本发明涉及植物病原分子检测技术领域，具体地，涉及桑脉带相关病毒检测引物和质粒及检测方法。
背景技术：
桑树是养蚕业的重要原料，也是药食两用的经济林作物，在食品保健、畜禽饲料、生态修复等方面得到了广泛的应用，且越来越受到人们的重视。桑花叶病作为最重要的桑树病毒病之一，在我国各蚕区发生较普遍且危害严重。桑花叶病为植物病毒病，会导致桑叶质量变差、产量下降、植株矮小和桑树抵抗力下降等问题，严重的制约着蚕桑产业的健康稳定发展。随着桑树产业的发展，目前有关桑花叶病的发生规律、检测技术和防控手段等问题亟待解决。
随着分子生物学的发展，通过高通量测序的手段发现桑中存在的一些病毒会引起桑花叶病，如蒙姣荣等（2015）通过高通量测序及酵母双杂交系统在桑花叶病病叶中发现并鉴定到了桑脉带相关病毒（mulberryveinbanding-associatedvirus,mvbav）。mvbav是广西桑树病毒病主要病原，该病毒是番茄斑萎病毒属新成员，具有番茄斑萎病毒属典型的基因组结构，为rna病毒。
在桑病毒病病原的鉴定上，由于病毒小、难分离、不可培养等特点，使其在柯赫式法则验证上存在困难，以至于阻碍了桑病毒病的发展。桑病毒病的防控主要靠隔离病原，由于桑病毒病存在潜隐现象，在不适宜的条件不会产生病症，以至于难以辨别没有症状的桑叶是否携带病原，以至于很难隔离防控。目前桑病毒病大多通过发病后病症来判断，分子检测手段应用较少。而现有技术中桑脉带相关病毒的研究较少，因此急需开发研究一种能有效检测mvbav的方法或技术手段。
病原的早期检测是控制病毒病的有效措施，将病疫扼杀在摇篮中。常规的检测手段包括生物学测定法、电子显微、血清学检测和分子生物学检测。随着现代科学的发展，病原检测技术将朝着简便、快速、准确、有效的检测方向发展，结合多种技术对病毒进行检测，将大大提高检测的速度和精确度。目前常用的单一技术有pcr、免疫捕获、巢式反应、环介导等温扩增、荧光定量等。目前尚未见有将pcr技术应用于桑脉带相关病毒的检测中。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有桑脉带相关病毒的预测监控技术的缺陷和不足，提供一种在桑脉带相关病毒出现明显病症、病害大规模爆发前，检测叶片中病原菌的存在及其含量的技术，进而对桑园叶片等进行及时相应的处理。
本发明的第一个目的是提供一种桑脉带相关病毒特异性检测引物，并基于所述检测引物成功建立了检测桑脉带相关病毒的pcr技术。
本发明的另一目的在于提供上述桑脉带相关病毒特异性检测引物在桑脉带相关病毒分子检测中的应用或在制备桑脉带相关病毒分子检测产品方面的应用。
本发明的另一目的在于提供一种桑脉带相关病毒特异性检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供seqidno:3所示桑脉带相关病毒核壳体蛋白基因序列的1s片段在桑脉带相关病毒分子检测中的应用或在制备桑脉带相关病毒分子检测产品方面的应用。
本发明的另一目的在于提供一种阳性对照质粒1s-peasy-bblunt。
本发明的另一目的在于提供上述阳性对照质粒1s-peasy-bblunt在桑脉带相关病毒分子检测中的应用或在制备桑脉带相关病毒分子检测产品方面的应用。
本发明的另一目的在于提供一种桑脉带相关病毒的检测方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种桑脉带相关病毒特异性检测引物，包括引物对s2776f和s3225r，其核苷酸序列分别依次如seqidno:1～2所示。
本发明是在桑脉带相关病毒基因组（km819700.1）的基础上，以核壳体蛋白基因为靶基因，设计了桑脉带相关病毒的特异性检测引物，通过以病叶以及桑树不同组织样本的总dna为模板进行pcr扩增反应，其检测结果可靠、易于操作、简单快速、特异性强、灵敏度高，可用于桑脉带相关病毒的快速检测，在桑脉带相关病毒的实际检测应用中具有广泛的应用价值和意义。
因此，本发明还请求保护上述桑脉带相关病毒特异性检测引物在桑脉带相关病毒分子检测中的应用或在制备桑脉带相关病毒分子检测产品方面的应用。
同时，本发明还请求保护一种桑脉带相关病毒特异性检测试剂盒，所述试剂盒包含上述桑脉带相关病毒特异性检测引物。
优选地，所述试剂盒还包括dna提取所需试剂或pcr扩增反应所需试剂。
本发明还请求保护seqidno:3所示桑脉带相关病毒核壳体蛋白基因序列的1s片段在桑脉带相关病毒分子检测中的应用或在制备桑脉带相关病毒分子检测产品方面的应用。
优选地，所述桑脉带相关病毒分子检测产品包括阳性对照质粒或扩增引物。
