本发明涉及免疫细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种人t淋巴细胞培养用的无血清培养基及制备方法和培养方法。
背景技术：
癌症是现今社会人类健康最为关注的话题，一直以来，人们谈癌色变，癌症的发病率每年也都持续增高；攻克癌症，成为医学界的一大难题。生物免疫细胞疗法目前被国际公认为最具前景的方法之一，这其中t、car-t技术是医学家们近年以来的研究热点；而car-t技术需要经基因工程技术改造后嵌合抗原受体的t细胞大量扩增。因此，高效、稳定、安全的t、car-t细胞培养基已经成为细胞培养技术成败的关键因素之一。
2017年10月，国家最新的免疫细胞制备管理规范已经出台，建议避免添加任何来源的血清：生产用原材料及辅料应符合《中国药典》相关规定或与国际。生产过程中，应尽可能避免使用人源或动物源性原材料。如确有必要使用动物源性成分，任何动物源性的成分均应可溯源并提供外源因子风险评估研究资料。涉及牛源性物质的，需按国家食品药品监督管理局的有关规定具备非疫区来源证明。提供是否有bse/tse风险的声明。建议使用重组产品替换动物源性原材料，最大限度降低产品安全风险(药品注册管理办法(修订稿)》意见)。
t淋巴细胞培养技术中需t细胞大量扩增，而t细胞自身增殖能力不强，因此目前用来培养t细胞的培养基，多为需在体外扩增阶段，不断添加市售胎牛血清、人ab血清、或患者的自体血清(外周血经淋巴细胞分离液分离出的血浆)的细胞培养基，尚无法实现“完全”无血清培养。
胎牛血清：使用含胎牛血清的培养基在培养细胞时存在诸多安全问题，胎牛血清的成分复杂，诸多生物因子无法明确检测，培养基的可重复性低，影响实验的准确性，且在2009年4月29日发布的国家有关免疫细胞制备指导守则中明确规定，严禁细胞制品中残留动物血清蛋白，增加临床风险；
人ab血清：存在伦理及血源安全性问题，在2009年4月29日发布的国家有关免疫细胞制备指导守则中同样明确规定，禁止添加同种但异体血清，如人ab血清；
患者自体血清：在2009年4月29日发布的国家有关免疫细胞制备指导守则中规定，允许使用患者自体的血清用于患者细胞的培养，但仍存在以下问题：
自体血清收集量有限，时有无法满足培养需要的情况发生；
部分患者接受过化学药物治疗，自体血清也受到影响，从而无法使细胞大量增值。
鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种人t淋巴细胞培养用的无血清培养基，该无血清培养基不含动物血清蛋白或人ab血清或患者自体血清，且具有稳定性好，培养细胞活性高等特点，安全性高，有利于提高所的培养细胞用于试验的准确性。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述无血清培养基的方法，该制备方法无需添加动物血清蛋白或人ab血清或患者自体血清，简化了配制工序，制备步骤简单、效果好。
本发明的另一目的在于提供一种t淋巴细胞的扩增培养方法，该制备方法采用上述的无血清培养基进行培养，具有培养效果好、细胞活性高。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种人t淋巴细胞培养用的无血清培养基，其包括：3-10g/l人血白蛋白和30-100mg/l谷胱酰肽。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述无血清培养基包括：5-10g/l人血白蛋白；
优选地，所述无血清培养基包括7.5-10g/l人血白蛋白。
需要说明的是，人血白蛋白的浓度可以是3、4、5、6、7、8、9、10g/l中的任意一者或任意两者浓度之间的范围。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述无血清培养基包括：
所述无血清培养基包括：50-100mg/l谷胱酰肽。
需要说明的是，谷胱酰肽的浓度可以是30、40、50、60、70、80、90、100mg/l中的任意一者或任意两者浓度之间的范围。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述无血清培养基包括基础培养基；
