本发明属于微生物技术领域，涉及一种蝙蝠蛾拟青霉cs-4的发酵生产工艺。
背景技术：
冬虫夏草仅仅是我国190多种虫草中的一种，主产于青藏高原上，又简称"虫草"。虫草是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，主要活性成分为虫草素、虫草酸、虫草多糖等有益于人体吸收的物质，冬虫夏草是我国传统的名贵药膳滋补品，它性平味甘，具有补肺肾、止咳嗽、益虚损、养精气之功能。据临床研究报道，冬虫夏草具有养肺阴，补肾阳、止咳化痰、抗癌防老的功效，为平补阴阳之品，诸无所忌。冬虫夏草可用于肺痨咳血，阳痿遗精等症；其药理药效的不可替代作用、生态环境恶劣等使其珍贵而稀少，随着人类生活水平的不断提高，人们对冬虫夏草的需求量越来越大，而资源量却越来越少，供求矛盾越来越突出。为了解决这一问题，近几年，我国生物医学界的研究人员先后分离出多株虫草真菌菌株，试图利用人工发酵方式生产虫草菌丝体，用以代替天然冬虫夏草。经过不懈的努力，有几家已生产出在药理、毒理及功效成份等方面与天然虫草相似的产品，并能实现现代化条件下的大规模生产。
蝙蝠蛾拟青霉cs-4是从青海采集的新鲜虫草上分离获得的菌株，在中科院微生物研究所进行了菌种鉴定，其发酵物与天然虫草有相似的成份，腺嘌呤、核苷、尿嘧啶、甘露醇、麦角甾醇等有效成份均和天然虫草相似，且药理作用优于天然虫草，毒性更小。因此，蝙蝠蛾拟青霉cs-4的大规模、高质量的工业发酵生产对于促进人们身体健康，提高生活质量有重要意义。
发酵培养虫草菌株是制备虫草产品的前提，传统的虫草菌株发酵工艺存在发酵得率低、发酵时间长和成本高等问题。因此，出现了静置发酵、间歇发酵和补料分批发酵等工艺，但这些发酵工艺仍存在各种问题，比如染菌率高、发酵周期长、成本高和发酵产物中的活性成分含量低等。因此，研究高收率、低成本，且发酵得到的虫草菌粉产品中的活性成分含量高的发酵工艺十分必要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蝙蝠蛾拟青霉cs-4的发酵生产工艺，提高发酵产物的收率及其中的活性成分含量，缩短发酵时间、降低成本。
具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
一种蝙蝠蛾拟青霉cs-4的发酵生产工艺，该发酵生产工艺包括以下步骤：
s1.斜面培养：将cs-4菌株接种到斜面培养基上，在15-20℃恒温下培养7-9天，斜面培养基中含有组氨酸；
s2.摇瓶培养：无菌条件下，往摇瓶培养基内接入步骤s1培养好的菌种，置于15-20℃恒温摇床、光照条件下培养7-9天，摇瓶培养基中含有组氨酸和维生素b1；
s3.种子罐培养：无菌条件下，按照3-5％的接种量接入步骤s2培养好的菌种，种子罐培养基中含有嘌呤；
s4.繁殖罐培养：无菌条件下，按照9-12％的接种量接入步骤s3培养好的菌种，繁殖罐培养基中含有嘌呤和嘧啶；
s5.发酵罐培养：无菌条件下，按照5-20％的接种量接入步骤s4培养好的菌种，发酵罐培养基中含有嘌呤和嘧啶；发酵罐培养结束后，得到发酵液；
或者，按照1-2％的接种量将步骤s5的发酵液接至摇瓶培养基内，按照步骤s2的条件进行摇瓶培养，然后重复步骤s3-s5，发酵培养cs-4菌株。
液体发酵培养基中添加嘌呤和嘧啶，发酵制备的虫草菌粉中核苷含量明显提高。
优选地，所述嘌呤选自腺嘌呤和鸟嘌呤中的一种或两种，所述嘧啶为尿嘧啶。
