本发明涉及一种产多糖空间珊瑚状猴头菌st21-3及其在提高生物免疫活性中的应用。
背景技术
猴头菌多糖(hericiumerinaceuspolysaccharides，hep)由葡萄糖、半乳糖、甘露糖组成，是通过β-(1，3)苷键连接的主链和β-(1，6)苷键连接的支链构成的葡聚糖，是猴头菌经发酵产生的一种重要功能活性物质。猴头菌多糖包括菌丝体细胞内的多糖和发酵液中的多糖。其中猴头菌丝体多糖除了具有免疫调节活性外，还具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗氧化等生物活性。猴头菌多糖免疫调节活性表现在：能提高自然杀伤细胞的活性、促进迟发型超敏反应的发生(抗过敏反应)，增强巨噬细胞的吞噬功能，而对体液免疫和免疫器官的增殖作用不明显。这表明猴头菌菌丝体多糖主要通过增强免疫细胞的活性来调节机体的免疫功能。此外，许多研究证明，猴头菌多糖在治疗胃炎、消化道溃疡，提高机体耐缺氧能力，增加心脏血液输出量，加速机体血液循环等方面具有重要作用，是一种食药两用的功能菌。
目前国内外学者对猴头菌的研究主要集中在对多糖物质提取条件的优化以及所含物质结构的分析，对于多糖物质的免疫调节活性研究还处于起步阶段，而空间微生物的研究也大多停留在对空间病原菌、腐生菌和制药方面的应用，对于食品空间微生物的开发尚处于萌芽阶段。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种产多糖空间珊瑚状猴头菌st21-3及其在提高生物免疫活性中的应用。
本发明提供的珊瑚状猴头菌(hericiumcoralloides)fullarton-h-st21-3，于2018年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为cgmccno.15379。
本发明还保护珊瑚状猴头菌(hericiumcoralloides)fullarton-h-st21-3或其菌丝体在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(1)和/或(2)：
(1)提高免疫细胞活性；
(2)提高机体免疫力。
本发明还保护一种猴头菌菌丝体多糖的制备方法，包括如下步骤：培养珊瑚状猴头菌(hericiumcoralloides)fullarton-h-st21-3，得到菌丝体；从菌丝体中提取多糖，得到所述珊瑚状猴头菌菌丝体多糖。
所述方法中，采用种子发酵培养基培养所述珊瑚状猴头菌(hericiumcoralloides)fullarton-h-st21-3。
所述方法中，所述培养条件为28℃、160r/min振荡培养。
所述方法具体可为：
(a)将珊瑚状猴头菌(hericiumcoralloides)fullarton-h-st21-3接种于种子发酵培养基中培养；
(b)完成步骤(a)后，将培养物按照按10％(体积百分比)的接种量移入种子发酵培养基培养，收集菌丝体；从菌丝体中提取多糖。
所述(a)中，所述培养条件为28℃、160r/min振荡培养，所述培养时间为12天。
所述步骤(b)中，所述培养条件为28℃、160r/min振荡培养，所述培养时间为5天。
所述方法中，收集菌丝体的方法具体为：将培养体系以三层无菌纱布过滤，收集菌丝体(收集后可用无菌蒸馏水洗涤3-4次后，进行真空冷冻干燥)。
所述方法中，从菌丝体中提取多糖的方法具体为：将菌丝体冻干后破碎成粉末，与蒸馏水混合后沸水浴提取2h，三层纱布过滤后收集提取液(可将残渣重复提取后将提取液合并)，将提取液进行醇沉(条件可为4℃放置12h)后收集沉淀，沉淀干燥(可采用60℃恒温干燥或真空冷冻干燥)后得到所述多糖。
本发明还保护以上任一所述方法得到的猴头菌菌丝体多糖。
本发明还保护所述猴头菌菌丝体多糖在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(1)和/或(2)：
(1)提高免疫细胞活性；
(2)提高机体免疫力。
本发明还保护一种产品，其活性成分为珊瑚状猴头菌(hericiumcoralloides)fullarton-h-st21-3或其菌丝体；所述产品的用途为如下(1)和/或(2)：
(1)提高免疫细胞活性；
(2)提高机体免疫力。
本发明还保护一种产品，其活性成分为所述猴头菌菌丝体多糖；所述产品的用途为如下(1)和/或(2)：