所述基础培养基为rpmi1640、dmem、f12、dmem/f12或imdm。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述无血清培养基ph为6.8-7.4；
优选地，所述无血清培养基ph为7.1-7.3。
优选地，所述无血清培养基ph为7.2。
现有培养基技术配方制备的t细胞培养基或car-t细胞培养基组分及含量不尽相同，其中，一般有血清培养基或“无血清培养基”(原包装虽未添加任何血清，但在培养过程中仍需额外添加5％-20％不等的人ab血清或患者自体血浆)，在调制生产过程中，除一般含有葡萄糖、无机盐、胰岛素、转铁蛋白、胆固醇、甘油三脂等主要成分外，还含有人血白蛋白和谷胱酰肽，人血白蛋白和谷胱酰肽在培养基中起到部分替代动物血清成分，为细胞生长提供必要的增值能力的作用，而其在培养基中的添加比例，大约分别在1-3g/l和1-10mg/l之间；这两种含量比例一定程度上能够满足细胞生长的要求，如果再加以一定比例的外源血清的添加，基本能够达到细胞增值所要求的状态和数量。但无法实现完全无血清培养的效果。
谷氨酰胺，学名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，英文glutamine(gln)。是谷氨酸的酰胺。l-谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸，在体内可以由葡萄糖转变而来。为机体提供必需的氮源，促使肌细胞内蛋白质合成；通过细胞增容作用，促进肌细胞的生长和分化；刺激生长激素、胰岛素和睾酮的分泌，使机体处于合成状态。谷氨酰胺具有重要的免疫调节作用，它是淋巴细胞分泌、增殖及其功能维持所必需。作为核酸生物合成的前体和主要能源，谷氨酰胺可促使淋巴细胞、巨噬细胞的有丝分裂和分化增殖，增加细胞因子tnf、il-1等的产生和磷脂的mrna合成。提供外源性谷氨酰胺可明显增加危重病人的淋巴细胞总数、t淋巴细胞和循环中cd4/cd8的比率；在细胞培养中尝试添加不同浓度的谷氨酰胺，以获得最佳的淋巴细胞培养效果，正是此发明的根据所在。
人血白蛋白(也称基因重组白蛋白，humanserumalbumin，hsa)，是人血浆中含量最丰富的蛋白质(42±3.5g/l)，也是血浆蛋白质中少有的非糖基化蛋白之一，占血浆总蛋白的40～60％，人血白蛋白，是人血浆中含量最丰富的蛋白质(42±3.5g/l)，也是血浆蛋白质中少有的非糖基化蛋白之一，占血浆总蛋白的40～60％，提供维持细胞生长所必需的激素、微量元素等物质，在细胞生理活动中起着重要的作用。
本发明通过优化人血白蛋白和谷胱酰肽在培养基中的浓度比例，不仅实现t细胞的增殖，也实现无血清培养的效果，且具有较好的稳定性，培养细胞活性高，安全性高等特点，有利于提高所的培养细胞用于试验的准确性。
此外，由于血清中存在着各种抗体(igg),虽设计为扩增t细胞或car-t细胞，但由于这些抗体的存在，如抗cd15抗体，不可避免地使nk细胞也获得一定比例的增值，影响了高比例t细胞的获取。但进一步地，本发明人意外地发现，采用本发明提供的无血清培养基培养t细胞，可以增加了cd3+成熟性t细胞、cd8+细胞毒性t细胞的比例，有利于t细胞往期望的方向增殖，可有助于克服现有技术所培养的t细胞比例低等问题。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述无血清培养基中还含有：胰岛素、转铁蛋白、丙酮酸钠、亚硒酸钠、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、亚油酸、油酸、2-氨基乙醇盐酸盐、hepes和碳酸氢钠。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述无血清培养基中含有：2-10mg/l胰岛素、5-20mg/l转铁蛋白、1-10g/l丙酮酸钠、0.1-50μg/l亚硒酸钠、0.5-100μg/l磷脂酰胆碱、0.5-100μg/l磷脂酰丝氨酸、0.1-10μg/l亚油酸、0.1-10μg/l油酸、0.01-0.1g/l2-氨基乙醇盐酸盐、1-10g/lhepes和1-5g/l碳酸氢钠。