优选地，以重量体积比g/ml计，斜面培养基的组成包括葡萄糖2-4％、蛋白胨0.2-0.4％、麸皮0.4-0.8％、磷酸二氢钾0.1-0.3％、硫酸镁0.03-0.05％、组氨酸0.1-0.3％、琼脂2-4％，水余量，ph自然；摇瓶培养基的组成包括葡萄糖1-5％、蛋白胨0.2-0.4％、麸皮0.4-0.6％、磷酸二氢钾0.1-0.3％、硫酸镁0.03-0.05％、硫酸锌0.03-0.05％、组氨酸0.1-0.3％，维生素b10.05-0.1％，水余量，ph自然。
优选地，种子罐培养基、繁殖罐培养基和发酵罐培养基中含有三七粉。添加三七粉后，发酵培养得到的虫草菌粉在具备原有虫草功效的同时，还具备三七皂苷、人参皂苷的功效。此外，发酵培养基中同时添加嘌呤和三七粉后，麦角甾醇的含量明显提高。
优选地，以重量体积比g/ml计，种子罐培养基的组成包括热榨豆饼粉2-4％、葡萄糖2-4％、蔗糖2-4％、磷酸二氢钾0.2-0.4％、硫酸镁0.05-0.1％、硫酸锌0.05-0.1％、组氨酸0.1-0.2％、维生素b10.02-0.3％、豆油0.1-0.2％、腺嘌呤0.05-0.2％和三七粉0.4-0.6％，水余量，ph自然。
优选地，繁殖罐培养基的组成包括热榨豆饼粉2-4％、葡萄糖2-4％、蔗糖2-4％、磷酸二氢钾0.1-0.2％、硫酸镁0.04-0.06％、硫酸锌0.03-0.05％、组氨酸0.1-0.2％、维生素b10.1-0.2％、豆油0.2-0.3％、腺嘌呤0.03-0.1％、鸟嘌呤0.03-0.08％、尿嘧啶0.05-0.2％和三七粉0.5-0.7％，水余量，ph自然。
优选地，发酵罐培养基的组成包括热榨豆饼粉3-4％、葡萄糖1-2％、蔗糖1-2％、磷酸二氢钾0.2-0.3％、硫酸镁0.04-0.06％、硫酸锌0.04-0.06％、组氨酸0.2-0.3％、维生素b10.2-0.3％、豆油0.2-0.3％、腺嘌呤0.05-0.12％、鸟嘌呤0.03-0.08％、尿嘧啶0.05-0.2％和三七粉0.5-1.0％，水余量，ph自然。
优选地，步骤s2所述的摇床为往复式摇床，摇床振荡频率为140±5次/分，光照使用的光为红光；步骤s3种子罐培养的条件为16±3℃恒温，罐压0.02-0.05mpa，通气量(v/v·min)为1：0.5-1.8，静置培养4-5天。
优选地，繁殖罐培养的条件为16±3℃恒温，罐压0.02-0.05mpa，通气量(v/v·min)为1：0.15-0.4，静置培养5-6天。
优选地，发酵罐培养的条件为16±3℃恒温，罐压0.02-0.05mpa，通气量(v/v·min)为1：0.65-0.9，优选1：0.75，在40-60rpm转速下搅拌培养4-5天。
与现有技术相比，本发明的效果和益处在于：
(1)摇瓶培养后的cs-4菌株生长旺盛，产孢子多，为种子罐培养提供优良的菌种。各级发酵培养基的组成也略有不同，保证了不同阶段菌株生长的营养供应，得到的菌丝体产量高，营养价值高。种子罐和繁殖罐培养不需要搅拌，节省成本。
(2)培养基中添加了氨基酸、嘌呤和嘧啶，发酵培养的cs-4菌株的菌丝体生长旺盛，收率高，制备得到的虫草菌粉中的核苷含量明显提高。再往培养基中添加三七粉后，从菌粉中能够检测到皂苷，且麦角甾醇的含量明显提高。本发明还发现，嘌呤和嘧啶能促进菌株对三七粉的利用，提高菌粉中皂苷的含量。
(3)发酵罐培养结束后，将部分发酵液作为种子接入摇瓶培养基内，再次进行摇瓶培养，然后依次进行种子罐、繁殖罐和发酵罐的逐级放大培养，省去了斜面培养的过程，缩短了发酵工艺周期，降低成本。此外，以发酵液为种子进行摇瓶培养、逐级放大培养，处理得到的虫草菌粉中的各活性成分含量高。整个发酵工艺过程的自动化程度高，操作简单，适合工业化生产。
