稀盐酸调节为7.8；
结合液由以下成分制成：4m异硫氰酸胍、1mnacl、质量比2％glucose、体积比50％乙醇，结合液的ph用稀盐酸调节为6.5；
洗涤液ⅰ由以下成分组成：4m尿素、0.5mnacl、体积比50％乙醇，洗涤液ⅰ的ph为7.5；
洗涤液ⅱ由以下成分制成：0.5mnaac、体积比70％乙醇，洗涤液ⅱ的ph为6.5；
所述洗脱液为ph8.0的tris溶液。
3、实验结果
表5不同试剂盒提取dna浓度和纯度测定
从裂解效果上看，本发明试剂盒>市面现有试剂盒1>市面现有试剂盒2。因为此次使用的驴皮干燥程度很高，并且未经浸泡和冲洗处理，3种试剂盒裂解后均有未消化的残留样本，相比之下试剂盒残留最少，几乎可以全部消化，市面现有试剂盒2残留较多。
从最终提取的dna浓度和纯度上看(表5和图5-图10)，本发明试剂盒表现最佳，浓度全部在100ng/μl以上，a260/a280均在1.8左右且样品间差异很小，a260/a230虽然未达到2.0，但相比其他两种试剂盒较高且稳定。
4实验结论
通过与市面现有试剂盒1和市面现有试剂盒2的比较可以看出，本发明试剂盒在裂解样本能力上、样品适用性上、提取dna的浓度和纯度上均明显优于前两者，表明本发明试剂盒研发较为成功。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。