(1)提高免疫细胞活性；
(2)提高机体免疫力。
本发明还保护一种用于制备猴头菌菌丝体多糖的试剂盒，包括珊瑚状猴头菌(hericiumcoralloides)fullarton-h-st21-3和种子发酵培养基。
以上任一所述产品具体可为食品、药品或保健品等。
以上任一所述种子发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述种子发酵培养基中的浓度如下：可溶性淀粉15-25g/l，葡萄糖25-35g/l，酵母浸粉5-15g/l，七水合硫酸镁0.5-0.7g/l，磷酸二氢钾2.5-3.5g/l；所述溶剂为水。
所述种子发酵培养基中及其在所述种子发酵培养基中的浓度具体如下：可溶性淀粉20g/l，葡萄糖30g/l，酵母浸粉10g/l，七水合硫酸镁0.6g/l，磷酸二氢钾3.0g/l。
以上任一所述种子发酵培养基中的溶剂具体可为蒸馏水。
以上任一所述提高免疫细胞活性具体可表现为提高巨噬细胞no的释放量。
所述巨噬细胞具体可为raw264.7细胞。
本发明采用的是天宫2号和神舟11号宇宙飞船搭载返回地面经太空诱变后的猴头菌，其某些生物性状(如个体形态、菌落特征、生理生化特征、免疫活性等)、发酵生产性能(如生物量、产物量、酶活力、效价、发酵速度等)由于受到太空微重力效应、高真空、极端温差、弱磁场和高能粒子(电子、质子、重离子)辐射等诱变作用，在一定程度上改变基因突变频率进而导致功能活性的改变。
本发明以地面原始的猴头菌作为对照，选育出免疫活性较高的菌株，为空间猴头菌菌丝体多糖在提高生物免疫活性中的应用提供实践依据。同时本发明专利在一定程度上拓宽了空间微生物应用范围，填补了食品空间真菌微生物功能研发的空白。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
地面猴头菌(hericiumerinaceus)gt21：中国工业微生物保藏中心，编号14026，简称为地面猴头菌gt21。
yepd培养基：酵母浸粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂17g、蒸馏水定容至1000ml，ph6.0。
种子发酵培养基：可溶性淀粉20g、葡萄糖30g、酵母浸粉10g、七水合硫酸镁0.6g、磷酸二氢钾3g、蒸馏水定容至1000ml，自然ph值。
实施例中所用巨噬细胞为raw264.7细胞，购自美国atcc公司。
实施例1、空间猴头菌的筛选
一、菌株的太空诱变
将地面猴头菌gt21经天宫2号和神舟11号飞船搭载返回，得到若干株空间诱变菌株。
二、菌株的活化
取冻存于-80℃超低温冰箱内的空间诱变菌株和地面猴头菌gt21甘油管保藏菌种，以接种环蘸取少量菌液划线接种于yepd培养基试管斜面，28℃培养6天，连续活化3代后用于后续试验。
三、菌株的扩大培养
取步骤二活化3代的空间诱变菌株和地面猴头菌gt21接种于yepd培养基三角瓶斜面，于28℃培养6天。
四、菌株的分离纯化
完成步骤三后，取在yepd培养基三角瓶斜面生长良好的空间诱变菌株和地面猴头菌gt21，用100ml无菌生理盐水冲洗表面孢子，以无菌均质器按8次/sec，拍打1min，使孢子与菌丝体充分分离，以三层无菌纱布过滤后，得到纯孢子悬浮液。取孢子悬浮液1ml，以9ml无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取10-2孢子稀释液，以涂布方法接种于yepd培养基平板，于28℃培养6天。观察空间诱变菌株和地面猴头菌gt21的菌落性形态，挑取菌落特征与地面菌株相比差异大的空间诱变菌株单菌落，纯化培养于yepd培养基试管斜面，于28℃培养4天，得到编号为st21-1至st21-10的菌株。
五、菌株的复筛
1、菌丝体的制备
取待测菌株接种于种子发酵培养基，28℃，160r/min振荡培养12天，以无菌均质器按8次/sec，拍打1min，拍散菌丝球，按10％(体积百分比)的接种量移入种子发酵培养基，28℃，160r/min振荡培养5天，取发酵体系，以三层无菌纱布过滤，收集菌丝体，将得到的菌丝体用无菌蒸馏水洗涤3-4次后，真空冷冻干燥。
2、菌丝体粗多糖的制备