具体实施方式
本发明提供的蝙蝠蛾拟青霉cs-4的发酵生产工艺包括斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养、繁殖罐培养和发酵罐培养，发酵罐培养结束得到发酵液，按照1-2％的接种量将发酵液接至摇瓶培养基内，剩余发酵液过滤、干燥制备cs-4虫草菌粉。以发酵液为种子重复摇瓶培养和逐级放大培养的过程，再次得到发酵液，然后再部分接入摇瓶培养基，再次重复发酵工艺过程。一般，在第一次以斜面培养菌株为摇瓶培养的菌种进行发酵，得到发酵液后，可以至少连续10次使用发酵液作为摇瓶培养的种子，发酵生产cs-4菌丝体，进而制备虫草菌粉。
在一优选实施方式中，种子罐培养基中含有腺嘌呤0.05-0.2％和三七粉0.4-0.6％，繁殖罐培养基中含有腺嘌呤0.03-0.1％、鸟嘌呤0.03-0.08％、尿嘧啶0.05-0.2％和三七粉0.5-0.7％，发酵罐培养基中含有腺嘌呤0.05-0.12％、鸟嘌呤0.03-0.08％、尿嘧啶0.05-0.2％和三七粉0.5-1.0％。各培养基的ph为自然，一般在5.0-6.5。摇瓶培养在红光照射下进行，红光的波长范围在622～760nm。
斜面和摇瓶培养基的制备方法为：按计算量称量过40目筛的麸皮，按照每100ml水中加6g麸皮计算加水量，加热至沸腾，维持沸腾30分钟，过滤得滤液。然后加入其它组分，加热和/或加水溶解，加水定容，分装、灭菌。种子罐、繁殖罐和发酵罐培养基的制备方法为：量取50％的水，往其中加入各培养基组分，加热溶解后，加水定容，然后灭菌。
各种培养基的灭菌方法均为高压蒸汽灭菌，蒸汽压力0.09-0.12mpa，温度121±1℃，灭菌时间30-40分钟。
下面以具体的实施例来说明本发明。
需说明的是，本发明方法中涉及的材料和设备均为市售，其中，蝙蝠蛾拟青霉cs-4菌株于1997年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.0327。菌株cs-4分离自青海新鲜冬虫夏草，也可以通过商业途径获取。
实施例1
斜面培养基的组成为：葡萄糖2％、蛋白胨0.2％、麸皮0.4％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.03％、组氨酸0.1％、琼脂2％，水余量，ph自然。用接种铲取1cm2左右保存好的cs-4菌株，均匀涂布在斜面上，在温度15℃、湿度85％下培养7天。待生长成熟，进行外观检查，培养特征：孢子及菌丝丰满，呈白色或淡黄色毛绒状。剔除外观生长不良的斜面，将生长良好的斜面置于冰箱1-8℃保存备用。
摇瓶培养基的组成为：葡萄糖1％、蛋白胨0.2％、麸皮0.4％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.03％、硫酸锌0.03％、组氨酸0.1％和维生素b10.05％，水余量，ph自然。在无菌条件下，用接种铲子取1cm2生长旺盛的斜面菌株接入摇瓶培养基内。在15℃往复式摇床上振荡培养7天，往复式摇床振荡频率为135次/分，整个摇瓶培养过程中，使用波长在622～760nm的红光照射。摇瓶培养结束后，将各摇瓶培养好的种子合并到接种钢瓶内。