本发明还请求保护一种阳性对照质粒1s-peasy-bblunt，包含上述1s片段；所述阳性对照质粒的核苷酸序列如seqidno:6所示。所述1s片段的在质粒中的插入位点为294～1734。具体是设计扩增选择包含核壳体蛋白基因序列的1s片段的引物，包括上游引物1s1809f和下游引物1s3248r，核苷酸序列分别如seqidno:4和seqidno:5所示。利用1s构建1s-peasy-bblunt阳性质粒，用于检测时的阳性对照。
本发明还请求保护上述阳性对照质粒1s-peasy-bblunt在桑脉带相关病毒分子检测中的应用或在制备桑脉带相关病毒分子检测产品方面的应用。
本发明还请求保护一种桑脉带相关病毒的检测方法，包括以下步骤：
s1.提取待测样品的dna；
s2.以步骤s1提取的dna为模板，利用seqidno:1～2所示检测引物，进行pcr扩增反应；
s3.步骤s2反应结束后，凝胶电泳检测扩增产物，以上述阳性对照质粒作为对照，若琼脂糖凝胶上出现特异性450bp大小左右的dna片段产物，则判断样品中存在有桑脉带相关病毒；反之，则无。
优选地，步骤s2所述pcr扩增反应的反应体系为：10μl2×反应缓冲液，0.5μl10μm上游引物s2776f，0.5μl10μm下游引物s3225r，2μl模板dna，ddh2o补足至20μl；其中，2×反应缓冲液的组分为taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm(nh4)2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp。
优选地，步骤s2所述pcr扩增反应的程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
本发明涉及的核壳体蛋白基因的核苷酸序列如seqidno:7所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明人对桑脉带相关病毒核苷酸序列进行分析总结，选择核壳体蛋白基因序列作为检测的靶基因，设计出一组桑脉带相关病毒的特异性检测引物，所述检测引物灵敏、快速、特异性高，可有效地检测桑叶及病树组织中的桑脉带相关病毒，能够准确地判断样品中是否含有桑脉带相关病毒，对该病的预先检测和防治具有实际的指导意义，且可为桑叶的健康生产与资源利用提供保障。
此外，本发明所涉及的引物及相关试剂可组装成试剂盒，使用方便，适用于快速的pcr扩增。
重要的是，本发明的特异性检测引物和试剂盒均能够在病原侵染早期就能够特异性的检测出来，为桑脉带相关病毒的早期检测提供了一种简单快速的方法，具有很好的实际推广应用前景。
附图说明
图1为引物s2776f/s3225r的特异性以及灵敏性实验。其中，m：takaradl500marker；泳道1～12为特异性测试，泳道13～20为灵敏性测试；各泳道dna模板为：1为华南农业大学桑园病桑样品总dna（仅为说明本发明思想使用，并不因此限定本发明范围）；2～5为本实验室真菌病原dna（本领域技术人员可以采用其他常规渠道获得的病原），其中2为桑里白粉病病原-桑球针壳（phyllactinia.moricola）；3为桑菌核病病原菌-肉阜状杯盘菌（ciboria.carunculoides）；4为白僵菌（beauveria.bassiana）；5为疣孢青霉（p.verruculosum）；6为桑青枯病病原菌-茄科劳尔式菌（ralstonia.solanacearum）；7为假单胞菌（pseudomonadaceae）；8为阴沟肠杆菌（ealstonia.cloacae）；9为家蚕微孢子（nosema.bombycis）；10为健康桑叶cdna；11为带有目的片段的1s-peasy-bblunt质粒（阳性对照）；12为水（空白对照）；13～19为梯度稀释的1s-peasy-bblunt质粒，核酸浓度分别如下，13为1×10-1ng/µl；14为1×10-2ng/µl；15为1×10-3ng/µl；16为1×10-4ng/µl；17为1×10-5ng/µl；泳道18为1×10-6ng/µl；19为水（空白对照）。
图2为引物s2776f/s3225r对不同地区花叶状桑叶进行pcr检测。其中，m：takaradl500marker；泳道1为广西柳城样品总cdna；泳道2为海南琼中农户桑地病样品总cdna；泳道3为广东省顺德太子农庄样品总cdna；泳道4为广东连南样品总cdna；泳道5为广东罗定样品总cdna；泳道6为广东茂名样品总cdna；泳道7为广东翁源样品总cdna；泳道8为广东阳江样品总cdna；泳道9为广东阳山样品总cdna；泳道10为重庆西南大学样品总cdna；泳道11为华南农业大学桑园样品总cdna（阴性对照）；泳道12为阳性质粒；泳道13为健康桑叶总cdna（空白对照）；泳道14为水（空白对照）。
