一种检测细菌AmpC基因的引物组、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及病原微生物检测领域，具体而言，涉及一种检测细菌ampc基因的引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

ampc酶存在于大多数革兰氏阴性杆菌中，是导致革兰氏阴性杆菌对广谱β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。按传播的介导方式可以分为质粒介导传播和染色体介导传播两种。质粒介导ampc酶危害严重，这是因为一种质粒可同时携带多个耐药基因，使得产ampc酶的菌株表现出多重耐药性，而且耐药谱呈现扩大趋势。另一方面，质粒的可传递性，不仅可发生在同菌种之间，还可以发生在不同菌种之间，从而导致耐药菌株更为广泛传播，严重了阻碍了临床治疗。

从1989年bauerfeind等报道质粒介导ampc酶(cmy-1)以来，很多质粒ampc酶在世界各地陆续被报道，目前已发现的多达两百多种。对报道的质粒ampc基因进行dna序列分析，并与某些种属的染色体ampc基因进行同源性比较，可将质粒介导ampc基因分为6个群：acc,fox,mox,dha,cit和ebc。

至今，美国临床实验室标准化委员会(nccls)还没有推荐检测ampc酶的标准方法，如何快速、准确的检测质粒介导ampc酶是临床实验室面临的一个普遍难题。perez-perez等根据ampc基因的同源性，针对6群设计了6组特异性引物，多重pcr几乎能扩增出所有的质粒ampc基因，并通过测序确定基因型和发现新基因型。该多重pcr方法随后被很多研究采纳，近乎作为一种“金标准”被广泛用于质粒ampc基因型别的检测。但该方法只覆盖了当时发现的29种基因型，对于后来新发现的众多基因型，该方法则无法检出。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种检测细菌ampc基因的引物组，所述引物组至少包含两种ampc基因acc,fox,mox,cit,dha和ebc的引物，结合多重pcr技术，解决现有技术中ampc基因型检测不足的问题，检测范围广、特异性高，能简便、快速检测细菌ampc基因。

本发明的第二目的在于提供一种检测细菌ampc基因的试剂盒，其包括如上所述的引物组和辅助检测试剂，具有包装良好、使用方便的优点。

本发明的第三目的在于提供一种非诊断目的的细菌ampc基因的检测方法，其使用所述引物组或试剂盒对待检测细菌样本的总dna或质粒dna进行扩增，通过检测扩增产物中ampc基因是否存在以确定所述检测细菌样本的ampc酶，能够对细菌中的多种ampc基因同时进行检测，该方法检测范围广、特异性好、灵敏度高，适合大规模样本检测中推广应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种检测细菌ampc基因的引物组，所述引物组选自下列引物对中的至少两种；

一种检测细菌ampc基因的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和辅助检测试剂。

利用上述的引物组或试剂盒进行非诊断目的的细菌ampc基因检测的方法，包括：使用所述引物组或试剂盒对待检测细菌样本的总dna或质粒dna进行扩增，通过检测扩增产物中ampc基因是否存在以确定所述检测细菌样本的ampc酶。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明针对近来发现的且目前已报道的ampc基因设计6组特异性扩增引物可以有效地扩增acc,fox,mox,dha,cit和ebc型，从而建立起一种简便、快速检测细菌ampc基因的方法。

(2)本发明能够更加方便快速地从临床细菌标本中检测ampc基因型(acc,fox,mox,cit,dha和ebc)，通过6对特异性引物和一个pcr反应即可得到全部基因型结果，并且与单一基因pcr结果相比，准确率、特异性和灵敏性可达100％，因此提高了检测效果和准确性。检测范围广、特异性好、灵敏度高，适合大规模样本检测中推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为一个实施方式中的ampc基因型acc,fox,mox,cit,dha和ebc多重pcr电泳结果图，其中1和6是空白对照，2～5为acc,fox,mox,cit,dha和ebc多重基因pcr扩增结果；

图2为一个实施方式中的含ampc基因cmy-2和dha的临床分离株和不含ampc酶耐药基因的临床分离株的多重pcr电泳结果图，其中1为阴性对照，2和3为cmy-2基因pcr扩增结果，4和5为dha基因pcr扩增结果，6～8为不含ampc基因的临床分离株dnapcr扩增结果；

