一种多因素协同进化提高隐甲藻DHA产量的方法与流程

本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种高产二十二碳六烯酸(dha)的优选藻株的获得方法及应用。

背景技术：

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，简称dha)，是一种无色至淡黄色油状液体，是人体所必需的一种多不饱和脂肪酸。dha是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20％，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50％，因此，对胎婴儿智力和视力发育至关重要。此外也有研究指出dha对各种心脑血管疾病有非常好的预防和治疗的功效。

截止目前为止，市售的dha的主要来源是深海鱼油的提取，但这一来源存在许多缺陷。比如海洋污染造成有毒物质在深海鱼体内的积累进而污染鱼油。鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同。含鱼油中的另外一种不饱和脂肪酸epa与dha的结构非常相似，导致dha后期纯化成本高。此外，由于epa会影响婴儿发育，鱼油来源的dha作为奶粉添加剂的应用受到一些限制。世界渔业资源的逐年萎缩对dha的可持续性供应的影响也值得考虑。

利用隐甲藻(crypthecodiniumcohnii)发酵生产dha，与传统鱼油来源相比，具有一系列优点，如培养方式简单，微生物生长快，发酵周期短，易于大规模培养。多不饱和脂肪酸含量高约占细胞干重的40％-50％，产品质量稳定，氧化稳定性较好，不饱和脂肪酸成分单一，不含epa，易于分离纯化。同时从藻类提取dha克服了传统的从鱼油中获取dha受原料、气候、产地、生产周期等诸多限制因素的影响。因此微生物发酵生产dha可替代鱼油来源的dha，具有广泛的应用前景。

目前，实际隐甲藻发酵过程中生产应用的隐甲藻藻种多数是直接从自然界中分离得到的，性状较为单一，在发酵过程中藻种的性状很容易发生退化。因此，利用有效的技术手段对隐甲藻进行改造，获得高产且遗传稳定的优良菌种对促进隐甲藻生产dha产业的可持续发展是十分重要的。

定向进化是在试管中模拟达尔文进化过程,通过随机突变和重组,人为制造大量的突变,按照特定的需要和目的给予选择压力,筛选出具有期望特征的微生物,实现分子水平的模拟进化，这是目前改善工业微生物性能最有前途的方法。定向进化的发展拓宽了分子育种的设计范围，可在微生物菌种基因组背景信息不清晰的情况下对菌种进行改造。

本发明发现利用特定的蛋白酶抑制剂提供选择压力，经过压力条件下连续传代筛选可以富集有益突变进而得到性状优良的隐甲藻菌株。

乙酰辅酶a羧化酶是催化乙酰辅酶a生成丙二酰辅酶a的关键酶，也是脂肪酸合成反应中的第一步限速酶。烯禾啶作为一种有效的乙酰辅酶a抑制剂可以通过抑制隐甲藻的脂肪酸合成而导致细胞生长缓慢甚至死亡。本发明发现通过烯禾啶提供筛选压力的定向进化可以有效地提高隐甲藻包内乙酰辅酶a羧化酶的表达量进而提高dha的产量。

芝麻酚作为一种抗氧化剂可以提高隐甲藻细胞的生长。芝麻酚同时也是苹果酸酶的抑制剂。因此，添加芝麻酚也会造成脂肪酸合成受阻而抑制隐甲藻细胞的生长。本发明发现通过芝麻酚提供筛选压力的定向进化可以有效地解除隐甲藻苹果酸酶对芝麻酚的敏感性。因此可以再隐甲藻培养过程中添加一定浓度的芝麻酚促进细胞的生长，同时规避芝麻酚对油脂积累的副作用，进而进一步提高dha的产率。

总之，利用这两种选择压力(包括但不限定于这两种抑制剂)对隐甲藻进行人工的定向进化，可以有效地提高隐甲藻dha的产率。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高隐甲藻dha生产速率的方法。