将步骤1冻干的菌丝体磨碎成粉末，称取样品1g，加入18ml蒸馏水，沸水浴提取2h后，三层纱布过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液，将提取液用蒸馏水定容于20ml，再加入无水乙醇300ml，摇匀，于4℃放置12h后，10000r/min离心20min，收集沉淀，用95％的乙醇离心洗涤2次(离心条件同上)，将沉淀60℃恒温干燥直至质量恒重，得到菌丝体粗多糖。
3、试剂配制
(1)双抗溶液的配制：取3mg的青霉素固体粉末溶于100ml的蒸馏水中，配成30μg/ml的青霉素溶液。取10mg链霉素固体粉末溶于100ml的蒸馏水中，配成100μg/ml的链霉素溶液。将青霉素溶液和链霉素溶液等体积混勻，即为双抗溶液，于-20℃保存备用。
(2)pbs(磷酸盐缓冲溶液)的配制：取0.14mol/lnacl、0.0027mol/lkcl、0.004mol/lna2hpo4和0.002mol/lkh2po4等体积混合均匀，用1mol/l的氢氧化钠微调ph至7.40，用0.22μm的滤膜无菌过滤后，用蒸馏水稀释至pbs浓度为10μg/ml，备用。
(3)检测一氧化氮griess试剂盒：碧云天公司，4℃保存。
4、培养基配制
dmem完全培养基(体积百分数)：将89％(体积百分含量)dmem高糖培养基与10％(体积百分含量)fbs(胎牛血清)和1％(体积百分含量)双抗溶液混匀，即为dmem完全培养基。
dmem高糖培养基与fbs(胎牛血清)均购自上海生工生物工程有限公司。
5、样品的制备
准确称取5mg步骤2制备的菌丝体粗多糖于无菌离心管中，用ph7.4的pbs配成5mg/ml的多糖溶液，以12000r/min离心30min，收集上清液，无菌操作转入1.5ml灭菌离心管中，用ph7.4的pbs将多糖样品稀释至1mg/ml、500μg/ml、250μg/ml。
6、巨噬细胞悬浮液的制备
选择处于对数期的巨噬细胞，吸走细胞培养瓶中的培养液，加入1mlph7.4的pbs清洗，吸走上清液，再加入0.25％的胰蛋白酶，将培养瓶放入5％co2培养箱，于37℃培养6min，加入1ml的dmem完全培养基终止消化反应，用移液枪吹打细胞，使细胞悬浮。将细胞悬浮液转入15ml无菌离心管中，以1000r/min离心5min后，吸走上清液，加入1ml的ph7.4的pbs清洗沉淀，以1000r/min离心5min，吸走上清液，加入dmem完全培养基，使细胞悬浮，用血球计数板计数，再用dmem完全培养基将细胞稀释至5×105cell/ml，即为巨噬细胞悬浮液。
7、一氧化氮(no)浓度测定
将步骤6制备的巨噬细胞悬浮液加入48孔板(购自coster公司)中，加量为180μl，每孔再加入20μl步骤5得到的不同浓度的多糖样品，ph7.4的pbs(10μg/ml)为阴性对照，lps(10μg/ml细菌脂多糖，华佰泰生物有限公司)为阳性对照，于37℃、5％co2培养箱中培养处理48h，即得巨噬细胞处理液。将griess试剂盒中的亚硝酸钠标准品用dmem完全培养基稀释成不同梯度，在另一48孔板中，按照200μl/孔的加入量，分别加入亚硝酸钠标准品和巨噬细胞hep处理液，继而再按200μl/孔加入量，室温下分别加入试剂盒中的griessreagentι试剂和griessreagentⅱ试剂，于540nm下测定吸光度值(a值)。结果如表1所示。
表1不同浓度的菌丝体多糖溶液作用于raw264.7细胞no的释放量(μmol/l)
由表1可见，st21-1至st21-10菌株的菌丝粗多糖刺激raw264.7巨噬细胞释放no的量有明显差异，并且随着菌丝多糖溶液浓度的增加而上升，其中st21-3菌株的菌丝粗多糖刺激raw264.7巨噬细胞的no释放量在各浓度下均高于其他菌株。由于巨噬细胞no释放量与体外免疫活性成正相关，因此st21-3菌株所产的菌丝多糖对raw264.7巨噬细胞的刺激作用最强，no释放量为47.21μmol/l，是地面菌株gt21菌丝体多糖作用于raw264.7细胞no释放量的3.91倍，表明st21-3菌株体外免疫活性较高，可成为提高生物免疫活性最有价值的菌株。
六、st21-3菌株的形态学鉴定与分子生物学鉴定
1、st21-3菌株的菌落特征：菌落白色，略呈微黄色，毛毡状，表面有很多不规则的球形隆起，气生菌丝体羊毛状。背面自菌落中心逐渐由白色转变为黄色、黄褐色，变色逐渐扩大并加深。
2、检测st21-3菌株的18srdna，测序结果如序列表1的序列所示。18srdna鉴定结果显示st21-3菌株与珊瑚状猴头菌(hericiumcoralloides)的相似99％以上。经过形态学及18srdna鉴定，可以确定st21-3菌株属于珊瑚状猴头菌。