种子罐培养基的组成为：热榨豆饼粉2％、葡萄糖2％、蔗糖2％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.05％、组氨酸0.1％、维生素b10.02％、豆油0.1％、腺嘌呤0.05％，水余量，ph自然。无菌条件下，采用压差法按照3％的接种量将摇瓶培养好的菌种接入种子罐内。在温度16℃，罐压0.02mpa，通气量为1:0.5(v/v·min)的条件下，静置培养4天。
繁殖罐培养基的组成为：热榨豆饼粉2％、葡萄糖2％、蔗糖2％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.04％、硫酸锌0.03％、组氨酸0.1％、维生素b10.1％、豆油0.2％、腺嘌呤0.05％、尿嘧啶0.05％，水余量，ph自然。无菌条件下，采用压差法按照9％的接种量将种子罐内培养好的菌种接入繁殖罐内。在温度16℃，罐压0.02mpa，通气量为1:0.15(v/v·min)的条件下，静置培养5天。
发酵罐培养基的组成为：热榨豆饼粉3％、葡萄糖1％、蔗糖1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.04％、硫酸锌0.04％、组氨酸0.2％、维生素b10.2％、豆油0.2％、腺嘌呤0.05％、尿嘧啶0.05％，水余量，ph自然。无菌条件下，采用压差法按照5％的接种量将繁殖罐内培养好的菌种接入发酵罐内。在温度16℃，罐压0.02mpa，通气量为1:0.75(v/v·min)，搅拌速度为40rpm的条件下，培养4天。开始发酵后，每隔24小时取发酵液样，测定ph值、还原糖、氨基氮。当ph＜7，还原糖＜1.5％，氨基氮＜0.4mg/ml，菌浓≧14％时，发酵结束。放罐，发酵液固液分离，将固体烘干、粉碎得到cs-4虫草菌粉。
相比液体发酵培养基中不添加嘌呤和嘧啶制备的虫草菌粉，本实施例得到的菌粉中核苷含量明显提高，麦角甾醇含量也提高。
实施例2
实施例2与实施例1的区别仅在于，种子罐培养基中含有三七粉0.4％，繁殖罐培养基中含有三七粉0.5％，发酵罐培养基中含有三七粉0.5％。按照与实施例1相同的工艺条件发酵培养cs-4菌株，最后得到cs-4虫草菌粉。相比实施例1的虫草菌粉，本实施例制备的菌粉中的麦角甾醇含量明显提高，菌粉中含有皂苷。
实施例3
斜面培养基的组成为：葡萄糖3％、蛋白胨0.3％、麸皮0.6％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.04％、组氨酸0.2％、琼脂3％，水余量，ph自然。
摇瓶培养基的组成为：葡萄糖3％、蛋白胨0.3％、麸皮0.5％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.04％、硫酸锌0.04％、组氨酸0.2％，维生素b10.07％，水余量。
种子罐培养基的组成为：热榨豆饼粉3％、葡萄糖3％、蔗糖3％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.08％、硫酸锌0.06％、组氨酸0.15％、维生素b10.2％、豆油0.1％、腺嘌呤0.1％，三七粉0.5％，水余量。
繁殖罐培养基的组成为：热榨豆饼粉3％、葡萄糖3％、蔗糖3％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.04％、组氨酸0.1％、维生素b10.15％、豆油0.25％、腺嘌呤0.03％、鸟嘌呤0.08％、尿嘧啶0.1％和三七粉0.6％，水余量。