本发明公布了一种多因素协同进化获得高产二十二碳六烯酸隐甲藻atcc30556突变菌株的方法。具体操作包括：

1.配置烯禾啶梯度浓度的c9n2固体平板培养基(5μm–20μm)。

2.选择od490nm为0.8的新鲜细胞50μl均匀涂布在抗性平板上，倒置培养约2周时间观察生长，确定驯化的初始浓度。

3.以c9n2培养基作为连续传代的培养基，其中烯禾啶的初始浓度为10μm，接入1ml的od490nm为0.8的新鲜野生型细胞，培养至对数期。

4.将上一步得到的菌株转入新鲜的含有相同浓度烯禾啶的c9n2中，培养至对数中期并继续传代，直至隐甲藻细胞对10μm的烯禾啶不再敏感。

5.以上一步得到的菌株按照相同的接种量接入含有20μm烯禾啶的新鲜c9n2培养基中，培养至对数中期，并继续传代，直至隐甲藻细胞对20μm的烯禾啶不再敏感。

6.重复以上操作，经过连续传代，直至烯禾啶的浓度稳定在60μm。

7.隐甲藻突变株和野生株之间生长速率和dha积累的比较：将所得隐甲藻突变株与野生株接入c27n6培养基中培养，鉴定突变株生长速率与dha积累的变化关系。

8.选择od490nm为0.8的新鲜细胞，按1％的接种量接入新鲜的c9n2培养基中，同时添加不同浓度的芝麻酚，分析芝麻酚对隐甲藻细胞的致死率，确定芝麻酚驯化的初始浓度。

9.以第一轮驯化得到的菌株为出发菌株，进行第二轮定向驯化，其中保持烯禾啶的浓度稳定在60μm，同时添加0.25mm的芝麻酚作为抑制剂，经过连续传代直至隐甲藻细胞对此浓度的芝麻酚不敏感。

10.以上一步得到的菌株按照相同的接种量接入含有0.5mm芝麻酚的新鲜c9n2培养基中，培养至对数中期，并继续传代，直至隐甲藻细胞对0.5mm的芝麻酚不再敏感。

11.重复以上操作，经过连续传代，直至芝麻酚的浓度稳定在2mm。

12.将第二轮驯化得到的菌株和野生型菌株接入c27n6培养中，其中第二轮驯化菌株培养液中加入1mm芝麻酚，鉴定突变株的生物量和油脂积累的变化。

所述菌种为隐甲藻；所述抑制剂和烯禾啶和芝麻酚；驯化过程中使用的培养均为c9n2培养基。

所述步骤1所述c9n2培养基是由葡萄糖9g,酵母浸粉2g，海盐25g，琼脂1.5g，加水至1l而成，ph为6.5；

所述步骤3所述c9n2培养基是由葡萄糖9g,酵母浸粉2g，海盐25g，加水至1l而成，ph为6.5；

所述步骤3，4，5，6中烯禾啶的使用浓度为10-500μm；摇床设置参数为20-200rpm，温度为4-40℃；

所述步骤9，10，11中芝麻酚的使用浓度为0.25-10mm；摇床设置参数为20-200rpm，温度为4-40℃；

所述步骤3所述c27n6培养基是由葡萄糖27g,酵母浸粉6g，海盐25g，加水至1l而成，ph为6.5。

本发明所述的利用特定蛋白的抑制剂提供选择压力对隐甲藻细胞进行定向驯化，即使用烯禾啶和芝麻酚进行驯化。其中烯禾啶的浓度从10μm到60μm，芝麻酚的浓度为0.5mm到2.0mm。

所述第一轮定向驯化即在c9n2培养基中加入烯禾啶抑制剂，按照1％的接种量接入出发菌株，正常培养条件下培养至平台期。由于烯禾啶对细胞的毒性作用，培养至平台期的时间会比正常培养的出发菌株要延迟。以此生长状态作为依据，以此连续传代，直至菌株对一定浓度的抑制剂不敏感，即在含有烯禾啶的培养基中能正常生长。