另一方面，本发明提供了如上所述的人t淋巴细胞培养用的无血清培养基的制备方法，其包括：在搅拌状态下往基础培养基中依次添加人血白蛋白和谷胱酰肽。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在添加人血白蛋白和谷胱酰肽后，所述制备方法还包括：往基础培养基中再依次添加胰岛素、转铁蛋白、丙酮酸钠、亚硒酸钠、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、亚油酸、油酸、2-氨基乙醇盐酸盐、hepes和碳酸氢钠。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，搅拌速度为300-600rpm；
优选地，搅拌速度为400-500rpm。优选地，搅拌速度为450rpm。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在加入人血白蛋白和谷胱酰肽后，所述制备方法还包括：用盐酸或氢氧化钠调节所述无血清培养基的ph。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，调节所述无血清培养基的ph至6.8-7.4。优选的，ph7.2。
采用本发明提供的制备方法，在制备过程中无需添加动物血清蛋白或人ab血清或患者自体血清，简化了配制工序，制备步骤简单、效果好；有助于解决可能涉及的安全性、政策冲突的问题。
再一方面，本发明提供了一种t淋巴细胞的扩增培养方法，其包括：将待扩增的t淋巴细胞接种至如上所述的无血清培养基中。
本发明提供的扩增培养方法，可以实现t淋巴细胞无血清培养效果，具有稳定性好，培养细胞活性高等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中的不同浓度的人血白蛋白对t淋巴细胞增殖培养的影响结果；
图2为本发明实施例的不同浓度的谷胱酰肽对t淋巴细胞增殖培养的影响结果；
图3为本发明实施例的不同浓度的人血白蛋白、谷胱酰肽对t淋巴细胞增殖培养的影响结果；
图4为采用本发明无血清培养基培养t淋巴细胞样品1-12的与同类产品的细胞数量对比结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的人t淋巴细胞培养用的无血清培养基，其包括如下成分，见表1：
表1
本实施例的无血清培养基的制备方法如下：
制备环境：室温23±2℃、湿度55±2％、10,000级gmp洁净车间。
①将符合中国药典的超纯水或无菌注射用水，加入到无菌pet材质储液袋的不锈钢槽中，注入量为设计最终液体量的90％；
②设置搅拌器并设定搅拌速度于450rpm；
③搅拌状态下添加粉末状的dmem/f12培养基并使其溶解；
④搅拌1到2小时，直至容器内dmem/f12或imdm的原料完全混匀并溶解；
⑤根据表1用量，以表2顺序将各组分注入无菌pet材质容器中，与dmem/f12培养基混合；
表2配制本实施例提供的无血清培养基的成分的添加顺序
⑥继续搅拌1-2小时；
⑦测量液体的ph值；
⑧将盐酸或氢氧化钠10倍稀释；
⑨以稀释好的盐酸或氢氧化钠调整ph值使其在7.2左右；
⑩用符合中国药典的灭菌超纯水或无菌注射用水，制成最终设定的液体体积；
其中，用水优选灭菌超纯水或无菌注射用水，更优选无菌注射用水。
实验例1
使用添加不同浓度人血白蛋白的基础培养基培养t淋巴细胞，检测不同浓度(0、0.5、3、5、7.5、10、12.5、15g/l)的人血白蛋白对细胞增殖的影响，其他成分用量同实施例1，培养结果见图1。
随着人血白蛋白配比浓度的增加，细胞增殖效果与添加浓度成正比例关系，而达到一定浓度或超过时，培养效果曲线趋于平缓甚至降低，说明添加浓度在一定的最佳范围例如3-10g/l内，可以达到更好的细胞增殖效果。
实验例2
使用添加不同浓度谷胱酰肽的基础培养基培养t淋巴细胞，检测不同浓度(0、10、30、50、75、100、125、150mg/l)的谷胱酰肽细胞增殖的影响，其他成分用量同实施例1，培养结果见图2。