图3为一个实施方式中的构建好的含有细菌ampc基因acc,fox,mox,cit,dha和ebc全长puc57质粒的不同稀释倍数的多重pcr电泳结果图，其中1为阴性对照，2～11为含有细菌ampc酶耐药基因acc,fox,mox,cit,dha和ebc的puc57质粒混合物，浓度依次为2和3为1.0×10⁶拷贝/μl、4和5为1.0×10⁵拷贝/μl、6和7为1.0×10⁴拷贝/μl、8和9为1.0×10³拷贝/μl、10和11为1.0×10²拷贝/μl。

具体实施方式

一种检测细菌ampc基因的引物组，所述引物组选自下列引物对中的至少两种；

本发明针对新发现的且目前已报道的ampc基因设计6组特异性扩增引物可以有效地扩增acc,fox,mox,dha,cit和ebc型，从而建立起一种简便、快速检测细菌ampc基因的方法。

所述引物组可以根据本领域的现有技术合成，也可以委托专业的公司制备。

引物组可以将seqidno：1-12所示的核苷酸分别储存于不同的容器，例如ep管中，也可以将每对引物对中的正向引物和反向引物混合存放。

一种检测细菌ampc基因的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和辅助检测试剂。

在一些实施方式中，所述辅助检测试剂包括pcr缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、dna聚合酶、水、阳性对照、阴性对照和dna分子量内标中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述pcr缓冲液的主要成分包括tris-hcl、kcl和mgcl2的一种或多种。

pcr缓冲液可为10×pcr缓冲液，10×pcr缓冲液包括100mmtris-hcl(ph8.3)，500mmkcl，15mmmgcl2的一种或多种。

优选地，脱氧核糖核苷三磷酸混合物中dgtp、dctp、datp、dttp的浓度均为25mm，在pcr反应体系中dgtp、dctp、datp、dttp的最终浓度均为0.2mm。

在一些实施方式中，所述dna聚合酶选自taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4dna聚合酶、klenow片段。

优选地，所述dna聚合酶为taqdna聚合酶。

taqdna聚合酶的浓度为5u/μl,在pcr反应体系中taqdna聚合酶的最终浓度为0.025u/μl。

在一些实施方式中，所述阳性对照为含有所述细菌ampc基因cit、acc、fox、mox、dha和ebc全长的一种或多种的puc57质粒。

阳性对照为一定含有待检测基因的质粒，根据待检测基因的种类使用相应的阳性对照。

在一些实施方式中，所述阴性对照为超纯水。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括dna提取试剂、核酸纯化试剂的一种或两种。

dna提取试剂包括水煮法、机械法、溶解酶法、玻璃珠法或sds苯酚法所需的试剂。核酸纯化试剂为磁珠法或乙醇法所需的试剂。

利用上述引物组或试剂盒进行非诊断目的的细菌ampc基因检测的方法，包括：使用所述引物组或试剂盒对待检测细菌样本的总dna或质粒dna进行扩增，通过检测扩增产物中ampc基因是否存在以确定所述检测细菌样本的ampc酶。

优选地，在进行所述扩增时，扩增体系中所述基因dha和ebc的各引物浓度为0.15～0.25mmol/l；更优选为0.20mmol/l；

所述基因cit、acc、fox和mox的各引物浓度为0.35～0.45mmol/l；更优选为0.40mmol/l；

优选地，在进行所述扩增时，退火温度为60～69℃；更优选为65℃；

优选地，所述总dna或质粒dna的提取方法包括水煮法、机械法、溶解酶法、玻璃珠法或sds苯酚法的一种。多重pcr扩增检测ampc基因acc,fox,mox,cit,dha和ebc，反应体系中，细菌dna的质量在1～100ng；dha和ebc的各引物浓度为0.15～0.25mmol/l；更优选为0.20mmol/l；cit、acc、fox和mox的各引物浓度为0.35～0.45mmol/l；更优选为0.40mmol/l；taqdna聚合酶的最终浓度为0.025u/μl，其余按常规操作加入，总体积为25μl。

在一些实施方式中，pcr反应循环参数如下：95℃预变性1min，95℃变性30s，65℃退火延伸1min，30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