所述第二轮驯化即在第一轮驯化结束之后，以第一轮驯化的菌株为出发菌株进行的。同样以芝麻酚作为选择压力，以连续传代的方式解除隐甲藻细胞对芝麻酚的毒性作用。

隐甲藻突变菌株生长特性分析，所得到的隐甲藻突变体在c9n2培养基中培养。接种时选择od490nm为0.8的新鲜细胞5ml加入到50ml的新鲜c27n6培养基中，每组做三个平行，每12小时测量一下吸光值，绘制柱状图。

最终，通过本发明的方法获得的突变菌株，在培养过程中添加1mm芝麻酚可以将dha的产率提高130％。

附图说明

图1隐甲藻atcc30556细胞对不同浓度烯禾啶的敏感性验证.

图2隐甲藻atcc30556细胞对不同浓度芝麻酚的敏感性验证.

图3隐甲藻出发菌株和第一轮驯化得到的突变菌株的dha产率对比图(其中，相比于野生型菌株，第一轮驯化得到的突变株的dha的产率提高了100％).

图4第二轮驯化之后突变体添加芝麻酚的生长对比图其中培养基为c27n6：葡萄糖27g，酵母浸粉6g，海盐25g加水至1l而成，ph为6.5(其中，添加芝麻酚使细胞最终生物量提高了约30％).

图5隐甲藻出发菌株和第二轮驯化得到的突变菌株添加芝麻酚发酵的dha产率对比图(其中，第二轮驯化的突变菌株在发酵过程中添加1mm芝麻酚，dha的产率较野生型提高了130％).

具体实施方式

下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明但并不用于限制本发明。

下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1

利用烯禾啶提供选择压力进行第一轮定向驯化

1.配置烯禾啶梯度浓度的c9n2固体平板培养基(5μm-20μm)。

2.选择od490nm为0.8的新鲜细胞50μl均匀涂布在抗性平板上，倒置培养约2周时间观察生长，确定驯化的初始浓度。

3.以c9n2培养基作为连续传代的培养基，其中烯禾啶的初始浓度为10μm，接入1ml的od490nm为0.8的新鲜野生型细胞，培养至对数期。

4.将上一步得到的菌株转入新鲜的含有相同浓度烯禾啶的c9n2中，培养至对数中期并继续传代，直至隐甲藻细胞对10μm的烯禾啶不再敏感。

5.以上一步得到的菌株按照相同的接种量接入含有20μm烯禾啶的新鲜c9n2培养基中，培养至对数中期，并继续传代，直至隐甲藻细胞对20μm的烯禾啶不再敏感。

6.重复以上操作，经过连续传代，直至烯禾啶的浓度稳定在60μm。

7.隐甲藻突变株生长特性的分析，所得隐甲藻突变株在c27n6培养基中培养。摇床设置参数为转速100-200rpm，温度为24-28℃。步骤为选择od490nm为0.8的新鲜细胞5ml加入到50ml的新鲜c27n6培养基中，每组做三个平行，每24小时测量一下吸光值，绘制柱状图。

8.隐甲藻突变菌株dha含量的分析，所得隐甲藻突变株在c27n6培养基中培养。摇床设置参数为转速100-200rpm，温度为24-28℃。步骤为选择od490nm为0.8的新鲜细胞5ml加入到50ml的新鲜c27n6培养基中。108h之后离心收集菌体冷冻干燥之后，用氯仿抽提油脂，甲酯化之后上gc-ms检测。

实施例2

本实施例与实施例1基本相同，只是使用的初始菌株为实施例1所得到的突变菌株，利用芝麻酚提供选择压力进行第二轮定向驯化。

经过上述两个实施例，得到的双驯化菌株对芝麻酚脱敏。以此，在双驯化菌株发酵过程中通过添加1mm芝麻酚,其dha的产率较野生型提高了约130％。