发酵罐培养基的组成为：热榨豆饼粉3％、葡萄糖2％、蔗糖2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.05％、组氨酸0.3％、维生素b10.2％、豆油0.25％、腺嘌呤0.1％、鸟嘌呤0.03％、尿嘧啶0.1％和三七粉0.6％，水余量。
按照与实施例1相同的工艺条件发酵培养cs-4菌株，最后得到cs-4虫草菌粉。本实施例制备的虫草菌粉中的活性成分含量比实施例2略高，这是鸟嘌呤和腺嘌呤相互作用的结果。
实施例4
斜面培养基的组成为：葡萄糖4％、蛋白胨0.4％、麸皮0.8％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.05％、组氨酸0.3％、琼脂4％，水余量，ph自然。用接种铲取1cm2左右保存好的cs-4菌株，均匀涂布在斜面上，在温度20℃、湿度90％下培养9天。
摇瓶培养基的组成为：葡萄糖5％、蛋白胨0.4％、麸皮0.6％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.05％、组氨酸0.3％，维生素b10.1％，水余量。在无菌条件下，用接种铲子取1cm2生长旺盛的斜面菌株接入摇瓶培养基内。在20℃往复式摇床上振荡培养9天，往复式摇床振荡频率为140次/分，整个摇瓶培养过程中，使用红光照射。摇瓶培养结束后，将各摇瓶培养好的种子合并到接种钢瓶内。
种子罐培养基的组成为：热榨豆饼粉4％、葡萄糖4％、蔗糖4％、磷酸二氢钾0.4％、硫酸镁0.1％、硫酸锌0.1％、组氨酸0.2％、维生素b10.3％、豆油0.2％、腺嘌呤0.2％，三七粉0.6％，水余量。无菌条件下，采用压差法按照5％的接种量将摇瓶培养好的菌种接入种子罐内。在温度19℃，罐压0.05mpa，通气量为1:1.8(v/v·min)的条件下，静置培养5天。
繁殖罐培养基的组成为：热榨豆饼粉4％、葡萄糖4％、蔗糖4％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.06％、硫酸锌0.05％、组氨酸0.2％、维生素b10.2％、豆油0.3％、腺嘌呤0.1％、鸟嘌呤0.03％，尿嘧啶0.2％和三七粉0.7％，水余量。无菌条件下，采用压差法按照12％的接种量将种子罐内培养好的菌种接入繁殖罐内。在温度19℃，罐压0.05mpa，通气量为1:0.4(v/v·min)的条件下，静置培养6天。
发酵罐培养基的组成为：热榨豆饼粉4％、葡萄糖1％、蔗糖1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.06％、硫酸锌0.06％、组氨酸0.2％、维生素b10.3％、豆油0.3％、腺嘌呤0.12％、鸟嘌呤0.08％、尿嘧啶0.2％和三七粉1.0％，水余量。无菌条件下，采用压差法按照15％的接种量将繁殖罐内培养好的菌种接入发酵罐内。在温度19℃，罐压0.05mpa，通气量为1:0.9(v/v·min)，搅拌速度为60rpm的条件下，培养5天。开始发酵后，每隔24小时取发酵液样，测定ph值、还原糖、氨基氮。当ph＜7，还原糖＜1.5％，氨基氮＜0.4mg/ml，菌浓≧14％时，发酵结束。放罐，发酵液固液分离，将固体烘干、粉碎得到cs-4虫草菌粉。
本实施例制备的虫草菌粉与实施例3制得的菌粉中的活性成分含量相近。
实施例5
本实施例与实施例4的区别仅在于，摇瓶培养基的种子来源是实施例4发酵结束后的发酵液，接种量为1％。按照与实施例4相同的工艺条件发酵培养cs-4菌株，最后得到cs-4虫草菌粉。该菌粉中的核苷、麦角甾醇及皂苷含量比与实施例4中的菌粉更高，原因在于菌种对嘌呤、嘧啶及三七粉的生物转化能力更强。