在一些实施方式中，基因检测结果鉴定方法包括：配置含gelred(50ml琼脂糖溶液中加入5μlgelred10000×储备液)的3％琼脂糖凝胶。取6μlpcr产物与1.5μl加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入dna分子量标准，接通电源在2v/cm～5v/cm恒压条件下电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，在紫外光下观察。

非诊断目的的细菌ampc基因检测的方法，包括评估医院的耐药细菌分布情况，做流行病学分析等。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

(1)特异性引物的设计

根据细菌ampc基因acc(genbank登录号：j133121)、ebc(genbank登录号：m37839)、cit(genbank登录号：hm565135)、dha(genbank登录号：jx495964)、mox(genbank登录号：d13304)和fox(genbank登录号：x77455)的特异性设计6对特异性引物，序列分别如下：

cit上游引物：5’-tcagcctgctgcacttagccac-3’(seqidno.1)；

cit下游引物：5’-gtggatcccgttttatgcaccc-3’(seqidno.2)；

acc上游引物：5’-gaatatggagattttgggtaacgaagc-3’(seqidno.3)；

acc下游引物：5’-cgttagttgatccggtcttattaatcc-3’(seqidno.4)；

fox上游引物：5’-ccaacatggggtatcagggagat-3’(seqidno.5)；

fox下游引物：5’-ccagtcgagcccgtcttgttatag-3’(seqidno.6)；

mox上游引物：5’-gattactcggtaggcgggatgac-3’(seqidno.7)；

mox下游引物：5’-ggtcgagccggtcttgttgaag-3’(seqidno.8)；

dha上游引物：5’-tgcgtctgtatgcaaacagcagt-3’(seqidno.9)；

dha下游引物：5’-tgcgcccgttttatgcaccc-3’(seqidno.10)；

ebc上游引物：5’-gctggaccatacctggattaacg-3’(seqidno.11)；

ebc下游引物：5’-cgtcgagcctgttttatggaccc-3’(seqidno.12)。

(2)提取模板dna

采用水煮法提取细菌基因组dna。

(3)阴性对照的设置

阴性对照为超纯水。

(4)多重pcr反应体系

25μl反应体系含有：10×pcr反应缓冲液2.5μl，cit、acc、fox、mox上下游引物终浓度各为0.4mmol/l，dha和ebc上下游引物终浓度为0.2mmol/l，dna聚合酶0.625u，dntp混合液(各2.5mm)2μl，待检dna，用灭菌去离子水补充到25μl。

(5)多重pcr反应条件

95℃预变性1min，95℃变性30s，65℃退火延伸1min，30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

(6)电泳检测

取6μlpcr产物与1.5μl加样缓冲液混匀后，点样于3％琼脂糖凝胶电泳板孔中，2v/cm～5v/cm恒压条件下电泳，于凝胶成像系统拍照判定。

实验例1

多重pcr检测结果。

按照实施例1的方案进行实验，每个样品均得到六条待检测基因的条带，多重pcr成功同时扩增出acc(326bp),fox(247bp),mox(174bp),cit(646bp),dha(512bp)和ebc(409bp)，说明本方案引物组构建成功，方法设置合理(实验结果见图1)。

实验例2

特异性实验。

利用实施例1的方法分别对经鉴定含ampc基因cmy-2(属cit型)和dha的临床分离株和不含ampc基因的临床分离株进行检测，超纯水为阴性对照。

检测结果见图2。结果表明，仅含有ampc基因管为阳性，其余管均为阴性。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地将细菌ampc基因与其他非细菌ampc基因区分开来。

实验例3

灵敏度实验。

取阳性对照品(即构建好的含有细菌ampc基因(acc(genbank登录号：j133121)、ebc(genbank登录号：m37839)、cit(genbank登录号：hm565135)、dha(genbank登录号：jx495964)、mox(genbank登录号：d13304)和fox(genbank登录号：x77455)全长的puc57质粒)，测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0×10²～1.0×10⁶拷贝/μl的浓度作为样品，用本发明的试剂盒和检测方法。

检测结果如图3所示。结果表明，本试剂盒对ampc基因acc,fox,mox,cit,dha和ebc的最低检出限为：1.0×10³拷贝/μl。

以上结果表明，本发明的引物组、试剂盒及方法具有准确性好、灵敏度高的特点。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>江苏省家禽科学研究所

<120>一种检测细菌ampc基因的引物组、试剂盒及方法

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