图3为引物s2776f/s3225r对华南农业大学桑园中具有花叶病症的病株不同组织部位总dna的检测。其中，m为takaradl500marker；泳道1为顶端叶片总cdna；泳道2为病叶叶柄总cdna；泳道3为侧腋芽总dna；泳道4为枝韧皮组织总dna；泳道5为桑枝形成层总cdna；泳道6为枝木质部总dna；泳道7为健康桑叶总cdna（阴性对照）；泳道8为水（空白对照）。
图4为不同地区病叶照；其中，1为广西柳城桑叶样品；2为海南琼中桑叶样品；3为广东省顺德太子农庄桑叶样品；4为广东连南桑叶样品；5为广东罗定桑叶样品；6为广东茂名桑叶样品；7为广东翁源桑叶样品；8为广东阳江桑叶样品；9为重庆西南大学桑叶样品；10为广东阳山桑叶样品；11和12为华南农业大学桑园桑叶样品。
图5为相同病株不同组织部位的照片；其中，1为顶嫩芽；2为顶端叶片；3为病叶叶柄；4为侧腋芽（未发芽）；5为枝韧皮组织；6为枝木质部。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1检测引物设计及pcr扩增方法的建立
1、引物设计
在获得桑脉带相关病毒全基因组的基础上，设计了多对引物，通过大量的特异性和灵敏性检测，最终选取了2对有代表性的引物组，引物序列如下：
（1）1s1809f/1s3248r引物组
上游引物1s1809f（seqidno:4）：5’-gttcaccacgagtcaatagc-3’
下游引物1s3248r（seqidno:5）：5’-aacgcttcctgagtaaacac-3’
（2）s2776f/s3225r引物组
上游引物s2776f（seqidno:1）：5’-catagcatcagcctcaa-3’
下游引物s3225r（seqidno:2）：5’-catagcatcagcctcaa-3’。
2、pcr扩增方法的建立
以病叶的总dna为模板，用上述2对引物组分别进行pcr扩增。
所述pcr反应体系（总体积20μl）：
2×taqmastermix（反应缓冲液）10μl；
10μm上游引物s2776f0.5μl；
10μm下游引物s3225r0.5μl；
模板dna2μl；
ddh2o补至20μl。
其中，2×taqmastermix（反应缓冲液）的组分为taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm（nh4）2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp。
pcr反应的程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
3、结果判断
第一对引物1s1809f/1s3248r，pcr反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到1440bp大小左右的dna片段，将pcr结果送上海生工生物工程有限公司测序，对比结果与桑脉带相关病毒99%相似，判断为相同病毒。因此根据扩增到1440bp大小左右的dna片段，判定样品中是否含有桑脉带相关病毒存在。
第二对引物s2776f/s3225r：pcr反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到450bp大小左右的dna片段判定样品中是否含有桑脉带相关病毒的存在。
实施例2阳性对照质粒1s-peasy-bblunt的构建
桑脉带相关病毒的核壳体蛋白基因的核苷酸序列如seqidno:7所示，本发明人对桑脉带相关病毒核苷酸序列进行分析总结，设计扩增包含核壳体蛋白基因序列的引物，包括上游引物1s1809f和下游引物1s3248r，pcr扩增条件和程序如实施例1中所示。并进一步构建1s-peasy-bblunt阳性对照质粒，用于检测时的阳性对照，其核苷酸序列如seqidno:6所示。
实施例3引物s2776f/s3225r的特异性检测
1、分别以从桑叶中分离的真菌和细菌，以及同为桑树病原真菌的桑里白粉病病原菌（phyllactiniamoricola）、桑菌核病病原菌（ciboriacarunculoides）、白僵菌（beauveriabassiana）、桑青枯病病原菌-茄科劳尔式菌（ralstoniasolanacearum）作为对照组，利用引物s2776f/s3225r，以实施例1的方法进行pcr扩增，扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。