七、st21-3菌株的保藏
将st21-3菌株命名为珊瑚状猴头菌(hericiumcoralloides)fullarton-h-st21-3，于2018年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为cgmccno.15379。珊瑚状猴头菌(hericiumcoralloides)
fullarton-h-st21-3简称为珊瑚状猴头菌sst21-3。
八、遗传稳定性
将珊瑚状猴头菌sst21-3菌株传代培养，进行遗传稳定性试验，通过测定每一代不同浓度的菌丝体多糖溶液对巨噬细胞raw264.7细胞no释放量的影响，判断遗传稳定性，结果如表2所示。
表2st21-3的10代不同浓度的菌丝体多糖溶液对raw264.7细胞no释放量的影响(μmol/l)
由表2可见，st21-3传10代以后，no释放量仍然处于较高水平，说明不同浓度多糖溶液对raw264.7细胞的免疫活性处于较高水平，可以基本判断珊瑚状猴头菌sst21-3在提高免疫生物活性方面具有遗传稳定性。
实施例2、猴头菌st21-3菌丝体多糖测定
1、菌丝体的制备
取珊瑚状猴头菌sst21-3接种于种子发酵培养基，28℃，160r/min振荡培养12天，以无菌均质器按8次/sec，拍打1min，拍散菌丝球，按10％(体积百分比)的接种量移入种子发酵培养基，28℃，160r/min振荡培养5天，取发酵体系，以三层无菌纱布过滤，收集菌丝体，将得到的菌丝体用无菌蒸馏水洗涤3-4次后，真空冷冻干燥。
2、菌丝体粗多糖的制备
将步骤1冻干的菌丝体磨碎成粉末，称取样品1g，加入18ml蒸馏水，沸水浴提取2h后，三层纱布过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液，将提取液用蒸馏水定容于20ml，再加入无水乙醇300ml，摇匀，于4℃放置12h后，10000r/min离心20min，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得到菌丝体粗多糖。
3、标准曲线的绘制
取标准葡萄糖105℃烘干至恒重，配成10mg/ml的葡萄糖标品母液，再用容量瓶定容稀释200倍至50μg/ml，即为葡萄糖标准溶液。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准葡萄糖溶液置于试管中，用蒸馏水补至1ml，再加入5％(质量百分比)苯酚水溶液0.5ml，混匀后迅速加入浓硫酸(质量分数98％)2.5ml，使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管置于沸水浴中反应15min，水浴冷却10min至室温，用紫外分光光度计测定其在490nm下的吸光度值(a值)，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为y＝0.0152x+0.0208(r2＝0.9995)。
4、总糖含量测定
用苯酚-硫酸法测得的总糖含量为多糖含量。用万分之一的电子天平称取10mg步骤2制备的粗多糖，溶于50ml蒸馏水中，而后再用蒸馏水稀释至多糖浓度在标准曲线范围内，得到待测样品溶液。取1ml稀释后的待测样品溶液至试管中，加入5％(质量百分比)苯酚溶液0.5ml，混匀后迅速加入浓硫酸(质量分数98％)2.5ml，使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管置于沸水浴中反应15min，水浴冷却10min至室温，用紫外分光光度计测定其在490nm下的吸光度值(a值)。将测得的吸光度y值代入葡萄糖标准曲线回归方程中，即得到多糖含量x值(mg/ml)。珊瑚状猴头菌st21-3菌丝体多糖结果如表3所示。
由于粗多糖在制备时已经过醇沉去除小分子，故粗多糖中还原糖含量极低，可以忽略不计。
菌丝多糖总含量＝发酵菌丝生物量×菌丝多糖含量/100。
表3珊瑚状猴头菌st21-3菌丝体多糖结果
由表3可知，珊瑚状猴头菌sst21-3菌丝体生物量为3.52g/100ml，多糖含量为1.08mg/100ml，多糖总量为38.17mg/100ml。
序列表
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