实施例6
本实施例与实施例4的各培养基组成相同，区别在于，摇瓶培养基的种子来源是实施例4发酵结束后的发酵液，接种量为2％。摇瓶培养条件为在18℃往复式摇床上振荡培养8天，往复式摇床振荡频率为145次/分，整个摇瓶培养过程中，使用红光照射。
种子罐培养条件为13℃恒温，罐压0.03mpa，通气量为1:1.0(v/v·min)的条件下，静置培养4天。繁殖罐培养条件为13℃恒温，罐压0.03mpa，通气量为1:0.2(v/v·min)的条件下，静置培养5天。发酵罐培养条件为13℃恒温，罐压0.03mpa，通气量为1:0.65(v/v·min)的条件下，搅拌速度为50rpm的条件下，培养5天。发酵结束后，放罐，制备cs-4虫草菌粉。本实施例得到的虫草菌粉中活性成分含量与实施例5相近，说明本实施例的工艺参数条件与实施例5一样适用。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，种子罐培养基中不含腺嘌呤，繁殖罐培养基中不含腺嘌呤和尿嘧啶，发酵罐培养基中不含腺嘌呤和尿嘧啶。按照与实施例1相同的工艺条件发酵培养cs-4菌株，最后得到cs-4虫草菌粉。本对比例制得的虫草菌粉中的核苷和麦角甾醇含量低于实施例1。
对比例2
(液体发酵培养基中添加三七粉)
本对比例与实施例2的区别在于，种子罐培养基中不含腺嘌呤，繁殖罐培养基中不含腺嘌呤和尿嘧啶，发酵罐培养基中不含腺嘌呤和尿嘧啶。按照与实施例1相同的工艺条件发酵培养cs-4菌株，最后得到cs-4虫草菌粉。相比实施例2的虫草菌粉，本对比例制备的菌粉中的核苷、麦角甾醇和皂苷含量更低，皂苷含量低说明嘌呤和嘧啶能促进菌株对三七粉的利用。相比对比例1的虫草菌粉，本对比例得到的菌粉中麦角甾醇含量有提高，说明添加三七粉能提高麦角甾醇含量。
对比例3
本对比例与实施例3的区别仅在于摇瓶培养是在黑暗的条件下进行，制得的cs-4虫草菌粉中的活性成分含量低。由此说明，摇瓶培养需要在光照条件下进行。
对比例4
本对比例与实施例3的区别仅在于摇瓶培养是在自然光的条件下进行，制得的cs-4虫草菌粉中的活性成分含量高于对比例3，但低于实施例3。由此说明，红光条件下进行摇瓶培养更有利于菌株生长。
对比例5
本对比例与实施例3的区别在于：摇瓶培养条件为在25℃往复式摇床上振荡培养8天，往复式摇床振荡频率为120次/分。种子罐培养条件为20℃恒温，罐压0.03mpa，通气量为1:0.4(v/v·min)的条件下，静置培养4天。繁殖罐培养条件为20℃恒温，罐压0.03mpa，通气量为1:0.2(v/v·min)的条件下，静置培养5天。发酵罐培养条件为20℃恒温，罐压0.03mpa，通气量为1:0.65(v/v·min)的条件下，静置培养5天。发酵结束后，放罐，制备cs-4虫草菌粉。本对比例得到的虫草菌粉中活性成分含量低，主要原因是培养条件不适合，尤其发酵罐培养不能采用静置培养。
实施例7
从实施例1-6和对比例1-5制备得到的cs-4虫草菌粉取样，测定其中的核苷(腺苷、鸟苷和尿苷)、麦角甾醇和皂苷的含量。检测结果见表1，根据检测结果可明显看到，采用本发明提供的cs-4菌株发酵生产工艺生产得到的cs-4虫草菌粉的药用价值高。
表1.制备的虫草菌粉中的核苷、麦角甾醇和皂苷含量
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。