2、引物的扩增结果分别如附图1所示。结果显示，仅桑病叶总cdna以及质粒在目标位置（450bp）有条带，表明该引物组可以特异性的检测桑脉带相关病毒。
实施例4引物s2776f/s3225r的灵敏性检测
1、获得的1s-peasy-bblunt质粒浓度为10ng/μl，将上述质粒dna用1×te进行稀释，分别以10的倍数稀释。以浓度梯度为1×10-1ng/μl、1×10-2ng/μl、1×10-3ng/μl、1×10-4ng/μl、1×10-5ng/μl、1×10-6ng/μl为实验的dna浓度。
2、以上述各浓度的dna为模板，以引物s2776f/s3225r，以实施例1的方法进行pcr扩增，扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。
3、结果如图1所示，泳道17具有大小在450bp左右的微弱条带，表明引物s2776f/s3225r能检测到1×10-5ng/μl浓度的阳性质粒dna，表明该引物组具有很好的检测灵敏性。
因此，综上所述，从特异性和灵敏性的角度考虑，只有引物s2776f/s3225r既能够特异性的检测桑脉带相关病毒，又具有很好的检测灵敏性。
实施例5对不同地区的桑病叶进行桑脉带相关病毒检测
以下实施例进一步对引物s2776f/s3225r的检测适用性和灵敏性进行测试。
1、材料选定
选择的实验材料包括广西、海南、连南、罗定、茂名、顺德、翁源、阳春、阳山、英德、重庆、华南农业大学桑园等样品，如图4。
2、pcr检测
采用常规方法提取不同材料的dna，以得到的各材料cdna为模板，用特异性引物s2776f/s3225r进行pcr反应。反应体系和条件参照实施例1。
3、反应结果
如图2所示，泳道3顺德样品和泳道10重庆样品在450bp左右有很微弱的目的条带，泳道4连南样品、泳道6茂名样品和泳道9阳山样品在450bp左右有弱的目的条带，泳道1柳城样品、泳道2琼中样品、泳道5罗定样品、泳道7翁源样品、泳道8阳江样品、泳道10阳山样品、泳道11华南农业大学桑叶样品和泳道12质粒均在450bp左右存在强的目的条带，健康的桑叶（泳道13）和空白对照水（泳道14）没有出现条带，获得的序列在ncbi中对比，仅与桑脉带相关病毒相似，相似度高达98%。说明该引物对各地区的桑脉带相关病毒具有特异的检测效果。
实施例6具有桑花叶症状的病桑树不同组织部位的桑脉带相关病毒检测
1、材料的选定
选择的实验材料，华南农业大学桑园中病株的顶嫩芽、桑叶、叶柄、枝侧芽（未发芽）、桑枝韧皮组织、桑枝形成层、桑枝木质部，如图5。
2、pcr检测
采用常规方法提取不同材料的dna，以得到的各材料cdna为模板，用特异性引物s2776f/s3225r进行pcr反应。
4、反应结果
如图3所示，具有桑脉带病症的桑树顶嫩芽、桑叶、叶柄、桑枝韧皮组织中检测到病原存在（泳道1～4），而桑枝形成层、桑枝木质部中未检测到病原存在（泳道5～6），而用作对照的新鲜桑叶（泳道7）则未检测出病原存在，证明具有桑脉带症状的病株的顶嫩芽、桑叶、叶柄、桑枝韧皮组织上存在有病原。虽然病原没有病叶密集但存在，因此可以猜测病原在桑叶中大量繁殖，也可以由韧皮部的输导组织运送到树的各个组织。虽然在这些部位病原数量较少，但仍能检测到病原存在，说明该引物可用于病害诊断。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110>华南农业大学
<120>桑脉带相关病毒检测引物和质粒及检测方法
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>17
<212>dna
<213>桑脉带相关病毒(mulberryveinbanding-associatedvirus)
<400>1
catagcatcagcctcaa17
<210>2
<211>17
<212>dna
<213>桑脉带相关病毒(mulberryveinbanding-associatedvirus)
<400>2
gtctaccgtccgtcagc17
<210>3
<211>1441
<212>dna
<213>桑脉带相关病毒(mulberryveinbanding-associatedvirus)
<400>3
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t1441
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