随着谷胱酰肽配比浓度的增加，细胞增殖效果与添加浓度成正比例关系，而达到一定浓度或超过时，培养效果曲线趋于平缓甚至降低，说明添加浓度在一定的最佳范围例如30-100mg/l内，可以达到更好的细胞增殖效果。
实验例3
使用同时改变浓度的白蛋白、谷胱酰肽，以含白蛋白12.5g/l和125mg/l谷胱酰肽的组合，白蛋白15g/l和谷胱酰肽125mg/l的组合的基础培养基培养t淋巴细胞，检测细胞增殖的影响，其他成分的用量同实施例1，结果见图3。
本实验例的两种培养基所培养的t淋巴细胞在第96h的培养基中的细胞总数量在4.0×107个左右，低于采用实施例1的培养基的培养效果。
实验例4
采用本申请提供的无血清培养基培养t淋巴细胞样品1-12，检测其细胞总数，结果见图4和表3。
细胞样品1-12为,从健康人志愿者12人中，采取的静脉外周血全血，并经人淋巴细胞分离液分离得来的淋巴细胞。
对照培养基采用的是，在中国境内市售的、包装及产品说明书上标注有“用于淋巴细胞培养”“无血清培养基”字样的，广泛应用于医院和培养企业的淋巴细胞培养的，一种正规培养基厂家生产的培养基。
培养方法和条件：
1.采血前日，okt-3溶液包被t225培养瓶，4℃过夜，使用前去上清，pbs冲洗2次；
2.day0：采血30ml，等量1640稀释混匀，ficoll离心，吸取白细胞层，接种于已包被的t225培养瓶，要求细胞数量不低于1*107/瓶/50ml(实施例1培养基，含1000iu/mlil-2)，取样做初步检测(细胞表型)及留样处理；放置于5％co2、37℃细胞培养箱；
3.day2：48小时取样检测细胞数；
4.day3：72小时取样检测细胞数，添加50ml本申请培养基含1000iu/mlil-2；
5.day4：96小时取样检测细胞数，补充150ml本申请培养基含1000iu/mlil-2；
6.day6：进袋培养，取少量细胞做无菌检测及留样，剩余细胞全部转移到盛实施例1培养基(含300iu/mlil-2)的细胞袋中继续培养，放置于5％co2、37℃细胞培养箱；；
7.day9：分袋培养，将实施例1培养基(含300iu/mlil-2)，全部导入袋中，混匀后，平分到两袋，继续培养，放置于5％co2、37℃细胞培养箱；
8.day12：从2袋分别取样，进行质量检测(包括无菌、流式、内毒素、支原体等安全性检测)，继续培养，放置于5％co2、37℃细胞培养箱；
9.day15：回收细胞，检测其细胞总数，结果见图4和表3，重悬细胞于含1％人血白蛋白的200ml注射生理盐水，成终产品，并从终产品取样做安全检测(内毒素)及留样保存处理。
表3本培养基与其他同类产品在细胞培养数量比较
从表3和图4可以看出，相较于对照培养基，采样本实施例1提供的无血清培养基培养t淋巴细胞可以提高细胞数量。
实验例5
采用实施例1提供的无血清培养基培养的t淋巴细胞样品1-12，检测不同表型细胞的比例，结果见下表4-6。
表4本培养基与其他同类产品在细胞表型各收获比例的流式检测比较(样品1-4)
表5本培养基与其他同类产品在细胞表型各收获比例的流式检测比较(样品5-8)
表6本培养基与其他同类产品在细胞表型各收获比例的流式检测比较(样品9-12)
从表4-表6可看出，采样本实施例提供的无血清培养基可以促进增加了cd3+成熟性t细胞、cd8+细胞毒性t细胞的比例，有利于t细胞往期望的方向增殖，可有助于克服现有技术所培养的t细胞比例低等问题。
对比例1
在最佳添加浓度范围以外，同样实施了其它浓度的添加和检测，如白蛋白浓度扩大到12.5g/l、15g/l，但并未出现期待的培养效果，见图1。
对比例2
在最佳添加浓度范围以外，同样实施了其它浓度的添加和检测，如添加谷胱酰肽浓度扩大到125mg/l、150mg/l，但并未出现期待的培养效果，见图2。
对比例3
在最佳添加浓度范围以外，同样实施了同时改变2种添加物浓度，如以白蛋白12.5g/l、15g/l，谷胱酰肽125mg/l、150mg/l的浓度，实施混合并检测其细胞培养效果，结果证明同样没有出现更好的培养效果，见图3。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。